低溫沙藏及外源激素添加對唐古特瑞香種子萌發(fā)及生理生化的影響

賈襲偉，久西加，郭曉霞，徐寵然，馬 瀟，曾翠云， ，陳紅剛， ，杜 弢，?

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730070； 3.西北中藏藥協(xié)同創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730000）

唐古特瑞香DaphnetanguticaMaxim.來源于瑞香科瑞香屬，又稱陜甘瑞香、甘肅瑞香、甘青瑞香、冬青草等，藏藥稱“省相那瑪”，是中藥祖師麻的基原植物之一［1］，主要分布于我國西北、西南等海拔2 700 ～3 100 m 的高山林下、林緣及灌木叢中，其根皮和莖皮入藥，具有祛風(fēng)除濕、散寒止痛、活血散瘀功效［2］。唐古特瑞香作為常綠灌木，具有較高的生態(tài)價(jià)值和觀賞價(jià)值［3］，但其種子存在休眠期長、發(fā)芽率低、種群開拓性差等問題，資源再生困難，且野生資源過度采挖，難以滿足市場需求［4］。人工栽培可能是緩解資源短缺的主要手段，因此開展唐古特瑞香種子休眠研究具有重要的實(shí)際意義和應(yīng)用價(jià)值。

種子休眠是植物維持生存或適應(yīng)環(huán)境變化的重要特性，有利于種子順利度過逆境，在環(huán)境適宜的時(shí)候生根發(fā)芽，繁衍后代［5-6］。Baskin 把種子休眠主要分為生理休眠、物理休眠、形態(tài)休眠、形態(tài)生理休眠及復(fù)合休眠5 大類型［7］。目前唐古特瑞香種子休眠類型及原因仍不明確，相關(guān)研究報(bào)道較少，趙潔等［8］考察變溫沙藏和不同濃度赤霉素對唐古特瑞香種子萌發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)相比自然條件下，發(fā)芽率小幅提高，但種子基礎(chǔ)生物學(xué)指標(biāo)、休眠原因、休眠類型及沙藏過程中種子內(nèi)部生理生化特性未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以當(dāng)年采收的唐古特瑞香種子為研究對象，通過種子吸水、種皮硬度測定、沙藏、外源激素浸種、種子發(fā)芽等試驗(yàn)，探究唐古特瑞香種子休眠破除方法，為唐古特瑞香育苗技術(shù)的制定提供參考。

1 材料

1.1 藥物 唐古特瑞香種子于2020 年購買于武威泰康制藥有限公司，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院杜弢教授鑒定為唐古特瑞香DaphnetanguticaMaxim.的種子。

1.2 試劑 6-芐氨基腺嘌呤（批號(hào)CB291530100）、赤霉素（批號(hào)616H022） 均購自南京吉特恩生物科技有限公司；蛋白定量測定試劑盒（批號(hào)A045-2-2）、植物可溶性糖檢測試劑盒（批號(hào)A145-1-1）、植物淀粉含量測試盒（批號(hào)A148-1-1） 均購自南京建成生物工程研究所； IAA （批號(hào)QC7898）、GA （批號(hào) QC5680）、ABA （批號(hào) QC4585）ELISA 檢測試劑盒均購自上海欽誠生物科技有限公司。

1.3 儀器 BSA224S-CW 電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）； GTOP-500 Y 智能光照恒溫培養(yǎng)箱（浙江托普儀器有限公司）； Leica-CM 1950 冷凍切片機(jī)［徠卡顯微系統(tǒng)（上海） 貿(mào)易有限公司］； 543OR 超速冷凍離心機(jī)（常州金壇良友儀器有限公司）； Vortex-Genie 2T 漩渦混合離心機(jī)（北京海天友誠科技有限公司）； T6 新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）； THZ-82 氣浴恒溫震蕩箱（常州金壇恒豐儀器制造有限公司）；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 除去瑞香種子殘留果皮，水沉去除漂浮在水面上的癟子，剩余種子置陰涼處晾干，室溫條件下貯存?zhèn)溆谩Ｌ暨x飽滿、無霉變、完整無機(jī)械損傷的種子裝入尼龍網(wǎng)袋中，分層儲(chǔ)藏于含水量為20%的濕沙盒內(nèi)，沙盒置于4 ℃冰箱中，沙藏周期為120 d，每20 d 取樣1 次，測定內(nèi)含物、內(nèi)源激素含量。基于前期發(fā)芽預(yù)實(shí)驗(yàn)的條件選擇，同時(shí)將各沙藏階段的種子分別以6-芐氨基嘌呤（6-BA，20 mg/L）、赤霉素（GA，300 mg/L）、蒸餾水 （CK） 浸種24 h后于25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行暗培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率、發(fā)芽時(shí)滯天數(shù)等指標(biāo)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2.2 研究方法

