基于網絡藥理學和動物實驗探討當歸補血湯抗肝纖維化的作用

陶柏楠，王詠蘭，劉道忠，萬 星，黃德斌，袁 林?

（1.湖北民族大學風濕性疾病發生與干預湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000； 2.四川大學華西基礎醫學與法醫學院，四川 成都 610064）

肝纖維化的發病率很高，通常見于高脂肪飲食、酗酒、乙型肝炎（HBV） 感染［1］。在病理性肝纖維化肝臟中，主要表現為肝細胞損傷和肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC） 活化，進而產生細胞外基質 （ECM） 沉積的過程［2］。肝纖維化是肝損傷發展為肝硬化、肝癌等危重疾病的中間階段，在早期是可逆的，但在肝硬化階段會發展為肝細胞癌前病變［3-4］。因此，阻止肝纖維化的發生發展具有重要意義。由于肝纖維化機制復雜且臨床治療藥物療效有限，因而研究與開發治療肝纖維化特效藥物尤為關鍵［5-6］。傳統中醫藥有多靶點、多環節等特點，在抗肝纖維化方面有其獨特優勢。

當歸補血湯是中醫經典方劑，由黃芪和當歸以5 ∶1 的比例組成，其中當歸屬肝、心、脾經，具有活血、補血功效［7］； 黃芪屬肺、脾經，具有補氣、固表功效［8］，該方在臨床常用來治療正虛血瘀類疾病。且現代藥理學研究表明，當歸補血湯抗肝纖維化有顯著效果，有改善肝功能、抗肝臟脂質過氧化損傷、降低肝組織羥脯賴氨酸（Hyp） 水平、減少ECM 沉積等作用［9-12］。盡管當歸補血湯在抗肝纖維化方面有一定研究，但對于其抗肝纖維化的具體作用機制的探究仍然十分有限。本研究利用網絡藥理學構建“藥物-成分-作用靶點-疾病” 網絡，分析其相關生物學途徑，預測當歸補血湯抗肝纖維化的作用靶點及信號通路，并運用體內動物實驗對相關通路和靶點進行驗證，以期為中醫藥防治肝纖維化提供新思路。

1 材料

1.1 動物 48 只雄性C57BL/6 鼠，6 ～8 周齡，購自重慶醫科大學實驗動物中心［實驗動物生產許可證號SCXK（渝） 2018-0003］，普通喂養7 d 后開始實驗，控制飼養室溫（22±2）℃，相對濕度（55±15）%。實驗所有操作均通過湖北民族大學醫學倫理會審查批準（倫理號2022-047）。

1.2 藥物 當歸補血湯由當歸、黃芪（甘肅九州天潤中藥產業有限公司，批號G01220507、G031903141） 組成。根據《內外傷辨惑論》 中記載用量，稱取黃芪500 g、當歸100 g，用水煎煮2 次，過濾，將濾液混合，于旋轉蒸發儀中將藥液濃縮至2.16 g/mL，再根據所需劑量稀釋使用。水飛薊賓膠囊 （天津天士力圣特制藥有限公司，批號H20040299）。

1.3 試劑 ALT、AST 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20220927）； SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號P0012A）； IL-1β、TNF-α、IL-6 ELISA 試劑盒（杭州聯科生物技術有限公司，批號EK201B/3-96、EK282/3-96、EK206/3-96）； β-actin 抗體（美國Proteintech 公司，批號18725-1-AP）； PI3K、p-PI3K抗體 （武漢華美生物工程有限公司，批號 CSBRA578819A0HU、CSB-PA000712 ）； Akt、p-Akt、P38 MAPK、p-P38 MAPK 抗體 （美國CST 公司，批號4691、4060、D13E1、4511）； JNK、p-JNK 抗體（沈陽萬類生物科技有限公司，批號WL01295、WL01813）； HRP 標記兔抗、鼠抗（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號GB23204、GB23301）； BCA 試劑盒、ECL 化學發光劑（武漢科瑞生物技術有限公司，批號KR0008、KR0016）； 其他化學試劑為國產分析純。

1.4 儀器 垂直電泳儀、蛋白轉印儀（美國Bio Rad 公司）； 純水制備機（上海樂楓生物科技有限公司）； 高壓蒸汽滅菌鍋 （日本SANYO 公司）； 多功能酶標儀 （美國Thermo Fisher Scientific 公司）； 低速離心機、高速離心機（德國Eppendorf 公司）； FM40 制冰機（北京長流科學儀器有限公司）； 紅細胞超聲儀（南京舜瑪儀器設備有限公司）； 脫色搖床（北京六一生物科技有限公司）； 倒置生物顯微鏡（日本Olympus 公司）。

