涼粉草浸膏噴霧干燥工藝優化

謝 平，溫仁華，魏海峰，沈金海，3，郝春莉，3?，陳良華

（1.四川大學華西廈門醫院科技部，福建 廈門 361022； 2.廈門華廈學院環境與公共健康學院，福建 廈門 361024； 3.廈門市食品藥品安全重點實驗室，福建 廈門 361024； 4.福建省亞熱帶植物研究所，福建 廈門 361006）

涼粉草（MesonachinensisBenth.） 又名仙草，為唇形科涼粉草屬一年或多年生草本植物［1］，主要成分有黃酮類、酚類、多糖等，具有抗腫瘤、降血壓、抗氧化、抗炎等作用［2-3］。

噴霧干燥是一種干燥藥材提取液的方法，具有速度快、有效成分破壞少等特點，工藝條件直接影響到浸膏粉的貯存、后續的制粒等流程。由于藥材成分較為復雜，影響因素通常不止1 個，需考察的指標較多，因此通過多因素多目標進行優化。在優化過程中需考慮各指標權重，通常通過主觀或客觀賦權確定指標權重，G1 法是一種主觀評價方法與層次分析法相比，計算速度更快、無需一致性檢驗［4-5］； CRITIC 法是通過實際數據所反映的客觀信息確定權重的客觀方法［6-7］。通過組合權重可避免數據出現較大偏差，同時減少人為因素的影響； BP 神經網絡模擬人腦神經結構，通過反向傳播不斷調整網絡，在不知曉具體數學模型的情況下進行尋優［8-11］。

本實驗采用G1 法結合CRITIC 法計算出粉率、含水量、5 種指標成分含量及總黃酮含量的權重系數，以計算所得的綜合評分為評價指標，利用BP 人工神經網絡模型結合Box-Behnken 響應面法進行優化，驗證其可行性，確定最優的噴霧干燥工藝，為涼粉草的應用與開發提供參考。

1 材料

1.1 儀器 YC-1800 型噴霧干燥機（上海雅程儀器有限公司）； LC-20A 型高效液相色譜儀、UV-2450 型紫外可見分光光度計（日本島津公司）； DHG-9076A 型電熱鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）； JB/T5374-1991 型電子天平［奧豪斯國際貿易（上海） 有限公司］； BSA224S 型電子天平［萬分之一，賽多利斯科學儀器（北京） 有限公司］； XS205 型電子天平［十萬分之一，梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司］； HH-2 型恒溫水浴鍋（江蘇常州華普達有限公司）。

1.2 試劑與藥物 涼粉草（產地福建龍巖武平） 購自藥材市場，經廈門華廈學院賴源發副教授鑒定為唇形科涼粉草MesonachinensisBenth.的干燥全草。咖啡酸 （批號D18121724，純度≥98%）、丹酚酸B （批號D18102409，純度≥98%）、紫草酸 （批號D19041017，純度≥98%）、紫云英苷（批號D19012403，純度≥98%） 對照品均由南京狄爾格醫藥科技有限公司提供； 迷迭香酸 （批號RP180607，純度≥98%）、蘆丁（批號RP190213，純度≥98%） 對照品均由成都麥德生科技有限公司提供。甲醇、乙腈均為色譜純； 其他試劑均為分析純； 水為超純水。

2 方法與結果

2.1 濃縮液制備 根據課題組前期優化的工藝進行提取，將水提液在70 ℃下分別減壓濃縮至相對密度1.04～1.08 的浸膏。

2.2 指標成分含量測定

2.2.1 對照品溶液制備 取咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、紫云英苷、丹酚酸B 對照品適量，甲醇制成質量濃度分別為0.102 0、0.237 0、0.098 0、0.220 0、0.106 0 mg/mL 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取浸膏粉0.1 g，置于25 mL 量瓶中，20% 甲醇溶解，室溫下稀釋至刻度，過濾，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液制備 以20%甲醇為陰性樣品，制成相應溶液，即得。

2.2.4 色譜條件 中譜紅RD-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 體積流量1.0 mL/min； 流動相乙腈（A） -0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0 ～9.5 min，18% A； 9.5 ～18.5 min，18% ～19%A； 18.5～20 min，19% ～20%A； 20～25 min，20% ～22% A； 25 ～35 min，22% ～24% A； 35 ～42 min，24% ～30% A； 42 ～50 min，30% ～18% A）； 柱溫25 ℃； 檢測波長320 nm； 進樣量10 μL。咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B 色譜峰分離度良好（均大于1.5）； 理論塔板數按咖啡酸計，不低于3 000。

2.2.5 專屬性試驗 分別精密吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液10 μL，在“2.2.4” 項色譜條件下進樣測定，發現陰性樣品在出峰位置無干擾，表明該方法專屬性良好，見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.2.6 線性關系考察 分別精密吸取“2.2.1” 項下對照品溶液0.2、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 mL，置于10 mL量瓶中，稀釋至刻度，在“2.2.4” 項色譜條件下進樣測定。以對照品峰面積（Y） 對其質量濃度（X） 進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系