2.2.1 唐古特瑞香種子千粒重測定 參照GB/T3543 標(biāo)準(zhǔn)對唐古特瑞香種子的千粒重進(jìn)行測定［9］。

2.2.2 唐古特瑞香種子吸水率測定 隨機(jī)稱取風(fēng)干的唐古特瑞香種子1.0 g，浸泡于蒸餾水中，分別在2、4、6、8、10、12 h 取出，用濾紙吸干種子表面水分，精密稱定（0.000 1 g），重復(fù)3 次［10-11］，直至種子質(zhì)量變化范圍在0.005 g 內(nèi)時(shí)結(jié)束測定，計(jì)算種子吸水率。公式為吸水率＝（Wt－W） /W×100%，式中Wt 為種子吸水后重量，W為種子干重。

2.2.3 唐古特瑞香種皮硬度測定 隨機(jī)取唐古特瑞香種子3 份，每份30 粒，于谷物種皮硬度測定儀中測定，計(jì)算平均值［12］。

2.2.4 發(fā)芽指標(biāo)測定 定期取不同沙藏階段的唐古特瑞香種子各450 粒，用2%次氯酸鈉溶液浸泡消毒15 min，隨后蒸餾水沖洗30 min 用以發(fā)芽試驗(yàn)，分別以300 mg/L GA 和20 mg/L 6-BA 浸種處理24 h，以蒸餾水浸種處理24 h 為對照（CK），最后播于紙床上，每皿播種50 粒，重復(fù)3 次，在25 ℃恒溫暗處培養(yǎng)，及時(shí)補(bǔ)足水分，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽種子數(shù)，計(jì)算發(fā)芽率，公式為發(fā)芽率＝發(fā)芽種子粒數(shù)/總種子粒數(shù)×100%。發(fā)芽時(shí)滯天數(shù)自種子播于紙床上開始計(jì)算，持續(xù)到第一粒種子發(fā)芽所需時(shí)間。

2.2.5 生化指標(biāo)測定 在低溫沙藏期間，定期取種子，經(jīng)液氮冷凍后，貯存于－80 ℃冰箱中。使用酶標(biāo)儀，通過考馬斯亮藍(lán)法測定可溶性蛋白； 蒽酮比色法測定可溶性糖；酸水解法和蒽酮比色法測定淀粉； 酶聯(lián)免疫分析方法（ELISA） 測定樣品中赤霉素（GA）、生長素（IAA） 及脫落酸（ABA） 等內(nèi)源激素含量，具體方法參照各試劑盒說明書［13-14］。

2.3 數(shù)據(jù)分析 使用Microsoft Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄并整理，采用SPSS 19.0 軟件對試驗(yàn)中各測定指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，運(yùn)用軟件Origin 2019 軟件制圖，圖中的結(jié)果均以（±SE） 表示。

2.4 結(jié)果分析

2.4.1 唐古特瑞香種子形態(tài)、千粒重、種皮硬度及吸水率變化 唐古特瑞香種子發(fā)芽圖見圖1A。唐古特瑞香果實(shí)脫去果肉后其種子外種皮呈黑褐色，外形圓潤飽滿，為雙子葉無胚乳種子，種胚形態(tài)健全，見圖1B。當(dāng)年采收的唐古特瑞香種子千粒重59.40 g，種殼硬度3.66 kgf，未除去外種皮的種子22 h 可吸水飽和。

圖1 唐古特瑞香種子發(fā)芽（A） 和形態(tài)特征圖（B）

2.4.2 不同沙藏時(shí)間對唐古特瑞香種子發(fā)芽時(shí)滯天數(shù)的影響 隨著沙藏時(shí)間延長，唐古特瑞香種子在各個(gè)沙藏階段發(fā)芽時(shí)滯天數(shù)逐漸縮短，未沙藏種子發(fā)芽時(shí)滯天數(shù)為24 d；沙藏20 d 后，發(fā)芽時(shí)滯天數(shù)縮短為10 d； 沙藏60 d 后，各階段種子發(fā)芽時(shí)滯天數(shù)趨于穩(wěn)定，縮短為4 d，見圖2。

