補(bǔ)陽(yáng)還五湯通過(guò)Cav-1 抑制鐵死亡對(duì)腦缺血小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用

劉英飛，陳博威，田豐銘，歐陽(yáng)銀，易 健，劉柏炎，4?

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208； 2.益陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院，湖南 益陽(yáng) 413046；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410021； 4.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410013）

腦缺血為一種常見的腦血管疾病，是全球致死和成人致殘的主要原因，嚴(yán)重威脅人類的健康，給患者及其家庭、社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1］，但目前仍缺乏有效的治療手段，因此進(jìn)一步闡明腦缺血后病理機(jī)制以及開發(fā)有效的神經(jīng)保護(hù)制劑成為目前亟需解決的問題。研究表明鐵死亡參與腦缺血病理過(guò)程并加重腦組織損傷，而使用鐵死亡抑制劑可改善腦缺血預(yù)后［2］。Cav-1 為位于細(xì)胞膜表面質(zhì)膜凹陷，是胞膜窖（caveolae） 的標(biāo)志性蛋白和功能蛋白，為體內(nèi)外細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)樞紐。既往研究發(fā)現(xiàn)Cav-1 可調(diào)控鐵死亡而發(fā)揮作用； Cav-1 抑制鐵死亡減輕急性肝炎小鼠肝細(xì)胞損傷［3］； Tang 等［4］發(fā)現(xiàn)Cav-1 可抑制神經(jīng)元鐵死亡，從而改善認(rèn)知功能。

補(bǔ)陽(yáng)還五湯作為治療腦缺血的經(jīng)典名方，其療效性和安全性已得到充分證明［5-7］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯可通過(guò)Cav-1 發(fā)揮抗腦缺血損傷作用［8-9］，但是補(bǔ)陽(yáng)還五湯是否通過(guò)Cav-1 調(diào)控鐵死亡而發(fā)揮抗缺血作用，目前仍不清楚。因此，本研究擬以Cav-1 KO 和同源WT 小鼠作為研究對(duì)象，采用MCAO 法復(fù)制腦缺血模型，觀察補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦缺血小鼠病理形態(tài)以及鐵死亡相關(guān)分子的影響，研究其可能的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性KO （Cav-1－/－） 與同源WT （Cav-1＋/＋） C57BL/6J 小鼠，6～8 周齡，體質(zhì)量25 ～30 g。Cav-1雜合子（Cav-1＋/－） 小鼠引種自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （湘） 2018-0008］，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF 級(jí)動(dòng)物房［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK （湘） 2020-0010） ］，小鼠子代經(jīng)PCR 鑒定為KO 與同源WT 小鼠后納入實(shí)驗(yàn)［10］。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)ZYFY20221111-04）。

1.2 藥物 黃芪飲片（批號(hào)CK21110807）、赤芍飲片（批號(hào)CK21111703）、川芎飲片（批號(hào)2108221）、桃仁飲片（批號(hào)2020050402）、當(dāng)歸飲片（批號(hào)TH21111711）、地龍飲片（批號(hào)2109142） 及紅花飲片（批號(hào)2109223） 均購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，并經(jīng)本院中心實(shí)驗(yàn)室中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)平臺(tái)龍紅萍副研究員鑒定為正品。

1.3 試劑 組織鐵測(cè)定試劑盒（貨號(hào)A039-2-1）、還原型谷胱甘肽測(cè)定試劑盒（貨號(hào)A006-1-1）、丙二醛測(cè)定試劑盒（貨號(hào)A003-1-2） 及超氧化物歧化酶測(cè)定試劑盒（貨號(hào)A001-3） 均購(gòu)自南京建成生物工程研究所； 動(dòng)物RNA 抽提取試劑盒 （貨號(hào) R002）、cDNA 合成試劑盒 （貨號(hào)R7170M） 及SYBR Green qPCR Mix （貨號(hào)D7260） 均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司； GPX4 多克隆抗體（貨號(hào)14432-1AP） 購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司； HRP-山羊抗兔IgG （貨號(hào)BA1054） 購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.4 儀器 智能組織切片成像系統(tǒng)（美國(guó)Akoya Bioscienc公司，型號(hào)Vectra3）； 熒光定量PCR 儀（德國(guó)Eppendorf公司，型號(hào)Realplex2）； 梯度PCR 擴(kuò)增儀（美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)T100）； 電鏡（日本日立公司，型號(hào)HT7700）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛公司，型號(hào)Enspire）； 高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Hermle 公司，型號(hào)Z32HK）。

