HPLC 法同時(shí)測(cè)定舒肝利膽丸中5 種成分的含量

畢映燕，李季文，徐志偉，李俊江

（甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050）

舒肝利膽方由醋柴胡、金錢草、白豆蔻、荊芥、生白芍、郁金、天花粉、麩炒枳殼、紫蘇子、白芥子、炙甘草、干姜、大棗等藥味組成，諸藥合用共奏疏肝利膽、清熱祛濕，理氣止痛之功，主要用于慢性膽囊炎的治療。前期為方便患者服用，在保留原物質(zhì)的基礎(chǔ)上擬將其開(kāi)發(fā)為舒肝利膽濃縮丸。

現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，膽囊炎的發(fā)病機(jī)理與炎癥反應(yīng)、代謝紊亂、膽汁滯留等相關(guān)［1］。柴胡中柴胡皂苷具有抗炎，促進(jìn)膽汁酸排泄的作用［2］，為疏肝利膽藥效活性部位。金錢草黃酮類成分具有降低膽汁黏度，促進(jìn)膽汁流動(dòng)的作用［3］。紫蘇子水溶性酚酸類成分迷迭香酸具有保肝的藥理活性［4］。甘草中甘草苷、枳殼中橙皮苷通過(guò)發(fā)揮保肝、抗炎、調(diào)節(jié)代謝等作用［5-9］，達(dá)到治療膽囊炎目的。該方在我院以協(xié)定處方應(yīng)用多年，但尚無(wú)舒肝利膽方及其制劑的質(zhì)量控制報(bào)道，也未見(jiàn)同時(shí)測(cè)定柴胡皂苷a、槲皮素、迷迭香酸、橙皮苷、甘草苷含量的研究。因此，本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定上述5 種有效成分的含量，為全面控制舒肝利膽丸質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器 PEA10 型高效液相色譜儀（美國(guó)珀金埃爾默儀器公司）； HS6150 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； LX 系列電子分析天平（瑞士普利賽斯公司）；HWS26 型電熱恒溫水浴鍋（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）。

1.2 試劑與藥物 舒肝利膽丸 （中試產(chǎn)品，批號(hào)20210701、20210802、20210803） 為甘肅省中醫(yī)院自制。甘草苷（批號(hào)111610-201607，純度98%）、橙皮苷（批號(hào)110721-201818，純度98%）、迷迭香酸 （批號(hào)111871-201706，純度98%）、槲皮素（批號(hào)100081-201610，純度98%）、柴胡皂苷a （批號(hào)20736-09-8，純度98%） 對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈（色譜純，山東禹王集團(tuán)化工分公司）； 甲醇（分析純，天津市博迪化工有限公司）； 磷酸（色譜純，天津大茂化學(xué)試劑廠）；水為實(shí)驗(yàn)室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取對(duì)照品甘草苷21.60 mg、橙皮苷20.50 mg、迷迭香酸41.20 mg、槲皮素0.80 mg、柴胡皂苷a 21.20 mg，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為甘草苷2.16 mg/mL、橙皮苷2.05 mg/mL、迷迭香酸4.12 mg/mL、槲皮素0.08 mg/mL、柴胡皂苷a 2.12 mg/mL 的溶液，即得，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 供試品溶液制備 將舒肝利膽丸置于研缽中，研成細(xì)粉狀，取2.0 g，加甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲（300 W、40 kHz） 提取40 min，室溫下放置20 min，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm 濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得［10］。

2.1.3 陰性樣品溶液制備 按處方配比和生產(chǎn)工藝，分別制備缺醋柴胡、缺金錢草、缺枳殼、缺紫蘇子、缺甘草的陰性樣品，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2 色譜條件 Waters Symmetry Shield 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）； 流動(dòng)相乙腈（A） -0.1% 磷酸（B），梯度洗脫（0～12 min，17% A； 12 ～18 min，17% ～22% A；18～24 min，22% ～30%A； 24～32 min，30% ～38%A； 32 ～45 min，38% ～80%A； 45～55 min，80% ～17%A）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫20 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)0 ～18 min 237 nm（甘草苷），18 ～24 min 283 nm （橙皮苷），24 ～28 min 330 nm （迷迭香酸），28 ～35 min 368 nm （槲皮素），35 ～55 min 210 nm （柴胡皂苷a）； 進(jìn)樣量10 μL［11-13］。

