基于代謝組學(xué)研究肝復(fù)樂膠囊抑制LX-2 細(xì)胞激活機(jī)制

柯 暢，劉艷菊，2，涂濟(jì)源，張方蕾，高建龍，周仲實?

（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430065； 2.湖北省中藥炮制工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430065； 3.湖北省腫瘤醫(yī)院，湖北 武漢 430074）

肝纖維化是一種肝臟損傷病理進(jìn)程，常由飲酒、血吸蟲、肝炎等致病因素引起。肝臟受損自我修復(fù)過程中，細(xì)胞外基質(zhì)增生與膠原沉積引發(fā)纖維化進(jìn)展［1］。肝纖維化伴隨著多種肝臟疾病的發(fā)生，嚴(yán)重的肝纖維化會發(fā)展為肝硬化，甚至導(dǎo)致肝癌［2］。而肝星狀細(xì)胞（HSCs） 激活后轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵［3］。肝星狀細(xì)胞代謝紊亂與肝纖維化進(jìn)展關(guān)系密切，當(dāng)肝臟受損時，肝實質(zhì)細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞會發(fā)生相互作用，導(dǎo)致線粒體功能紊亂，肝實質(zhì)細(xì)胞脂質(zhì)堆積［4］。

肝復(fù)樂是潘敏求教授經(jīng)多年臨床觀察與研究發(fā)明的國家級抗癌三類新藥，由黨參、白術(shù)、鱉甲等21 味中藥組成，具有健脾理氣、化瘀軟堅、清熱解毒等功效。動物藥理實驗表明，肝復(fù)樂除對原發(fā)性肝癌療效卓著外，對實驗性肝纖維化大鼠也具有明顯保護(hù)作用［5］。但其發(fā)揮抗肝纖維化作用的機(jī)制尚未被闡明。基于此，本研究構(gòu)建人肝星狀細(xì)胞LX-2 體外纖維化模型［6］，采用分子生物學(xué)方法檢測肝星狀細(xì)胞活化標(biāo)志物，分析肝復(fù)樂對肝星狀細(xì)胞激活是否有抑制作用，再以GC-MS 法和代謝組學(xué)研究分析肝復(fù)樂對內(nèi)源代謝物質(zhì)的影響，探討其發(fā)揮抑制作用的可能代謝通路。

1 材料

1.1 細(xì)胞 人肝星狀細(xì)胞LX-2 （武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號CL-0560）。

1.2 藥物與試劑 肝復(fù)樂膠囊（康普藥業(yè)股份有限公司，批號20201128）。LX-2 細(xì)胞專用培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號WH01112103SP）； TGF-β1 蛋白（上海近岸科技有限公司，批號0520611）； 0.25%胰酶消化液、MTT （北京索萊寶科技有限公司，批號 20200930、20210112）； SYBR green qPCR 混合染料、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號7E452K0、1D352FE）； 甲醇、吡啶、methoxyamine hydrochloride （色譜純，美 國 Sigma-Aldrich 公 司，批 號 10765821435、STBK5658、BCCG1261）； BSTFA （美國Cerilliant 公司，批號FN05241802）； GAPDH 小鼠單克隆抗體、α-SMA 兔多克隆抗體、COL1A1 小鼠單克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號10013030、00082687、71010160）。

1.3 儀器 免疫印跡電泳系統(tǒng)（上海天能生命科學(xué)有限公司）； qTOWER3 G 熒光定量PCR 儀（德國Analytik Jena AG公司）； 225SM-DR 十萬分之一分析天平（瑞士Precisa 公司）； 多功能酶標(biāo)儀（美國Agilent 公司）； 1730R 微量高速冷凍離心機(jī)［基因科技（上海） 股份有限公司］； SW-CJ-2FD 潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）； CKX53倒置光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）； CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國賽默飛公司）。