2 方法

2.1 當歸補血湯抗肝纖維化的網絡藥理學研究

2.1.1 篩選藥物有效成分及藥物靶點 在TCMSP 和TCMID 數據庫，分別以關鍵詞“當歸” “黃芪” 檢索，根據2 味藥物口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL） ≥0.18 以及2020 年版《中國藥典》 2 味藥物質量控制成分并結合文獻中報道當歸補血湯配伍有效成分納入分析。從TCMSP 和TCMID 數據庫中檢索化合物靶點，并運用PubChem 平臺 （https： //pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取靶點 Canonical SMILES 號，SMILES 號導入至SwissTarget Prediction 數據庫（http： //swisstargetprediction.ch/），設置物種為“Homosapiens”，篩選條件為Probability≥0.1，Targetnet 數據庫 （ http： //targetnet.scbdd.com/calcnet/index/） 設置篩選條件為AUC≥0.7，將以上數據庫預測到的靶點進行整合，去除重復靶點，并通過UniProt 數據庫校正，得到靶蛋白的基因名。

2.1.2 獲取疾病的靶點 登錄基因數據庫（GeneCards，https： //www.genecards.org/）、在線人類孟德爾遺傳病數據庫（OMIM，https： //www.omim.org/） 和療效藥靶數據庫 （ TTD，https： //db.idrblab.net/ttd/），以 “ liver fibrosis” 為檢索詞獲取疾病靶點，去除重復基因，結合UniProt 數據庫將靶點名標準化，確定肝纖維化的潛在作用靶點。在Venny 2.1.0 平臺中將當歸補血湯的有效成分及肝纖維化的相關基因靶點取交集，繪制韋恩圖。

2.1.3 構建“藥物-成分-疾病-靶點” 網絡 建立當歸補血湯“藥物-活性成分” “活性成分-疾病-靶點” 相互對應關系數據集，導入Cytoscape 3.9.1 軟件中構建“藥物-成分-疾病-靶點” 網絡。

2.1.4 蛋白質相互作用（PPI） 網絡構建及核心靶點篩選 將當歸補血湯作用于肝纖維化的交集靶點導入String數據庫（https： //cn.stringdb.org/） 構建PPI 網絡，設定物種為“Homosapiens”，置信度為0.9，去除游離靶點，導入Cytoscape 3.9.1 軟件根據交集靶點對藥物有效成分。Analyze Network 進行拓撲學參數分析，并通過degree 排序，構建“當歸補血湯成分-疾病靶點” 網絡圖。其中節點越大，顏色越深，表明該節點degree 值越高，即該靶點的作用越關鍵。

2.1.5 GO 功能及KEGG 通路富集分析 使用DAVID 數據庫（https： //david.ncifcrf.gov/） 將潛在作用靶點導入數據庫，設定條件P＜0.05，進行基因本體（GO） 功能和京都基因與基因組百科全書（KEGG） 通路富集分析，并在微生信網（http： //www.bioinformatics.com.cn/） 分析繪制GO 功能富集分析柱狀圖和KEGG 通路富集氣泡圖。

2.2 當歸補血湯對CCl4 誘導C57BL/6 小鼠肝纖維化的作用

2.2.1 造模、分組與給藥 隨機數字表法將小鼠分為正常組、模型組、水飛薊賓組和當歸補血湯低、中、高劑量組，每組8 只。小鼠適應性喂養7 d 后，模型組小鼠腹腔注射25%橄欖油四氯化碳 （CCl4） 混合溶液1.6 mL/kg 造模［13］，每周2 次，連續6 周。各組在造模的同時給藥，根據人與大鼠體表面積換算標準［14］，水飛薊賓組灌胃給予54.6 mg/kg 水飛薊賓； 當歸補血湯低、中、高劑量組分別灌胃給予5.4、10.8、21.6 g/kg 當歸補血湯，分別相當于人臨床用量的1、2、4 倍； 正常組和模型組灌胃給予等體積生理鹽水，早晚各1 次。6 周后，小鼠禁食不禁水24 h，處死，分別采集血液和肝組織進行后續檢測。