2 方法

2.1 補(bǔ)陽(yáng)還五湯制備 將黃芪、當(dāng)歸、赤芍、地龍、川芎、桃仁和紅花按120 ∶6 ∶4.5 ∶3 ∶3 ∶3 ∶3 比例混合，加入5 倍體積量蒸餾水浸泡1 h，先武火煎0.5 h，然后文火煎1.5 h，用三層紗布過(guò)濾藥液； 再次加入3 倍體積量蒸餾水，用上述方法煎煮及過(guò)濾，最后將2 次濾液混勻，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將藥液濃縮至生藥量2 g/mL。濃縮液經(jīng)課題組前期UPLC-Q-TOFMS 檢測(cè)出21 種成分，其中黃芪甲苷Ⅳ、芒柄花素、阿魏酸、芍藥內(nèi)酯苷質(zhì)量濃度分別為78.1、46.7、45.6、468.4 μg/mL［11］。

2.2 MCAO 模型建立 采用改良的大腦中動(dòng)脈栓塞法制備腦缺血模型［12］，小鼠術(shù)前禁食12 h，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉后固定小鼠，切開皮膚，鈍性分離左側(cè)頸總、頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸總動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈，于頸總動(dòng)脈近心端剪一小切口，將線栓經(jīng)切口處送入頸內(nèi)動(dòng)脈，當(dāng)線栓上黑色標(biāo)記點(diǎn)恰好位于頸總動(dòng)脈分叉口時(shí)固定線栓，消毒并縫合皮膚。假手術(shù)組小鼠僅切開皮膚并分離血管，隨后縫合皮膚。小鼠麻醉清醒后2 h，參照Longa 法［13］對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，評(píng)分為1～3 分者納入研究對(duì)象。

2.3 分組和給藥 將KO 和同源WT 小鼠分別隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯組，每組18 只。補(bǔ)陽(yáng)還五湯組于造模后1 d 灌胃給予補(bǔ)陽(yáng)還五湯，根據(jù)課題組前期研究基礎(chǔ)［8，14］，確定其給藥質(zhì)量濃度為18.5 g/kg，其余各組灌胃等量蒸餾水，連續(xù)灌胃7 d。

2.4 取材 末次灌胃給藥1 h 后，每組隨機(jī)選取6 只小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。然后麻醉處死全部小鼠留取腦組織，隨機(jī)選取6 只用于病理形態(tài)學(xué)及免疫組化等指標(biāo)檢測(cè)； 6只用于RT-qPCR 檢測(cè)； 其余6 只用于相關(guān)試劑盒相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

2.5 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 采用改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分（modified neurological deficit score，mNSS） 對(duì)小鼠神經(jīng)功能缺損進(jìn)行評(píng)估［15］，該評(píng)分內(nèi)容涉及感覺、運(yùn)動(dòng)及反射等方面，總分為18 分，0 分代表無(wú)神經(jīng)功能缺損，評(píng)分越高，說(shuō)明神經(jīng)損傷越嚴(yán)重。

2.6 HE 染色觀察腦組織病理變化 取全腦于4% 多聚甲醛中浸泡、固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、烤片，然后脫蠟至水，以蘇木精-伊紅（HE） 染色后自來(lái)水沖水，脫水透明后封片，使用智能組織切片成像系統(tǒng)進(jìn)行全片掃描，隨機(jī)選取皮質(zhì)缺血區(qū)域內(nèi)3 個(gè)不同區(qū)域拍照并保存圖片。

2.7 尼氏染色觀察神經(jīng)元結(jié)構(gòu) 將腦組織石蠟切片脫蠟至水，然后使用尼氏染液進(jìn)行染色，脫水透明后封片，使用智能組織切片成像系統(tǒng)進(jìn)行全片掃描，隨機(jī)選取皮質(zhì)缺血區(qū)域內(nèi)3 個(gè)不同區(qū)域拍照并保存圖片。

2.8 透射電鏡觀察腦組織線粒體結(jié)構(gòu) 冰上取缺血側(cè)皮層腦組織塊約1 mm3，然后立即置于電鏡固定液中避光固定，4 ℃過(guò)夜，經(jīng)室溫脫水、滲透包埋、聚合、超薄切片、染色，在透射電子顯微鏡下觀察線粒體形態(tài)，并采集圖像。