2 方法

2.1 肝復(fù)樂溶液制備 取肝復(fù)樂內(nèi)容物10 g，用90 mL 80%乙醇回流提取，過濾，濾渣再次回流提取，合并2 次濾液，凍干，得到凍干粉3.47 g，PBS 定容至10 mL，按原膠囊質(zhì)量記，得到1 g/mL 混懸液。用含10% 胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基稀釋至10 mg/mL，37 ℃超聲溶解30 min，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌除雜，得到10 mg/mL 母液。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) LX-2 細(xì)胞使用專用培養(yǎng)基培養(yǎng)，每瓶DMEM 高糖培養(yǎng)基中含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素。待細(xì)胞生長傳代至第三代時，取部分細(xì)胞加入細(xì)胞凍存液進(jìn)行冷凍保存。LX-2 細(xì)胞接種于96 孔板中，細(xì)胞密度為2×103/孔，過夜貼壁后，棄上清，加入含0、125、250、500、1 000、2 000 μg/mL 肝復(fù)樂的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，MTT 法檢測細(xì)胞活力。取細(xì)胞接種于60 mm 中皿或6 孔板中，培養(yǎng)24 h，模型組LX-2 細(xì)胞給予5 ng/mL TGF-β1，肝復(fù)樂125、250、500 μg/mL 組在給予5 ng/mL TGF-β1 和相應(yīng)劑量肝復(fù)樂共同孵育24 h 后，中皿細(xì)胞用RIPA 法提取蛋白進(jìn)行免疫印記檢測。6 孔板細(xì)胞用TRIzol 法提取RNA 進(jìn)行實時熒光定量PCR 檢測。對照組、模型組、肝復(fù)樂組 （500 μg/mL） 細(xì)胞使用6 孔板培養(yǎng)，進(jìn)行后續(xù)代謝組學(xué)研究。

2.3 MTT 法檢測LX-2 細(xì)胞活力 設(shè)置肝復(fù)樂給藥質(zhì)量濃度為0、125、250、500、1 000、2 000 μg/mL，以未給藥細(xì)胞活力為100%，MTT 法檢測各給藥組對人肝星狀細(xì)胞LX-2 的增殖毒性，每組重復(fù)6 次。

2.4 Western blot 法檢測細(xì)胞α-SMA、COL1A1 蛋白表達(dá) 收集中皿培養(yǎng)細(xì)胞，RIPA 裂解液裂解細(xì)胞后提取蛋白，并進(jìn)行蛋白濃度檢測，加入loading buffer 后金屬浴煮沸，于－80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩５鞍讟颖具M(jìn)行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入GAPDH （1 ∶ 20 000）、α-SMA （1 ∶1 000）、COL1A1 （1 ∶5 000） 一抗4 ℃下孵育12 h，加入HRP 標(biāo)記二抗（1 ∶5 000） 孵育1 h，ECL 顯影后用Image J 軟件統(tǒng)計條帶灰度值，計算相對表達(dá)。

2.5 RT-qPCR 法檢測細(xì)胞α-SMA、COL1A1、COL4A2、MMP9、TIMP1 mRNA 表達(dá) 收集各組細(xì)胞，TRIzol 法提取總RNA，檢測RNA 濃度，使用試劑盒將所得RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，加入基于SYBR Green 染料的擴(kuò)增試劑盒及引物進(jìn)行多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。反應(yīng)條件為95 ℃1 min，95 ℃20 min，60 ℃45 s，共40 次循環(huán)，95 ℃1 min，通過2－ΔΔCT法處理數(shù)據(jù)。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.6 GC-MS 樣品前處理 參考文獻(xiàn)［7］ 報道，收集各組細(xì)胞，用37 ℃預(yù)熱的0.9%生理鹽水沖洗，加入4 ℃預(yù)冷的純水沖洗，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰上，加入－80 ℃預(yù)冷甲醇250 μL 淬滅，刮刀刮取細(xì)胞于EP 管中，再加入－80 ℃預(yù)冷甲醇250 μL 沖洗6 孔板，合并溶液。樣本保存于－80 ℃。EP管反復(fù)凍融3 次以裂解細(xì)胞（液氮冷凍10 min，室溫解凍5 min）。4 ℃下12 000 r/min 離心10 min，吸取上清400 μL至新的EP 管，氮吹儀吹干。提前配制好20 mg/mL甲氧基-吡啶，向干燥后的EP 管中加入80 μL，混勻，37 ℃烘箱孵育2 h，加入80 μL BSTFA，混勻，80 ℃水浴加熱1 h。室溫靜置5 min 后，渦旋混勻，4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取100 μL 上清，于內(nèi)襯管中準(zhǔn)備進(jìn)樣。

