日常飲食中添加攝食甜菜堿對(duì)APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠的影響

張麗陽(yáng)，孫 軍，陳 笛，張?jiān)谛?/p>

（南陽(yáng)市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 南陽(yáng) 473000）

甜菜堿是一種吡啶衍生物類含氮色素，廣泛存在于多種石竹目科植物的花和果實(shí)中，目前已實(shí)現(xiàn)人工化學(xué)合成［1］。甜菜堿主要被用為食品添加劑、清潔類護(hù)膚品、藥品和保健品［2］。人體內(nèi)甜菜堿的主要來(lái)源為膽堿前體代謝和飲食［3］。在哺乳動(dòng)物中，甜菜堿可作為甲基供體將同型半胱氨酸（Hcy） 轉(zhuǎn)化為蛋氨酸［4］。Hcy 是一種神經(jīng)毒性氨基酸，是多種神經(jīng)退行性疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。已有研究表明，血清中高濃度Hcy 可加速β-淀粉樣蛋白（Aβ）沉積并增加阿爾茨海默病（AD） 的發(fā)病率［5］。此前已有研究顯示，甜菜堿可減輕Hcy 引起的大鼠AD 樣病理改變和記憶功能障礙［6］。在3×Tg AD 模型小鼠中，同樣發(fā)現(xiàn)持續(xù)攝入甜菜堿可改善認(rèn)知功能障礙［7］。最近也有一項(xiàng)研究表明，攝食甜菜堿可改善AD 患者的認(rèn)知功能障礙［8］。而攝食甜菜堿在AD 的海馬神經(jīng)發(fā)生和突觸功能中的作用并不清楚，因此，本研究利用APP/PS1 （APPswe和PSEN1dE9） 雙轉(zhuǎn)基因AD 模型小鼠研究甜菜堿對(duì)記憶障礙、AD 病理癥狀、海馬神經(jīng)元再生和突觸可塑性的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物 30 只6 月齡SPF 級(jí)雄性APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠、15 只6 月齡SPF 級(jí)雄性野生型C57BL/6J 小鼠購(gòu)自蘇州賽業(yè)模式生物研究中心有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （蘇） 2020-0006。飼養(yǎng)于南陽(yáng)理工學(xué)院SPF 級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)平臺(tái)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK （豫） 2020-0013，12 h/12 h 光暗循環(huán)，溫度（24±1）℃，相對(duì)濕度（55±5）%，小鼠自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。本研究獲得南陽(yáng)市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（倫理號(hào)20200434）。

1.2 試劑 甜菜堿（純度＞98%，貨號(hào)B802317）、曲拉通（Triton） X-100 （貨號(hào) T6328）、RIPA 裂解液 （貨號(hào)R874809）、4%多聚甲醛固定液（貨號(hào)P885233） 購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司； OCT 冷凍切片包埋劑（貨號(hào)4583） 購(gòu)自上海索寶生物科技有限公司； EdU 試劑（貨號(hào)E6032）、WonderOrangeTM蛋白定量試劑盒（貨號(hào)W6006）、超敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)S6009）、YF ? 488 羊抗小鼠IgG （H＋L） （貨號(hào)Y6104）、YF ?647 羊抗小鼠或兔IgG （H＋L） （貨號(hào)Y6108、Y6109）、抗熒光淬滅固化劑（貨號(hào)A4083） 購(gòu)自蘇州宇恒生物科技有限公司； AAV-GFP（貨號(hào)V1-001） 購(gòu)自廣州派洛摩爾生物技術(shù)有限公司； Aβ抗體（貨號(hào)sc-28365）、雙皮質(zhì)素（DCX） 抗體（貨號(hào)sc-271390）、巢蛋白（Nestin） 抗體（貨號(hào)sc-23927） 購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司； 神經(jīng)元核抗原（NeuN） 抗體（貨號(hào)BS6808）、蛋白突觸后致密蛋白-95 （PSD-95） 抗體（貨號(hào)BS2978）、突觸小泡蛋白（SYN） 抗體（貨號(hào)BS1345）、神經(jīng)元結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白（MAP-2） 抗體（貨號(hào)MB0078） 購(gòu)自南京巴傲得生物科技有限公司； 兔源β-actin抗體（貨號(hào)WL01372）、HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG （H ＋L）（貨號(hào)WLA023） 購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司。

1.3 儀器 YH-WM-M/R 型Morris 水迷宮儀（武漢一鴻科技有限公司）； EthoVision XT 型小動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡跟蹤監(jiān)測(cè)系統(tǒng)（荷蘭Noldus Information Technology 公司）； VT1200S型全自動(dòng)振動(dòng)切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司）； Axio Scope A1 型熒光顯微鏡（德國(guó)Carl Zeiss 公司）； PT-3502G 型多功能酶標(biāo)儀（北京普天新橋技術(shù)有限公司）； Tanon V8 型Western blot 轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、Tanon 1600 型全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）； SZ810 型體視顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司）； Axon 膜片鉗系統(tǒng)（美國(guó)Molecular Devices 公司）。