2.9 腦組織鐵、GSH、MDA 水平及SOD 活性檢測(cè) 準(zhǔn)確稱取25 mg 缺血側(cè)皮層腦組織，加入9 倍量生理鹽水，冰水浴條件下勻漿，2 500 r/min 離心10 min，取上清液待測(cè)。根據(jù)BCA 試劑盒說(shuō)明書測(cè)定蛋白濃度，按照組織鐵、GSH、MDA 以及SOD 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)試劑盒提供的公式計(jì)算腦組織鐵、GSH、MDA 水平及SOD活性。

2.10 免疫組化法檢測(cè)腦組織GPX4 蛋白表達(dá) 取全腦組織石蠟切片，依次脫蠟至水、熱抗原修復(fù)及封閉，分別加入GPX4 一抗（1 ∶100） 4 ℃孵育過(guò)夜，滴加含HRP 的二抗，室溫避光孵育1 h，PBS 沖洗后封片。使用智能組織切片成像系統(tǒng)進(jìn)行全片掃描，隨機(jī)選取缺血區(qū)域3 個(gè)不同視野拍照并保存照片，運(yùn)用Image J 圖像分析軟件計(jì)算其蛋白表達(dá)量。

2.11 RT-qPCR 法檢測(cè)腦組織GPX4 mRNA 表達(dá) 稱取20 mg 缺血側(cè)腦組織置于1.5 mL 離心管中，迅速加入預(yù)冷裂解液300 μL，勻漿，通過(guò)離心柱法抽提RNA，然后將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在熒光定量系統(tǒng)中采用兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性2 min； 95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。熔解曲線反應(yīng)條件為95 ℃15 s，60 ℃15 s，95 ℃15 s。引物由生工生物工程（上海） 股份有限公司設(shè)計(jì)并合成，序列見表1。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2－ΔΔCT法計(jì)算GPX4 mRNA 相對(duì)表達(dá)。

表1 引物序列

2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)GraphPad Prism 9 軟件進(jìn)行處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s） 表示，多組間比較采用方差分析，隨后采用Turkey 進(jìn)行事后檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)Cav-1－/－腦缺血小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的影響 與同基因型假手術(shù)組比較，WT 和KO 模型組小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分升高 （P＜0.01）； 與同基因型模型組比較，WT 和KO 補(bǔ)陽(yáng)還五湯組小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分降低（P＜0.01）； KO 模型組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分高于WT 模型組（P＜0.05），KO 補(bǔ)陽(yáng)還五湯組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分高于WT 補(bǔ)陽(yáng)還五湯組（P＜0.01），見表2。

表2 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)Cav-1－/－腦缺血小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的影響（±s，n＝6）

表2 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)Cav-1－/－腦缺血小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的影響（±s，n＝6）

注： 與同基因型假手術(shù)組比較，??P＜0.01； 與同基因型模型組比較，△△P＜0.01； 與WT 模型組比較，◇P＜0.05； 與WT 補(bǔ)陽(yáng)還五湯組比較，＃＃P＜0.01。

組別神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分/分WTKO假手術(shù)組00模型組6.17±0.69??7.5±0.55??◇補(bǔ)陽(yáng)還五湯組0.67±0.52△△3.83±1.17△△＃＃

3.2 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)Cav-1－/－腦缺血小鼠腦組織病理形態(tài)的影響 HE 染色結(jié)果顯示，與同基因型假手術(shù)組比較，WT、KO 模型組小鼠缺血側(cè)皮質(zhì)神經(jīng)元排列不規(guī)整，細(xì)胞間隙增寬、水腫，存在空泡，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮，甚至核碎裂； 與同基因型模型組比較，WT、KO 補(bǔ)陽(yáng)還五湯組小鼠缺血側(cè)皮質(zhì)神經(jīng)元排列相對(duì)規(guī)整，細(xì)胞間隙減小，核仁較清晰；與WT 模型組比較，KO 模型組小鼠缺血側(cè)皮質(zhì)神經(jīng)元出現(xiàn)大量核固縮及空泡； 與WT 補(bǔ)陽(yáng)還五湯組比較，KO 補(bǔ)陽(yáng)還五湯組小鼠缺血側(cè)皮質(zhì)神經(jīng)元排列相對(duì)欠規(guī)整，存在更多空泡，見圖1。尼氏染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組小鼠皮層神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，邊界清晰，可見大量呈深藍(lán)色顆?；虬邏K狀尼氏體，核呈藍(lán)色； WT、KO 模型組小鼠神經(jīng)元結(jié)構(gòu)紊亂，可見細(xì)胞腫脹，甚至呈空泡樣改變，細(xì)胞核固縮，甚至核碎裂等，尼氏體數(shù)量減少（P＜0.01）； 與WT 模型組比較，KO 模型組表現(xiàn)出更嚴(yán)重的神經(jīng)元損傷，尼氏體數(shù)量更少（P＜0.05）； 與WT 補(bǔ)陽(yáng)還五湯組比較，KO 補(bǔ)陽(yáng)還五湯組尼神經(jīng)元損傷嚴(yán)重，尼氏體數(shù)量減少（P＜0.01），見圖2。