2.7 GC-MS 分析條件 參考文獻(xiàn)［8］ 報道，DB-5MS 毛細(xì)管柱（30 mm×0.25 mm×0.25 μm）； 程序升溫（起始溫度80 ℃，保持3 min，以5 ℃/min 升溫至280 ℃，保持5 min）； 進(jìn)樣量1.0 μL； 進(jìn)口溫度280 ℃； 分流進(jìn)樣，分流比10 ∶1； 載氣高純氦氣，體積流量1.0 mL/min； 離子源溫度200 ℃； 接口溫度280 ℃； 碰撞能量70 eV； 全掃描模式； 掃描范圍m/z50～650； 溶劑切除時間5 min。

2.8 數(shù)據(jù)處理與分析 參考文獻(xiàn) ［9］ 報道，通過Proteowizard、指紋圖譜相似性評價軟件（2004） 對所有樣本譜圖進(jìn)行共有峰提取［10］。SIMCA 14.1 軟件對所有峰進(jìn)行歸一化處理后進(jìn)行多變量分析［主成分分析（PCA） 和正交-偏最小二乘判別分析（OPLS-DA） ］。統(tǒng)計多變量分析模型VIP＞1 的樣本為差異代謝物，對各組差異代謝物進(jìn)行單因素方差分析，確定潛在生物標(biāo)志物（VIP ＞1 且P＜0.05）。根據(jù)潛在生物標(biāo)志物保留時間、質(zhì)荷比、二級裂解質(zhì)譜圖等數(shù)據(jù)，檢索GC-MS 數(shù)據(jù)庫、HMDB 數(shù)據(jù)庫后對生物標(biāo)志物進(jìn)行鑒定。通過MetaboAnalyst 5.0 （https： //www.metaboanalyst.ca） 網(wǎng)站對生物標(biāo)志物進(jìn)行通路富集。

2.9 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 23.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 肝復(fù)樂對LX-2 細(xì)胞活力的影響 如圖1 所示，500 μg/mL 劑量以下肝復(fù)樂對LX-2 細(xì)胞活力無明顯影響（P＞0.05），1 000、2 000 μg/mL 肝復(fù)樂抑制人肝星狀細(xì)胞LX-2 活性（P＜0.01）。因此選擇125、250、500 μg/mL 進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖1 肝復(fù)樂對LX-2 細(xì)胞活力的影響（±s，n＝6）

3.2 肝復(fù)樂對LX-2 細(xì)胞α-SMA、COL1A1、COL4A2、TIMP1、MMP9 mRNA 表達(dá)的影響 如圖2 所示，與對照組比較，模型組 LX-2 細(xì)胞α-SMA、COL1A1、COL4A2、TIMP1 mRNA 表達(dá)升高（P＜0.01），MMP9 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01）； 與模型組比較，肝復(fù)樂250、500 μg/mL 組LX-2 細(xì)胞α-SMA、COL1A1、COL4A2、TIMP1 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01），MMP9 mRNA 表達(dá)升高（P＜0.01）。