圖2 沙藏時(shí)間對種子發(fā)芽時(shí)滯天數(shù)的影響

2.4.3 不同浸種處理對各階段沙藏種子發(fā)芽率的影響 圖3 表明，隨著沙藏時(shí)間的延長，外源激素對種子萌發(fā)影響顯著，20 mg/L 6-BA 浸種處理在沙藏60 d 時(shí)發(fā)芽率最高，為21.33%； 300 mg/L GA 浸種處理在沙藏80 d 時(shí)發(fā)芽率最高，為17.33%； 而清水浸種（CK） 在各沙藏階段中發(fā)芽率均不足5%。綜上所述，沙藏60 ～80 d 最有利于種子萌發(fā)，但必須結(jié)合外源激素浸種手段以提高發(fā)芽率，單純延長沙藏時(shí)間或施以外源激素浸種處理并不能有效打破唐古特瑞香種子的休眠。

圖3 不同浸種處理對沙藏種子發(fā)芽率的影響

2.4.4 不同沙藏時(shí)間對唐古特瑞香種子內(nèi)含物含量的影響

2.4.4.1 對可溶性蛋白質(zhì)含量的影響 由圖4 可知，沙藏初期可溶性蛋白含量下降平緩，其含量在60 d 時(shí)出現(xiàn)最小值11.237 mg/g，60 d 后又平緩上升，總體呈下降趨勢。隨著沙藏時(shí)間的持續(xù)延長，除60 d 時(shí)可溶性蛋白含量顯著低于其他階段外，其他沙藏階段可溶性蛋白含量差異不顯著。可溶性蛋白質(zhì)主要參與各種酶蛋白的代謝或作為基礎(chǔ)供能物質(zhì)被消耗，經(jīng)過一系列的生理活動(dòng)最終降解為氨基酸，為種子休眠的解除和萌發(fā)提供足夠的氮源，其含量變化可以間接反映種子內(nèi)部生命活動(dòng)代謝的強(qiáng)弱［15］。

圖4 沙藏時(shí)間對唐古特瑞香種子可溶性蛋白含量的影響

2.4.4.2 對淀粉含量的影響 由圖5 可知，隨著沙藏時(shí)間的延長，唐古特瑞香種子淀粉含量總體呈下降趨勢，其中沙藏20～40 d 時(shí)，淀粉含量下降迅速，40 d 后下降較為平緩，120 d 出現(xiàn)最小值為1.274 mg/g。未沙藏種子可溶性淀粉含量顯著高于各階段沙藏處理，說明在沙藏過程中，呼吸作用使種子內(nèi)部的儲(chǔ)能物質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)變，淀粉逐漸分解，轉(zhuǎn)化成可溶性糖等，供應(yīng)種子正常的生理代謝消耗，為種子萌發(fā)做前期準(zhǔn)備［16］。

圖5 沙藏時(shí)間對唐古特瑞香種子可溶性淀粉含量的影響

2.4.4.3 對可溶性糖含量的影響 由圖6 可知，沙藏時(shí)間在20～60 d 期間，可溶性糖含量呈下降趨勢，60 d 達(dá)到最小值9.331 mg/g，其中20～40 d 可溶性糖含量下降最為迅速，60～100 d 可溶性糖含量有所升高，在100 d 時(shí)達(dá)到峰值，120 d 時(shí)含量又有所下降，在整個(gè)沙藏過程中種子可溶性糖含量總體呈下降趨勢。縱觀整個(gè)沙藏過程種子中可溶性糖含量變化曲線，20 ～60 d 可能是由于此時(shí)種子內(nèi)部生理代謝活動(dòng)旺盛，大量消耗了子葉中貯藏的可溶性糖，在60～100 d 種子中可溶性糖含量增加，當(dāng)達(dá)到100 d 時(shí)其含量顯著高于60 d，從沙藏60 d 開始，唐古特瑞香種子內(nèi)部可溶性糖消耗速率減緩，可能因淀粉分解使得可溶性糖含量有所升高，種子內(nèi)部代謝活動(dòng)發(fā)生變化。