2.2.7 精密度試驗 取“2.2.1” 項下對照品溶液適量，在“2.2.4” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B 峰面積RSD 分別為0.83%、0.17%、0.22%、0.26%、0.32%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩定性試驗 取供試品溶液適量，于0、2、4、6、8、12 h 在“2.2.4” 項色譜條件下進樣測定，測得咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B 峰面積RSD 分別為0.86%、2.74%、1.55%、2.67%、2.57%，表明溶液在12 h 內穩定性良好。

2.2.9 重復性試驗 精密稱取浸膏1 g，按“2.2.2” 項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.2.4” 項色譜條件下進樣測定，測得咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B 峰面積RSD 分別為1.50%、1.66%、1.65%、2.59%、1.76%，表明該方法重復性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 取浸膏約0.05 g，精密稱定，精密加入對照品溶液適量，按“2.2.2” 項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.2.4” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B 平均加樣回收率分別為100.19%、101.18%、100.35%、99.71%、100.08%，RSD 分別為1.62%、1.76%、1.39%、2.78%、2.13%。

2.3 總黃酮含量測定

2.3.1 對照品溶液制備 精密稱取蘆丁對照品適量，甲醇溶解，即得（該成分質量濃度為0.245 0 mg/mL）。

2.3.2 供試品溶液制備 同“2.2.2” 項。

2.3.3 陰性樣品溶液制備 同“2.2.3” 項。

2.3.4 顯色方法、檢測波長選擇 分別精密吸取對照品、供試品溶液各1.0 mL，置于25 mL 量瓶中，依次加入1.0 mL 7.5%NaNO2溶液后放置6 min，1.0 mL 7.5%Al （NO3）3溶液后放置6 min，10.0 mL 4%NaOH 溶液后放置10 min，搖勻，檢測波長200 ～800 nm，空白為缺供試品的顯色體系。結果，兩者均在500 nm 波長處有最大吸收峰，故選擇500 nm 作為檢測波長。

2.3.5 標準曲線繪制 精密吸取對照品溶液適量，逐級稀釋，按“2.3.4” 項下方法測定吸光度。以對照品吸光度（A） 對其質量濃度（X） 進行回歸，得方程為A＝1.01×10－2X＋1.1×10－3（r＝0.999 6），在39.22 ～88.24 μg/mL 范圍內線性關系良好。

2.3.6 精密度試驗 精密吸取“2.3.1” 項下對照品溶液3.0 mL，按“2.3.4” 項下方法測定吸光度6 次，測得其RSD 為0.41%，表明儀器精密度良好。

2.3.7 穩定性試驗 精密吸取供試品溶液適量，于0、5、10、15、20、25、30 min 按“2.3.4” 項下方法測定吸光度，測得其RSD 為2.55%，表明溶液在30 min 內穩定性良好。

2.3.8 重復性試驗 精密稱取浸膏0.1 g，共6 份，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，按“2.3.4” 項下方法測定吸光度，測得其RSD 為1.28%，表明該方法重復性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗 取6 份蘆丁含量已知的浸膏，每份約0.05 g，精密稱定，精密加入對照品適量，按“2.3.4” 項下方法測定吸光度，計算回收率。結果，蘆丁平均加樣回收率為99.28% （RSD＝2.95%）。

2.4 相對密度測定 按2015 年版《中國藥典》 四部通則中“相對密度測定法” 項下第一法（比重瓶法） 進行。

2.5 得粉率測定 取100 mL 涼粉草水煎濃縮液進行噴霧干燥，計算粉末量； 同體積水浴至完全蒸干，在100 ～105 ℃干燥3 h，冷卻，精密稱定，計算含固量。出粉率＝（粉末量/含固量） ×100%。

2.6 含水量測定 按2015 年版《中國藥典》 四部通則中“水分測定法” 項下第二法（烘干法） 進行。

2.7 評價指標的組合賦權

2.7.1 G1 法 根據G1 法，對8 項指標的重要程度排序為含水量＞出粉率＞總黃酮＞咖啡酸＝紫云英苷＝迷迭香酸＝紫草酸＝丹酚酸B （y1＞y2＞y3＞y4＝y5＝y6＝y7＝y8，yk為評價指標），通過rk＝yk－1/yk，k＝n，n－1，…，2 （rk為兩者之間的重要性程度之比）［12］，確定各指標的權重評價標度r，r2＝1.2，r3＝1.2，r4＝1.1，r5＝1.0，r6＝1.0，r7＝1.0，r8＝1.0，由公式（Wk－1＝rkwk，k＝n，n－1，…，2） 計算各指標的主觀權重wk。