圖2 肝復(fù)樂對LX-2 細(xì)胞α-SMA、COL1A1、COL4A2、TIMP1、MMP9 mRNA 表達(dá)的影響（±s，n＝3）

3.3 肝復(fù)樂對LX-2 細(xì)胞α-SMA、COL1A1 蛋白表達(dá)的影響 如圖3 所示，與對照組比較，模型組LX-2 細(xì)胞α-SMA、COL1A1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）； 與模型組比較，肝復(fù)樂250、500 μg/mL 組LX-2 細(xì)胞α-SMA、COL1A1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），表明肝復(fù)樂能抑制TGF-β1 刺激引起的LX-2 細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生及膠原蛋白沉積。如圖4 所示，肝復(fù)樂并非直接結(jié)合TGF-β1 使其失活發(fā)揮抑制肝星狀細(xì)胞激活作用。對照組細(xì)胞用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，模型組細(xì)胞用TGF-β1 刺激12 h 后用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，肝復(fù)樂組細(xì)胞用TGF-β1 刺激12 h 后加入含500 μg/mL 肝復(fù)樂的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h。在肝復(fù)樂與TGF-β1 未同時存在時，肝復(fù)樂依舊能抑制肝星狀細(xì)胞活化標(biāo)志α-SMA表達(dá)。

圖3 肝復(fù)樂對LX-2 細(xì)胞α-SMA、COL1A1 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）

圖4 肝復(fù)樂與TGF-β1 未同時存在時對α-SMA 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）

3.4 GC-MS 分析結(jié)果 對照組、模型組和肝復(fù)樂組（500 μg/mL） 細(xì)胞衍生化后TIC 色譜圖見圖5，每組8 個樣本。

圖5 代謝組學(xué)樣本TIC 色譜圖

3.5 PCA、OPLS-DA 分析 PCA 評分見圖6A，由此可知，對照組樣本與模型組樣本之間分離明顯，肝復(fù)樂組樣本介于對照組與模型組之間，表明肝復(fù)樂組有向?qū)φ战M轉(zhuǎn)變的趨勢。PCA 分析模型R2X為0.783，表示該模型擬合度較好；Q2為0.429，表示該模型預(yù)測能力一般。因此進(jìn)一步使用OPLS-DA 分析，見圖6B，由此可知，模型組代謝物與對照組相比具有顯著差別，而肝復(fù)樂組能明顯回調(diào)LX-2 細(xì)胞代謝紊亂。OPLS-DA 模型R2X為0.664，R2Y為0.908，Q2為0.841； 對OPLS-DA 模型進(jìn)行200 次置換檢驗，結(jié)果見圖6C，R2Y軸截距為0.336，Q2Y軸截距為－0.426，表明該模型質(zhì)量良好，預(yù)測準(zhǔn)確，且沒有過擬合現(xiàn)象。根據(jù)以上分析結(jié)果，以VIP＞1 篩選OPLS-DA 模型中的化合物為潛在差異代謝物。

圖6 PCA、OPLS-DA 分析

3.6 肝復(fù)樂對LX-2 細(xì)胞激活后代謝產(chǎn)物的影響 基于OPLS-DA 模型篩選的潛在差異代謝物，進(jìn)一步使用單因素方差分析（P＜0.05） 進(jìn)行篩選。對于TGF-β1 造成的LX-2細(xì)胞代謝異常，肝復(fù)樂對其中9 種代謝物有回調(diào)效果，分別為丙酸、丁酸、苯丙氨酸、L-蘇氨酸、D-半乳糖、肌醇、甘油、油酸、D-甘油酯。其中，丙酸、丁酸、苯丙氨酸、L-蘇氨酸、肌醇在造模后含量降低，D-半乳糖、甘油、油酸、D-甘油酯在造模后含量升高。統(tǒng)計對照組、模型組和肝復(fù)樂組中上述9 種不同差異代謝物的峰面積，每個差異代謝物的相對濃度的比較結(jié)果見圖7，提示這9 種代謝物為肝復(fù)樂調(diào)節(jié)LX-2 代謝異常的潛在生物標(biāo)志物。

圖7 肝復(fù)樂對代謝物相對峰面積的影響

3.7 肝復(fù)樂對LX-2 細(xì)胞激活后代謝通路的影響 使用MetaboAnalyst 6.0 對以上生物標(biāo)志物進(jìn)行分析，并構(gòu)建LX-2 的代謝通路富集圖。如圖8 所示，其中4 條途徑符合Pathway impact＞0 且－log （P） ＞1 條件，分別為半乳糖代謝，半乳糖代謝，甘油酯代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，苯丙氨酸代謝。