2 方法

2.1 分組與干預(yù) 30 只APP/PS1 小鼠隨機(jī)分為正常飲食組和甜菜堿補(bǔ)充飲食組，每組15 只，其中正常飲食組APP/PS1 小鼠給予正常飲食（標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物顆粒飼料），甜菜堿補(bǔ)充飲食組APP/PS1 小鼠給予甜菜堿補(bǔ)充飲食（標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物顆粒飼料中添加5 g/kg 甜菜堿）。同時(shí)納入15 只野生型C57BL/6J 小鼠給予正常飲食，作為空白對(duì)照組。上述3 組小鼠均經(jīng)上述方案飼養(yǎng)3 個(gè)月。

2.2 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn) 泳池隨機(jī)分為4 個(gè)象限，水溫25 ℃，站臺(tái)隨機(jī)置于一個(gè)象限中，并低于水面1 cm。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前2 d，每天訓(xùn)練小鼠在隨機(jī)不同的象限入水至爬上站臺(tái)，以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境； 隨后5 d，將小鼠放置在站臺(tái)以外的一個(gè)象限入水，用小動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡跟蹤監(jiān)測(cè)系統(tǒng)記錄小鼠找到站臺(tái)所用時(shí)間（逃避潛伏期） 和計(jì)算平均游泳速度。第6 天，將站臺(tái)下沉至泳池底部，從站臺(tái)以外的一個(gè)象限的同一個(gè)入水點(diǎn)入水，小動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡跟蹤監(jiān)測(cè)系統(tǒng)記錄小鼠穿過(guò)原站臺(tái)位置的次數(shù)和尋找原站臺(tái)位置的時(shí)間。

2.3 腦立體定位注射AAV-GFP 并于熒光顯微鏡下觀察棘突形態(tài) 每組選取5 只小鼠，麻醉后，置于小鼠腦立體定位注射儀上，并將100 nL AAV-GFP 注入小鼠CA1 區(qū)。4 d后，深度麻醉小鼠，斷頸后快速取出完整腦組織，用體式顯微鏡在冰上快速分離出海馬，4%多聚甲醛固定過(guò)夜，第2 天在4 ℃下分別用20%、30% 蔗糖依次脫水過(guò)夜，OCT包埋，并用全自動(dòng)振動(dòng)切片機(jī)連續(xù)切成6 μm 厚切片，在熒光顯微鏡下觀察CA1 區(qū)GFP 標(biāo)記神經(jīng)元的棘突，通過(guò)Image J 軟件測(cè)量棘突的密度。

2.4 免疫熒光法檢測(cè)Aβ、DCX、Nestin 陽(yáng)性表達(dá) 選取5只小鼠，麻醉后按“2.3” 項(xiàng)下方法分離出海馬和皮質(zhì)，并制作6 μm 厚冰凍腦片。分別將海馬或皮質(zhì)切片室溫風(fēng)干，PBS 浸泡10 min，風(fēng)干，用0.3% Trition X-100 處理3 min，PBS 沖洗2 次，10%山羊血清在37 ℃下封閉1 h。分別加入Aβ （1 ∶1 000）、DCX （1 ∶1 000）、Nestin （1 ∶500） 一抗室溫孵育1 h 后4 ℃過(guò)夜，第2 天洗滌后，加入YF?488 羊抗小鼠IgG （H＋L）、YF ? 647 羊抗小鼠IgG（H＋L） 熒光二抗（1 ∶500），室溫孵育1 h，PBS 洗滌后，DAPI 染色5 min，抗熒光淬滅固化劑封片，熒光顯微鏡下隨機(jī)選取3 個(gè)視野，通過(guò)Image J 軟件分析陽(yáng)性信號(hào)。

2.5 電生理記錄長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（LTP） 效應(yīng) 取400 μm 厚的海馬區(qū)腦組織切片，用人工腦脊液灌流，并在顯微鏡下將刺激電極置于CA3 區(qū)錐體層Schaffer 側(cè)枝，記錄電極置于CA1 區(qū)放射層。用單個(gè)電脈沖（100 Hz） 刺激1 s，共3次，每次間隔5 min，觀察興奮性突觸后電位（fEPSP），待fEPSP 穩(wěn)定后，取50%最大fEPSP 的刺激作為高頻條件刺激20 min，誘導(dǎo)出LTP。用Clampex 9.0 采集數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以fEPSP 的斜率表示，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2.6 NeuN 和EdU 雙標(biāo)熒光染色法檢測(cè)NeuN 陽(yáng)性表達(dá) 取5 只小鼠給予腹腔注射50 mg/kg EdU，繼續(xù)飼養(yǎng)4 d。按“2.3” 項(xiàng)下方法制作海馬切片并進(jìn)行NeuN （1 ∶1 000） 免疫熒光染色。切片分別加入YF ? 647 羊抗兔IgG （H＋L）熒光二抗（1 ∶500） 和YF ? 488 標(biāo)記的EdU 檢測(cè)工作液并室溫孵育1 h，PBS 洗滌后，抗熒光淬滅固化劑封片，熒光顯微鏡下隨機(jī)選取3 個(gè)視野，通過(guò)Image J 軟件分析陽(yáng)性信號(hào)。