2.7.2 CRITIC 法 對比強度以標準差σj體現，沖突性以指標之間相關性Rj體現，結合兩者進行計算，（rij為評價指標i和j之間的相關系數）［13-14］。

將表中的數據進行標準化處理，指標成分＝ （實測值－最小值） /（最大值－最小值），得到相矩陣如下。

表2 各評價指標權重計算結果

2.8 Box-Behnken 響應面法 在單因素試驗基礎上，選擇進風溫度（A）、空氣體積流量（B）、泵數（C） 作為影響因素，含水量（y1）、得粉率（y2）、總黃酮（y3）、咖啡酸（y4）、紫云英苷（y5）、迷迭香酸（y6）、紫草酸（y7）、丹酚酸B （y8） 的綜合評分（Y） 作為評價指標，進行三因素三水平設計，具體見表3，結果見表4。

表3 Box-Behnken 響應面法因素水平

表4 Box-Behnken 響應面法設計與結果

2.9 回歸模型的建立及分析 通過Design Expert 8.0.5b 軟件進行擬合，得綜合評分（Y） 二次多項回歸方程為Y＝0.82－0.021A＋3.700×10－3B＋0.013C＋0.018AB＋8.860 0×10－3AC－0.061BC－0.024A2＋0.018B2＋3.310×10－3C2。再進行方差分析，發現回歸模型的P＜0.05，說明它具有顯著性； 失擬項（P＝0.665 1） 不顯著，說明擬合度良好，可用來分析和預測； 一次項A的P＜0.05，表明其對噴霧干燥工藝影響極顯著； 影響涼粉草噴霧干燥工藝的因素依次為進風溫度＞泵速＞空氣體積流量，見表5。響應面分析見圖2。

表5 方差分析結果

2.10 BP 人工神經網絡研究

2.10.1 模型建立 本實驗建立BP 神經網絡模型（3 層），輸入節點3 個，即進風溫度（A）、空氣體積流量（B）、泵數（C）； 輸出節點1 個，即綜合評分Y。為增加訓練空間內的樣本密度，根據響應面試驗數據，讓每組數據增加8個虛擬樣本（每組數據增加1 個△±X值，X＝±0.2%），其中17 組作為測試樣本，其余作為訓練樣本。

2.10.2 隱含層節點確定 分別建立隱含層單元數為1～10的模型，并利用其平均絕對誤差MAEtrain、平均絕對誤差MAEtext、數據整體均方誤差MSE 等指標進行分析，最終確定隱層節點數為9，見表6。

表6 神經元數目優化結果

2.10.3 尋優 建立輸入層＝3、輸出層＝1、隱藏層＝9 的模型，并對其進行訓練（循環次數＝1 000，學習速率＝0.01，誤差目標＝0.00 001），設置進風溫度、空氣體積流量、泵數3 個因素的步長為1，并設定每個因素定義域，通過Sim 函數進行仿真輸出，尋求輸出最大值及對應組合，優化得最佳噴霧干燥工藝為進風溫度171 ℃，空氣體積流量45 m3/h，泵數12，步距最優值為0.915 1。

2.11 驗證試驗 利用Design Expert 8.0.5 b 軟件得噴霧干燥最佳工藝為進風溫度165.47 ℃，空氣體積流量45.05 m3/h，泵數11.99%，考慮設備參數設定，將其修正為進風溫度165 ℃，空氣體積流量45 m3/h，泵數12%。驗證試驗表明，Box-Behnken 響應面法測得綜合評分平均值為0.915 0，BP 人工神經網絡測得綜合評分平均值為0.915 9，與理論預測值相比無顯著性差異，提示工藝穩定可靠，可用于噴霧干燥，見表7。

表7 驗證試驗結果（n＝3）

3 討論

本實驗通過噴霧干燥方法直接將提取液干燥成粉狀，省去濾過、粉碎等工序，簡化生產工藝，提高效率。本實驗對相對密度、進風溫度、泵數與空氣體積流量進行單因素實驗考察，結果表明當相對密度過大時，出粉率急劇降低、含水量上升，故在后續實驗中選擇藥液相對密度1.06進行考察。由于物料本身極易吸潮，應快速裝入密封袋內，立即放入干燥器中密封保存。

與主客觀賦權（G1-熵權法、AHP-CRITIC 法等） 相關研究比較，主觀賦權G1 法是對主觀賦權代表AHP 的一種優化評價方法［15-18］； 本實驗中水分是噴霧干燥浸膏的基本性質參數，其數值越低越好，其它評價指標值越高越好，客觀賦權CRITIC 法同時考慮了各指標性間的沖突性，因此選擇CRITIC 法進行客觀賦權。

采用基于G1-CRITIC 法的主客觀組合賦權方法，結合Box-Behnken 響應面法回歸方程準確度高的優勢，確保多指標評價結果的科學性和合理性。與BP 神經網絡相關研究比較，采用經G1-CRITIC 法賦權的綜合評分，同時利用人工神經網絡技術的預測與推斷能力，自主學習尋找到大范圍內的最優的工藝條件，不增加試驗次數，同時獲得不同因素的最優組合，節約研究時間與成本，結果更加準確，為其他藥材的干燥工藝提供了一種新的思路，有望應用于藥材提取、干燥、成型等工藝研究中，具有一定的實際開發利用前景［19］。