圖6 沙藏時(shí)間對唐古特瑞香種子可溶性糖含量的影響

2.4.5 不同沙藏時(shí)間對唐古特瑞香種子內(nèi)源激素含量的影響

2.4.5.1 對IAA 含量的影響 如圖7 所示，隨著沙藏時(shí)間的延長，吲哚乙酸（IAA） 含量呈現(xiàn)“N” 形曲線變化，在0～40 d 和80～120 d 時(shí)出現(xiàn)2 次增長； 其最高峰出現(xiàn)在沙藏40 d，IAA 含量為4.184 ng/g，除與沙藏120 d 時(shí)比較差異不顯著外，顯著高于其他各沙藏階段； 80 d 時(shí)IAA 含量最低為2.187 ng/g，顯著低于其他沙藏階段； 在40～80 d 期間IAA 含量平緩下降。有研究表明，IAA 含量在適宜的濃度范圍內(nèi)對種子解除休眠有一定的促進(jìn)作用，間接影響種胚的發(fā)育和其他激素水平，具有釋放種子休眠、促進(jìn)種子萌發(fā)的作用［17］，但在本實(shí)驗(yàn)中不同沙藏階段IAA 含量并未表現(xiàn)出規(guī)律性的變化。

圖7 沙藏時(shí)間對唐古特瑞香種子IAA 含量的影響

2.4.5.2 對GA 含量的影響 由圖8 可知，唐古特瑞香種子在整個(gè)沙藏過程中赤霉素（GA） 含量呈上升趨勢，各沙藏階段的種子GA 含量均顯著高于未沙藏種子，在沙藏初期（20、40 d） 含量增加平緩且無顯著性差異，60 d 時(shí)含量顯著升高，此后穩(wěn)定，一直持續(xù)到100 d； 100 ～120 d 時(shí)其含量又急劇增加，120 d 達(dá)到最大值116.656 ng/g。赤霉素（GA） 在種子處理中應(yīng)用廣泛，對多種植物種子萌發(fā)具有促進(jìn)作用［17］，本實(shí)驗(yàn)中特別是沙藏后期，GA 含量逐步升高，同時(shí)發(fā)芽率亦表現(xiàn)出升高的趨勢，說明GA 含量增加對唐古特瑞香種子休眠的解除具有積極作用，能夠提高發(fā)芽率，很有可能是唐古特瑞香種子萌發(fā)的主要促進(jìn)物質(zhì)。

圖8 沙藏時(shí)間對唐古特瑞香種子GA 含量的影響

2.4.5.3 對GA/ABA 比值的影響 種子內(nèi)源激素的消長平衡調(diào)控著種子的休眠水平，大量研究表明種子內(nèi)源激素的絕對含量只是調(diào)控機(jī)制中的一個(gè)方面，然而激素間的相對比值關(guān)系直接影響內(nèi)源激素最終的調(diào)控效果。近年來，赤霉素與脫落酸（GA/ABA） 的比值受到更多科研工作者的關(guān)注［15］，ABA 被認(rèn)為是最常見的種子萌發(fā)抑制劑，與GA存在拮抗作用，正向調(diào)節(jié)種子休眠時(shí)間，抑制其萌發(fā)［18］。圖9 顯示，GA/ABA 值在整個(gè)沙藏階段呈現(xiàn)雙峰增長曲線，先緩增再急減，又急增后降低，GA/ABA 值在40 d 時(shí)急劇上升，60 d 和80 d 兩個(gè)階段均保持在較高水平，分別為12.48、10.71，與此同時(shí)60 d 和80 d 兩個(gè)階段唐古特瑞香種子發(fā)芽率顯著提高，分別為21.33%和17.33%，80 d 后GA/ABA 值急劇下降并低于沙藏前期，種子發(fā)芽率隨之降低，最低為2%。結(jié)果顯示，GA/ABA 比值與唐古特瑞香種子發(fā)芽率有著密切聯(lián)系。