2.7 Western blot 法檢測(cè)海馬組織PSD-95、SYN、MAP-2蛋白表達(dá) 用RIPA 裂解液裂解海馬組織，取蛋白并定量。取等量蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜。封閉膜上非特異性抗原后加入PSD-95 （1 ∶ 1 000）、SYN （1 ∶ 1 500）、MAP-2 （1 ∶3 000）、β-actin （1 ∶6 000） 一抗37 ℃下孵育1.5 h，洗膜后，室溫加入HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG （H＋L） 二抗37 ℃下孵育45 min，洗膜后，通過(guò)Tanon 1600 型全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)用超敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒成像，以β-actin 為內(nèi)參，用自帶軟件分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用事后多重分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 甜菜堿對(duì)APP/PS1 小鼠記憶行為的影響 與空白對(duì)照組比較，正常飲食組APP/PS1 小鼠逃避潛伏期延長(zhǎng)（P＜0.01）； 與正常飲食組比較，甜菜堿補(bǔ)充飲食組APP/PS1小鼠避潛伏期縮短（P＜0.01），平均游泳速率無(wú)明顯變化（P＞0.05）。站臺(tái)移除后，與空白對(duì)照組比較，正常飲食組APP/PS1 小鼠探索隱藏站臺(tái)時(shí)間縮短（P＜0.01），穿越站臺(tái)次數(shù)減少（P＜0.01）； 與正常飲食組比較，甜菜堿補(bǔ)充飲食組APP/PS1 小鼠探索隱藏站臺(tái)時(shí)間延長(zhǎng)（P＜0.01），穿越站臺(tái)次數(shù)增加（P＜0.01），見(jiàn)圖1。

圖1 甜菜堿對(duì)APP/PS1 小鼠記憶行為的影響（±s，n＝15）

3.2 甜菜堿對(duì)APP/PS1 小鼠海馬和皮質(zhì)中Aβ 斑塊沉積的影響 與空白對(duì)照組比較，正常飲食組APP/PS1 小鼠海馬和皮質(zhì)中Aβ 斑塊沉積均增多（P＜0.01）； 與正常飲食組比較，甜菜堿補(bǔ)充飲食組APP/PS1 小鼠海馬和皮質(zhì)中Aβ斑塊沉積均減少（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

圖2 甜菜堿對(duì)APP/PS1 小鼠海馬和皮質(zhì)中Aβ 斑塊沉積的影響（免疫熒光，×200，±s，n＝5）

3.3 甜菜堿對(duì)APP/PS1 小鼠海馬神經(jīng)再生的影響 與空白對(duì)照組比較，正常飲食組APP/PS1 小鼠海馬齒狀回（DG）、海馬齒狀回顆粒下區(qū)（SGZ） 中Nestin 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、DCX 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)以及海馬中EdU 陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量降低 （P＜0.01）； 與正常飲食組比較，甜菜堿補(bǔ)充飲食組APP/PS1小鼠DG 和SGZ 中Nestin 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、DCX 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)以及海馬中EdU 陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量增加（P＜0.01），見(jiàn)圖3。

圖3 甜菜堿對(duì)APP/PS1 小鼠海馬神經(jīng)再生的影響（±s，n＝5）

3.4 甜菜堿對(duì)APP/PS1 小鼠海馬神經(jīng)元突觸可塑性的影響 與空白對(duì)照組比較，正常飲食組APP/PS1 小鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元的棘突密度降低（P＜0.01），突觸后誘發(fā)fEPSP 幅值減小，斜率降低 （P＜0.01），海馬PSD-95、SYN、MAP-2 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）； 與正常飲食組比較，甜菜堿補(bǔ)充飲食組APP/PS1 小鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元的棘突密度升高（P＜0.01），突觸后誘發(fā)fEPSP 幅值增大，斜率增高（P＜0.01），海馬PSD-95、SYN、MAP-2 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），見(jiàn)圖4。