圖1 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)Cav-1－/－腦缺血小鼠腦組織病理形態(tài)的影響（HE，×400）

圖2 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)Cav-1－/－腦缺血小鼠神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)的影響（尼氏染色，×400，±s，n＝6）

3.3 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)Cav-1－/－腦缺血小鼠腦組織線粒體形態(tài)的影響 與假手術(shù)組比較較，模型組腦缺血區(qū)域線粒體變小、水腫嚴(yán)重，線粒體膜密度增加，嵴減少甚至消失，線粒體外膜破裂等，其中KO 模型組線粒體損傷更嚴(yán)重； 給予補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)后，線粒體形態(tài)改善，但KO 補(bǔ)陽(yáng)還五湯組線粒體形態(tài)改善不如WT 補(bǔ)陽(yáng)還五湯組，仍可見部分線粒體水腫、線粒體嵴減少、線粒體膜密度增加等，見圖3。

圖3 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)Cav-1－/－腦缺血小鼠腦組織線粒體形態(tài)學(xué)的影響（n＝3）

3.4 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)Cav-1－/－腦缺血小鼠腦組織鐵水平及脂質(zhì)過(guò)氧化的影響 與同基因型假手術(shù)組比較，WT、KO 模型組小鼠腦組織GSH 水平和SOD 活性降低（P＜0.01），MDA 和鐵水平升高（P＜0.01）； 與同基因模型組比較，WT、KO 補(bǔ)陽(yáng)還五湯組小鼠腦內(nèi)腦組織GSH 水平和SOD 活性升高（P＜0.05，P＜0.01），MDA 和鐵水平降低 （P＜0.05，P＜0.01）； 與WT 模型組比較，KO 模型組小鼠腦組織GSH 水平和SOD 活性降低（P＜0.05），MDA 和鐵水平升高（P＜0.05）； 與WT 補(bǔ)陽(yáng)還五湯組比較，KO 補(bǔ)陽(yáng)還五湯組小鼠腦組織GSH 水平和SOD 活性降低（P＜0.01），MDA和鐵水平升高（P＜0.01），見圖4。

圖4 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)Cav-1－/－腦缺血小鼠腦組織鐵、GSH、MDA 水平及SOD 活性的影響（±s，n＝6）

3.5 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)Cav-1－/－腦缺血小鼠腦組織GPX4 蛋白和mRNA 表達(dá)的影響 與同基因型假手術(shù)組比較，WT、KO 模型組小鼠腦組織GPX4 蛋白及mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01）； 與同基因型模型組比較，WT、KO 補(bǔ)陽(yáng)還五湯組小鼠腦組織GPX4 蛋白及mRNA 表達(dá)升高 （P＜0.05，P＜0.01）； 與WT 模型組比較，KO 模型組小鼠腦組織GPX4蛋白及mRNA 表達(dá)降低（P＜0.05）； 與WT 補(bǔ)陽(yáng)還五湯組比較，KO 補(bǔ)陽(yáng)還五湯組腦組織GPX4 蛋白及mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01），見圖5。

圖5 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)Cav-1－/－腦缺血小鼠腦組織GPX4 蛋白及mRNA 表達(dá)的影響（±s，n＝6）