2.2.2 肝組織病理學檢查 取小鼠肝臟右葉相同位置，放入組織固定液中固定，2 d 后使用全自動組織脫水儀進行組織脫水，石蠟包埋，切片，分別進行蘇木精-伊紅（HE）與Masson 三色染色，脫水，二甲苯透明，封片，玻片掃描儀進行掃描拍照。

2.2.3 血清指標檢測 小鼠摘眼球取血后靜置60 min，于4 ℃、3 500 r/min 離心15 min，取上層血清。根據試劑盒說明書，檢測血清谷丙轉氨酶 （ALT）、谷草轉氨酶（AST）、白介素6 （IL-6）、腫瘤壞死因子-α （TNF-α）、白介素-1β （IL-1β） 水平。

2.2.4 Western blot 法檢測肝組織α-SMA、Col-1、p-PI3K、p-Akt、p-JNK、p-P38 MAPK 蛋白表達 取約0.1 g 肝組織，用含有蛋白酶抑制劑的裂解液裂解組織，12 000 r/min 離心10 min，提取蛋白上清，BCA 法測定蛋白濃度，通過凝膠電泳將蛋白分離，隨后轉印到0.45 μm PVDF 膜上，用封閉液于室溫封閉1 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min，加一抗（1 ∶1 000） 于4 ℃孵育過夜，次日TBST 洗膜3 次。加入對應的二抗（1 ∶20 000），室溫孵育1 h，TBST 洗膜3次，加入ECL 化學發光顯影液避光反應1 min，進行顯影，分析條帶灰度值。

2.2.5 統計學分析 通過SPSS 19.0 軟件進行處理，數據以（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析，滿足正態分布條件及方差齊時，兩兩比較采用LSD 檢驗； 不滿足方差齊性檢驗時，采用非參數檢驗 （Kruskal-Wallis），用Bonferroni 校正檢驗調整顯著性值。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 當歸補血湯有效成分及藥物靶點篩選 通過TCMSP和TCMID 數據庫，篩選得到當歸補血湯中黃芪有效化學成分20 種，當歸有效化學成分2 種。根據2020 年版《中國藥典》 質量控制成分并結合文獻［15］ 報道，將當歸補血湯配伍中生物活性良好、利用價值大的活性成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪甲苷、阿魏酸及藁本內酯7 種有效成分納入本研究，見表1。通過各數據庫檢索出的靶點進行整理并去除重復，獲得522 個活性潛在靶點。

表1 當歸補血湯活性成分

3.2 當歸補血湯抗肝纖維化作用靶點篩選 將OMIM、GeneCards、TDD 數據庫獲得的肝纖維化疾病相關靶點進行整理，去除重復，結果得到2 901 個潛在靶點。在Venny 工具中對藥物與疾病交集靶點進行映射，得到當歸補血湯作用于肝纖維化的潛在靶點259 個，見圖1。

圖1 當歸補血湯抗肝纖維化的靶點Venn 圖

3.3 當歸補血湯“藥物-成分-疾病-靶點” 網絡構建 采用Cytoscape 3.9.1 軟件得到“藥物-成分-疾病-靶點” 網絡，其中化合物節點的大小與化合物degree 值呈正相關，見圖2。Analyze Network 進行拓撲分析，該網絡有290 個節點、631 條邊，網絡中平均相鄰節點數為7.80，網絡異質性為2.10，網絡中心度0.57。其中，排名前十的有效化學成分為槲皮素 （quercetin）、阿魏酸 （ferulic acid）、山柰酚（kaempferol）、異鼠李素 （ isorhamnetin）、聯苯雙酯（bifendate）、藁本內酯 （cis-ligustilide）、芒柄花素（formononetin）、毛蕊異黃酮 （calycosin）、華良姜素（jaranol）、二氫異黃酮（isoflavanone）。

圖2 “藥物-成分-疾病-靶點” 網絡圖

3.4 蛋白質相互作用（PPI） 網絡分析 當歸補血湯作用于肝纖維化的核心靶點前10 位分別為腫瘤P53 基因（TP53）、熱休克蛋白 90α 家族 A 類成員基因（HSP90AA1）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶（SRC）、絲裂原活化蛋白激酶1 （MAPK1）、RelA/p65 基因（RelA）、c-Jun氨基末端蛋白激酶（JNK）、E1A 結合蛋白P300 （EP300）、蛋白激酶B1 （Akt）、組蛋白去乙酰化酶1 基因（HDAC1）、絲裂原活化蛋白激酶14 （MAPK14），見圖3。