3 討論

3.1 唐古特瑞香種子休眠解除與營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系 本實(shí)驗(yàn)通過對唐古特瑞香種子在4 ℃恒溫條件下進(jìn)行為期120 d 的低溫沙藏處理，沙藏過程中淀粉、可溶性糖含量總體呈降低趨勢，作為種子呼吸作用的基礎(chǔ)物質(zhì)被消耗利用，與許美玲［19］研究結(jié)果一致。沙藏前期變化幅度較大，后期變化趨于平緩，這可能是因?yàn)榉N子沙藏前后環(huán)境溫度不同，種子內(nèi)部代謝增強(qiáng)，淀粉分解為可溶性糖的速率提高，以增強(qiáng)種子抗寒機(jī)能，便于種子保持正常的生理活性，與沙藏后種子內(nèi)部新陳代謝活動(dòng)改變有關(guān)［20-22］。可溶性蛋白質(zhì)在沙藏前期可能作為基礎(chǔ)供能物質(zhì)有所消耗； 60 d 后含量逐漸增加，可能由于種子內(nèi)部代謝規(guī)律發(fā)生變化。

3.2 唐古特瑞香種子休眠解除與內(nèi)源激素的關(guān)系 在內(nèi)源激素含量中，IAA 含量在整個(gè)沙藏過程中變化呈“N” 形曲線，40～80 d 時(shí)呈下降趨勢，并在80 d 達(dá)到最低點(diǎn)。有研究表明IAA 含量在適宜濃度范圍與其他內(nèi)源激素相互作用可間接影響種胚發(fā)育［23］； 也有研究表明IAA 低濃度可促進(jìn)種子萌發(fā)，高濃度對種子萌發(fā)具有抑制作用［24］。IAA 含量在2.187～3.386 ng/g （對應(yīng)時(shí)期為沙藏60 ～80 d） 范圍內(nèi)有利于唐古特瑞香種子萌發(fā)，但整個(gè)沙藏過程中未表現(xiàn)出一致的變化規(guī)律。GA 作為一種信號(hào)物質(zhì)，其促進(jìn)種子發(fā)芽的作用已被廣泛認(rèn)可，本實(shí)驗(yàn)中GA 含量在沙藏過程中總體呈上升趨勢，各沙藏階段GA 含量均顯著高于未沙藏種子，這與張成才等［25］關(guān)于百蕊草種子休眠研究結(jié)果一致。相對單一激素含量來講，不同激素含量間的平衡消長變化對于種子休眠與發(fā)芽的調(diào)控作用更為重要，尤其是生長促進(jìn)類激素與生長抑制類激素含量間的平衡［26］。有研究指出，ABA 是種子發(fā)芽抑制類物質(zhì)，而GA 與ABA 的比值是決定種子休眠是否解除的關(guān)鍵因素［27］，從GA/ABA 值來看，在整個(gè)沙藏階段呈現(xiàn)“雙峰” 增長曲線，在60 d 時(shí)出現(xiàn)了短暫的峰值后轉(zhuǎn)為平緩下降趨勢，60 d 時(shí)以20 mg/L的6-BA 浸種后種子發(fā)芽率明顯提高，這與前人關(guān)于GA/ABA 值是調(diào)控種子繼續(xù)休眠或萌發(fā)的重要因素的研究結(jié)論相似［28］。但沙藏后未用外源激素浸種處理的種子發(fā)芽率仍不足5%，推測在唐古特瑞香種子整個(gè)沙藏過程中，其內(nèi)源激素代謝并不能達(dá)到理想的平衡狀態(tài)促使種子萌發(fā)，需用適量的外源激素幫助其打破休眠狀態(tài)，這與趙潔等［8］研究結(jié)論相似，盡管模擬其生境溫度時(shí)設(shè)置了變溫沙藏試驗(yàn)，但與本實(shí)驗(yàn)4 ℃恒溫沙藏的種子發(fā)芽率接近。

4 結(jié)論

唐古特瑞香種子子葉發(fā)達(dá)，種胚形態(tài)健全，種子吸水率良好，故不存在形態(tài)休眠和吸水障礙； 在內(nèi)源激素方面，GA 與ABA 含量的比值可能是解除唐古特瑞香種子休眠的關(guān)鍵； 4 ℃沙藏60 d 時(shí)以20 mg/L 6-BA 浸種24 h，或沙藏80 d 時(shí)以300 mg/L GA 浸種24 h 可有效破除休眠現(xiàn)象，提高種子發(fā)芽率。