4 討論

腦缺血屬于中醫(yī)“缺血性中風(fēng)” 范疇，病因病機(jī)多為風(fēng)、火、痰、瘀等留滯經(jīng)絡(luò)，氣血運(yùn)動(dòng)不暢，其中氣虛血瘀為其重要的病理因素［16］。補(bǔ)陽(yáng)還五湯出自《醫(yī)林改錯(cuò)》，為治療缺血性中風(fēng)氣虛血瘀證的經(jīng)典方劑。該方由黃芪、當(dāng)歸尾、地龍、川芎、赤芍、桃仁和紅花等組成，方中重用黃芪為君藥，大補(bǔ)元?dú)猓箽馔校?臣以當(dāng)歸尾活血化瘀而不傷血，佐以川芎、赤芍、桃仁、紅花等藥物行氣活血，地龍通絡(luò)，全方共湊益氣活血通絡(luò)之功效，具有氣旺血行、活血而不傷正等特點(diǎn)。本研究表明，補(bǔ)陽(yáng)還五湯能降低神經(jīng)功能缺損評(píng)分，改善缺血區(qū)域病理形態(tài)而發(fā)揮抗腦缺血損傷作用，說(shuō)明補(bǔ)陽(yáng)還五湯具有抗腦缺血損傷作用。

腦缺血后病理機(jī)制復(fù)雜，如氧化應(yīng)激、鈣超載、興奮性氨基酸毒性、炎癥等，伴隨凋亡、自噬、焦亡等多種細(xì)胞死亡形式［17-18］。鐵死亡是一種非經(jīng)典細(xì)胞死亡方式，以鐵依賴的脂質(zhì)過(guò)氧化為特征，在腦缺血病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。GPX4 為鐵死亡的標(biāo)志性蛋白，它以GSH 為底物，將有毒的脂質(zhì)過(guò)氧化物轉(zhuǎn)化為無(wú)毒的脂質(zhì)醇，從而維持體內(nèi)氧化還原體系平衡［19］。既往研究表明，腦缺血后鐵水平增加，GSH 及GPX4 水平降低，增加腦內(nèi)GPX4 表達(dá)量能改善腦缺血預(yù)后［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠缺血側(cè)腦組織內(nèi)線粒體變小，水腫嚴(yán)重，嵴減弱甚至消失，呈典型的鐵死亡線粒體形態(tài)學(xué)變化。腦組織鐵、MDA 水平增加，而GSH、SOD 和GPX4 水平減少，以上結(jié)果表明鐵死亡參與腦缺血病理過(guò)程。補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)后能改善線粒體形態(tài)，降低腦組織鐵和MDA 水平，增加GSH、SOD 和GPX4 水平，提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯可能通過(guò)抑制神經(jīng)元鐵死亡而發(fā)揮抗腦缺血損傷作用。

Cav-1 為caveolae 的重要結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，通過(guò)其腳手架結(jié)構(gòu)域激活下游信號(hào)分子，廣泛參與細(xì)胞增殖、遷移以及胞吞、脂質(zhì)代謝、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過(guò)程［21］。Cav-1 在腦內(nèi)神經(jīng)元中表達(dá)豐富，不僅參與大腦發(fā)育，而且在腦缺血病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用［22］。有研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Cav-1 可減輕缺氧條件下海馬神經(jīng)元凋亡［23］，而敲除Cav-1 會(huì)增加腦缺血小鼠的梗死面積及血腦屏障的通透性，從而加重腦缺血［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，與WT 模型組小鼠比較，Cav-1 KO 模型小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損癥狀及缺血區(qū)域神經(jīng)元損傷，這與既往研究一致。同時(shí)，敲除Cav-1可在一定程度上削弱補(bǔ)陽(yáng)還五湯的抗腦缺血損傷作用，說(shuō)明補(bǔ)陽(yáng)還五湯可能通過(guò)Cav-1 發(fā)揮抗腦缺血損傷作用。在本研究中，與WT 模型組小鼠比較，Cav-1 KO 小鼠腦缺血后表現(xiàn)出更嚴(yán)重的線粒體損傷，腦內(nèi)鐵和MDA 水平增加，而GSH、SOD 及GPX4 水平減少，并且Cav-1 KO 能在一定程度上逆轉(zhuǎn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯抑制鐵死亡的效果。以上結(jié)果表明，Cav-1 缺失能促進(jìn)腦內(nèi)鐵死亡，補(bǔ)陽(yáng)還五湯可能通過(guò)Cav-1抑制鐵死亡而發(fā)揮抗缺血性腦損傷作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Cav-1 敲除進(jìn)一步加重腦缺血后鐵死亡，而補(bǔ)陽(yáng)還五湯可能通過(guò)Cav-1 抑制鐵死亡而發(fā)揮保護(hù)腦缺血的作用，但補(bǔ)陽(yáng)還五湯通過(guò)Cav-1 調(diào)控鐵死亡的下游靶點(diǎn)不明確，這將是課題組下一步研究的重點(diǎn)。