圖3 當歸補血湯抗肝纖維化的靶點PPI 網絡

3.5 GO 功能富集分析 GO 功能富集分析得到1 161 個富集條目，包括897 個生物過程 （BP）、80 個細胞組分（CC） 和184 個分子功能（MF）。篩選出排名前10 條進行可視化，見圖4。其中，BP 主要涉及RNA 轉錄的正向調節、基因表達的正調控、凋亡的負調控、DNA 轉錄的正調控、細胞增殖的正調節等過程； CC 主要涉及細胞內溶質、細胞核、細胞質、細胞基質、細胞外間隙等組分； MF 主要涉及細胞內離子的結合、受體的結合、蛋白的結合、信號傳導、酶的結合等功能。

圖4 當歸補血湯抗肝纖維化靶點的GO 功能富集分析

3.6 KEGG 通路富集分析 KEGG 通路富集分析得到當歸補血湯抗肝纖維化的重要相關信號通路180 條。選取排名前20 位的通路，繪制KEGG 可視化氣泡圖，見圖5。富集通路主要有癌癥通路（pathways in cancer）、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 信號通路（PI3K/Akt singaling pathway）、脂質與動脈硬化信號通路（lipid and atherosclerosis）、絲裂原活化蛋白激酶信號通路（MAPK singaling pathway）、乙型肝炎（hepatitis B）、IL-17 信號通路、TNF 信號通路等。其中，當歸補血湯抗肝纖維化相關的通路中PI3K/Akt 及MAPK 信號通路富集程度最高，且PPI 網絡分析中多個核心靶點如Akt、c-Jun、MAPK 等蛋白靶點均富集于這2 條通路，故后續動物實驗選用這2 條信號通路來進行驗證。

圖5 當歸補血湯抗肝纖維化靶點的KEGG 通路富集分析

3.7 當歸補血湯對肝纖維化小鼠肝組織病理學變化的影響 正常組小鼠肝臟細胞排列整齊，肝組織形態正常； 模型組小鼠肝組織結構嚴重破壞，假小葉增加，肝血竇壓縮變形，肝細胞大小不均，細胞核受到擠壓變形，出現大量炎性浸潤以及明顯藍染纖維索，提示有大量膠原纖維沉積（P＜0.01）； 與模型組比較，當歸補血湯各劑量組和水飛薊賓組小鼠肝組織細胞形態異常情況有所好轉，假小葉結構明顯減少，炎性浸潤區域減少，藍染纖維組織沉積有所減輕，纖維條索減少（P＜0.01），見圖6～7。

圖6 各組小鼠肝組織HE 染色（×200）

圖7 各組小鼠肝組織Masson 染色（×100，±s，n＝8）

3.8 當歸補血湯對肝纖維化小鼠肝功能的影響 與正常組比較，模型組小鼠血清ALT、AST 水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，當歸補血湯各劑量組和水飛薊賓組小鼠血清ALT、AST 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），見圖8。

圖8 當歸補血湯對肝纖維化小鼠血清ALT、AST 水平的影響（±s，n＝8）

3.9 當歸補血湯對肝纖維化小鼠血清炎性因子IL-6、TNFα、IL-1β 水平的影響 與正常組比較，模型組小鼠血清炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β 水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，當歸補血湯各劑量組和水飛薊賓組小鼠血清IL-6、TNF-α、IL-1β 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），見圖9。

圖9 當歸補血湯對肝纖維化小鼠血清IL-6、TNF-α、IL-1β 水平的影響（±s，n＝8）

3.10 當歸補血湯對肝纖維化小鼠肝組織α-SMA、Col-1 蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝組織α-SMA、Col-1 蛋白表達升高（P＜0.01）； 與模型組比較，當歸補血湯各劑量組和水飛薊賓組小鼠肝組織α-SMA、Col-1 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01），見圖10。

圖10 當歸補血湯對肝纖維化小鼠肝組織α-SMA、Col-1 蛋白表達的影響（±s，n＝8）

3.11 當歸補血湯對肝纖維化小鼠肝組織PI3K/Akt 信號通路的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝組織p-PI3K、p-Akt 蛋白表達升高（P＜0.01）； 與模型組比較，當歸補血湯低劑量組小鼠肝組織p-PI3K 蛋白表達無明顯變化（P＞0.05），p-Akt 蛋白表達降低（P＜0.05），當歸補血湯中、高劑量組和水飛薊賓組小鼠肝組織p-PI3K、p-Akt 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01），見圖11。