圖4 甜菜堿對(duì)APP/PS1 小鼠海馬神經(jīng)元突觸可塑性的影響（±s，n＝5）

4 討論

AD 是發(fā)生于老年群體的原發(fā)性神經(jīng)退行性疾病。我國(guó)有超1 000 萬(wàn)例AD 患者，且隨著老齡化加劇，AD 的發(fā)病率不斷上升，預(yù)計(jì)到2050 年可達(dá)到2 800 萬(wàn)［9］。AD 的病理機(jī)制非常復(fù)雜，迄今仍不清楚，還未找到有效的治療方案。研究表明飲食因素與AD 的發(fā)生有關(guān)［10］，例如地中海飲食可降低54%的AD 發(fā)生率并降低Aβ 沉積［11］。這些結(jié)果突出了飲食干預(yù)可能是降低AD 發(fā)病率和減緩AD 進(jìn)展的途徑之一。甜菜堿一直被作為食品添加劑或增色劑使用，無(wú)毒副作用，且已有研究報(bào)道富含牛磺酸、半胱氨酸、葉酸、甜菜堿的飲食能降低AD 的潛在發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［12］。APP/PS1 小鼠是目前國(guó)內(nèi)外較公認(rèn)且研究最深入的AD 轉(zhuǎn)基因模型鼠之一［13］。本研究結(jié)果顯示，甜菜堿補(bǔ)充飲食可改善APP/PS1 小鼠的記憶功能障礙，此與前人的研究一致。AD 的主要病理特征為多個(gè)腦區(qū)出現(xiàn)過(guò)度沉積的Aβ 斑塊［14］，APP/PS1 小鼠APP基因突變導(dǎo)致Aβ 過(guò)度沉積［13］。本研究用免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明了甜菜堿補(bǔ)充飲食可降低APP/PS1 小鼠海馬和皮質(zhì)中Aβ 沉積。以上結(jié)果表明，甜菜堿補(bǔ)充飲食是潛在的減緩AD 進(jìn)展的治療策略。

AD 患者海馬區(qū)是腦內(nèi)神經(jīng)元易受損傷和突觸可塑性影響的主要腦區(qū)之一。成年海馬DG 區(qū)存在神經(jīng)干細(xì)胞，其位于海馬門(mén)區(qū)與顆粒細(xì)胞層間的下顆粒帶，并且終生保持著增殖分化的能力［15］。DG 的神經(jīng)發(fā)生在AD 疾病中有著重要作用，AD 患者腦內(nèi)新生神經(jīng)元明顯減少［15］。本研究結(jié)果顯示甜菜堿補(bǔ)充飲食可明顯增加APP/PS1 小鼠海馬中神經(jīng)發(fā)生和增殖。另外，突觸功能障礙和缺失與AD 中海馬神經(jīng)功能發(fā)生缺陷以及Aβ 進(jìn)行性堆積有關(guān)［16］。棘突是與另外一個(gè)神經(jīng)元突起的終末支和樹(shù)突形成突觸的接觸點(diǎn)。本研究顯示，甜菜堿補(bǔ)充飲食可明顯增加APP/PS1 小鼠海馬神經(jīng)中棘突密度。LTP 被認(rèn)為是在大腦中儲(chǔ)存記憶的一種突觸機(jī)制［17］。因此，甜菜堿補(bǔ)充飲食增強(qiáng)LTP 可以解釋APP/PS1 小鼠的突觸恢復(fù)和行為改善的結(jié)果。海馬內(nèi)的突觸結(jié)構(gòu)或/和功能障礙是AD 認(rèn)知功能?chē)?yán)重受損的原因之一，而增強(qiáng)海馬神經(jīng)元突觸可塑性可改善神經(jīng)元傳導(dǎo)功能和認(rèn)知功能［18-20］。本研究顯示，攝食甜菜堿后，APP/PS1小鼠海馬中突觸可塑性相關(guān)的重要蛋白標(biāo)記物PSD-95、SYN 和MAP-2 也呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì)，這些結(jié)果表明甜菜堿補(bǔ)充飲食可以挽救突觸損傷。

另外，本研究采用的甜菜堿劑量設(shè)定參考文獻(xiàn)［6-7］報(bào)道劑量范圍的IC50值，而在進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)時(shí)候未設(shè)置劑量梯度，這使得本研究具有一定的缺陷。因此，今后仍需通過(guò)不同的AD 模型并選擇多種劑量梯度來(lái)考察甜菜堿補(bǔ)充飲食對(duì)AD 的影響。

綜上所述，盡管本研究還存在一定的局限性，但目前結(jié)果顯示甜菜堿補(bǔ)充飲食可改善APP/PS1 小鼠記憶功能受損，并減少海馬和皮質(zhì)中淀粉樣斑塊沉積，增加海馬神經(jīng)發(fā)生和突觸可塑性，提示了甜菜堿補(bǔ)充飲食將可能是具有前景的AD 飲食方案。