圖8 MetaboAnalyst 分析的主要通路圖

3.8 肝復(fù)樂主要作用代謝通路分析 建立生物標(biāo)志物與代謝通路代謝示意（圖9），這可能是肝復(fù)樂抑制肝星狀細(xì)胞激活可能機(jī)制。

圖9 肝復(fù)樂通過多重代謝途徑抑制LX-2 激活路徑

4 討論

肝纖維化是指各種慢性肝病進(jìn)展中肝內(nèi)纖維生成與降解失衡，致使過多膠原在肝內(nèi)沉積，誘因包括飲酒、非酒精性脂肪性肝、病毒性肝炎、膽汁淤積性肝病等［11］。肝星狀細(xì)胞在肝纖維化中起核心作用，在多種肝損傷刺激下，由靜息狀態(tài)激活，促進(jìn)肝纖維化形成［12］。本研究采用TGFβ1 誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞系LX-2 細(xì)胞，激活標(biāo)志物α-SMA mRNA 和蛋白表達(dá)，并促進(jìn)膠原及關(guān)鍵酶COL1A1、COL4A2、TIMP1 mRNA 表達(dá)，而降低MMP9 mRNA 表達(dá)，表明LX-2 細(xì)胞纖維化模型成功［13］。α-SMA 同時也是ECM發(fā)生的標(biāo)志物，在各種損傷刺激下，肝星狀細(xì)胞過度激活會導(dǎo)致ECM 大量沉積，最終導(dǎo)致肝組織結(jié)構(gòu)破壞和功能障礙，導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生［14］。而肝復(fù)樂給藥后能夠明顯阻止TGF-β1 誘導(dǎo)的LX-2 細(xì)胞的活化。

肝復(fù)樂包含黨參、白術(shù)、鱉甲、沉香等21 味中藥，具有清熱解毒、健脾理氣、活血化瘀等多方面作用［15］。為進(jìn)一步研究肝復(fù)樂對肝星狀細(xì)胞代謝調(diào)控作用。本研究采用GC-MS 進(jìn)行代謝組學(xué)分析，篩選得到丙酸、丁酸、苯丙氨酸、L-蘇氨酸、D-半乳糖、肌醇、甘油、油酸、D-甘油酯9個潛在生物標(biāo)志物，主要涉及半乳糖代謝、甘油酯代謝、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、苯丙氨酸代謝4條代謝通路。半乳糖代謝異常可能影響正常滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、功能障礙、代謝紊亂［16］，并通過氧化反應(yīng)生成醛糖和過氧化氫，并生成氧自由基，導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷［17］。與模型組比較，肝復(fù)樂組D-半乳糖含量降低，肌醇含量升高，起到保護(hù)細(xì)胞的作用。苯丙氨酸與能量代謝關(guān)系密切，可以轉(zhuǎn)化為延胡索酸，異亮氨酸進(jìn)一步可以轉(zhuǎn)化為琥珀酰輔酶，從而參與三羧酸循環(huán)［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，蘇氨酸、苯丙氨酸在模型組中含量均降低，給藥后得到明顯回調(diào)，表明肝復(fù)樂能有效干預(yù)TGF-β1 導(dǎo)致的LX-2 細(xì)胞氨基酸代謝紊亂，提高細(xì)胞對氨基酸的攝入和利用。脂質(zhì)代謝紊亂與肝星狀細(xì)胞激活密切相關(guān)，異常增加的脂質(zhì)通過影響脂質(zhì)代謝平衡和增強(qiáng)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)促進(jìn)肝纖維化發(fā)生［19］。與模型組比較，肝復(fù)樂給藥可以有效降低甘油、油酸、D-甘油酯含量。

綜上所述，肝復(fù)樂可抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化和纖維化，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)半乳糖代謝、甘油酯代謝、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、苯丙氨酸代謝多條代謝通路有關(guān)。本研究進(jìn)一步闡明了肝復(fù)樂膠囊在肝纖維化中的保護(hù)作用，為其在預(yù)防或逆轉(zhuǎn)肝纖維化應(yīng)用中奠定堅實基礎(chǔ)。