3.12 當歸補血湯對肝纖維化小鼠肝組織JNK/P38 MAPK信號通路的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝組織p-JNK、p-P38 MAPK 蛋白表達升高（P＜0.01）； 與模型組比較，當歸補血湯中、高劑量組和水飛薊賓組小鼠肝組織p-JNK、p-P38 MAPK 蛋白表達降低（P＜0.01），當歸補血湯低劑量組小鼠肝組織p-P38 MAPK 蛋白表達無明顯變化（P＞0.05），p-JNK 蛋白表達降低（P＜0.05），見圖12。

圖12 當歸補血湯對肝纖維化小鼠肝組織p-JNK、p-P38 MAPK 蛋白表達的影響（±s，n＝8）

4 討論

肝纖維化是一種肝臟受到各種刺激的可逆的傷口愈合反應，是大多數慢性肝病的主要特征，其特征是過量ECM積累。活化的HSC 分泌促纖維化及促炎介質，其中，纖維化介質表現為ECM 沉積產生的Col-1 以及α-SMA 等纖維化蛋白過表達［16-17］； 促炎介質表現為IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎癥細胞因子的分泌，且免疫細胞釋放的炎癥因子被大量招募到肝臟，進一步促進肝纖維化的發展。本研究通過腹腔注射CCl4建立肝纖維化小鼠模型，發現小鼠肝組織出現明顯纖維化及炎癥反應，肝組織假小葉結構及藍染纖維結構增加，血清ALT、AST 水平升高，炎性因子IL-6、TNF-α和IL-1β 水平升高，肝組織肝纖維化蛋白α-SMA、Col-1 表達升高； 而當歸補血湯組均能改善以上指標，表明當歸補血湯具有抗小鼠肝纖維化作用。

通過網絡藥理學篩選得到肝纖維化相關疾病靶點2 901個，從當歸補血湯中篩選得到抗肝纖維化的活性成分29種，作用靶點259 個，得到核心靶點有MAPK1、NF-κB p65/RELA、c-Jun/JNK、Akt1、MAPK14 等，并主要涉及PI3K/Akt 和MAPK 信號通路。MAPK 是一組進化保守的絲氨酸-蘇氨酸激酶，在哺乳動物細胞中發揮傳遞、放大和整合來自各種刺激范圍信號的作用［18］。MAPK 中P38、JNK可被TNF-α 和IL-1β 等炎癥細胞因子激活，活化后的P38進一步可以激活JNK 信號通路磷酸化，通過MKK4 磷酸化Tyr185 位點和MKK7 磷酸化Thr183 位點發揮轉錄作用，磷酸化的JNK 可以磷酸化c-Jun，在肝纖維化中產生促炎癥等相關生理效應［19］。PI3K 包含p110 和p85 兩個亞基，受到上游受體激活后在質膜上產生第二信使PIP3，與包含PH結構域的信號蛋白結合，實現對下游Akt 蛋白的調控［20］，使Akt 蛋白磷酸化，發揮細胞代謝、存活和生長等關鍵生物作用［21］。PI3K/Akt 途徑與肝纖維化關系密切，大量研究表明下調PI3K/Akt 表達可阻止肝纖維化進程［22-23］。本研究發現，肝纖維化小鼠肝組織p-PI3K、p-Akt、p-JNK、p-P38 MAPK 蛋白表達升高； 當歸補血湯組小鼠肝組織p-PI3K、p-Akt、p-JNK、p-P38 MAPK 蛋白表達降低。以上結果與網絡藥理學研究所預測的靶點相吻合，表明當歸補血湯抗小鼠肝纖維化可能與下調PI3K/Akt 和JNK/p38 MAPK 信號通路有關。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學及動物實驗證明了當歸補血湯中多種主要活性成分可能通過下調肝纖維化的炎癥反應，減少纖維蛋白表達，下調JNK/P38 MAPK 和PI3K/Akt 信號通路，發揮抗肝纖維化的作用。本研究為當歸補血湯能夠通過多通路、多靶點抗肝纖維化提供了客觀依據，但肝纖維化的機制和中藥的活性成分復雜，課題組后續將通過體內外實驗對當歸補血湯抗肝纖維化的機制進行深入研究，以期為當歸補血湯臨床運用及中醫藥的開發利用提供新的方向。