2.3 系統(tǒng)適用性考察和專屬性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，供試品溶液中甘草苷、橙皮苷、迷迭香酸、槲皮素、柴胡皂苷a 保留時(shí)間與對(duì)照品溶液中一致，與相鄰色譜峰分離度大于1.5，陰性無(wú)干擾，理論塔板數(shù)以甘草苷計(jì)不低于4 000，見(jiàn)圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.1” 項(xiàng)下對(duì)照品適量，甲醇逐級(jí)稀釋成系列質(zhì)量濃度，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品峰面積（Y） 對(duì)其質(zhì)量濃度（X） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.5 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液適量，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得甘草苷、橙皮苷、迷迭香酸、槲皮素、柴胡皂苷a 峰面積RSD 分別為1.02%、0.85%、0.62%、0.93%、1.16%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液（批號(hào)20210701） 適量，于0、4、8、12、18、24 h 在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得甘草苷、橙皮苷、迷迭香酸、槲皮素、柴胡皂苷a峰面積 RSD 分別為1.85%、0.95%、1.17%、0.93%、1.16%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好［14］。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品 （批號(hào)20210701） 適量，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得甘草苷、橙皮苷、迷迭香酸、槲皮素、柴胡皂苷a 峰面積RSD 分別為1.73%、1.25%、1.17%、1.81%、1.44%，表明該方法重復(fù)性良好［13-15］。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取本品（批號(hào)20210701）1.0 g，精密加入對(duì)照品溶液（未稀釋） 適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，甘草苷、橙皮苷、迷迭香酸、槲皮素、柴胡皂苷a 的平均加樣回收率分別為100.42%，99.94%，100.54%，102.22%，98.41%，RSD分別為2.59%、1.78%、2.11%、2.81%、2.62%。

2.9 樣品測(cè)定 取3 批樣品，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各成分含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n＝3）

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 采用A10 PAD 檢測(cè)器，對(duì)甘草苷、橙皮苷、迷迭香酸、槲皮素、柴胡皂苷a 進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)最大吸收波長(zhǎng)分別為237、283、330、368、210 nm。比較不同波長(zhǎng)下色譜圖，發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)對(duì)所測(cè)成分的干擾較少，并且較易檢出。為提高分離度，結(jié)合所測(cè)成分出峰時(shí)間，確定波長(zhǎng)切換方式為0 ～18 min 237 nm （甘草苷），18 ～24 min 283 nm （橙皮苷），24 ～28 min 330 nm （迷迭香酸），28～35 min 368 nm （槲皮素），35～55 min 210 nm （柴胡皂苷a）［16-17］。

3.2 流動(dòng)相、色譜柱選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、乙腈分別與不同體積分?jǐn)?shù)的磷酸、甲酸、醋酸溶液組成的流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)乙腈作為有機(jī)相時(shí)基線較平穩(wěn)，進(jìn)一步篩選乙腈與不同濃度磷酸、甲酸、醋酸組成的流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)迷迭香酸在磷酸系統(tǒng)下峰對(duì)稱性優(yōu)于甲酸、醋酸系統(tǒng)，因此選擇乙腈-0.1%磷酸作為流動(dòng)相，并分別比較Agilent C18、Waters C18、Kromasil C18色譜柱，發(fā)現(xiàn)3 種色譜柱均可用于含量測(cè)定［18-24］。

3.3 提取方法選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了回流，超聲，浸漬提取方式對(duì)5 種有效成分提取率的影響，發(fā)現(xiàn)浸漬提取方式提取率低、耗時(shí)長(zhǎng)，回流、超聲提取對(duì)5 種成分提取率影響較小，但后者操作簡(jiǎn)便，故選用超聲提取［25-27］。分別比較超聲提取20、40、60 min 對(duì)5 種成分的影響，發(fā)現(xiàn)40、60 min 對(duì)提取率影響不大，因此選擇40 min 作為提取時(shí)間。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定甘草苷、橙皮苷、迷迭香酸、槲皮素、柴胡皂苷a 的含量，該方法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，可用于舒肝利膽丸的質(zhì)量控制，同時(shí)也為其他醫(yī)院制劑質(zhì)量控制提升提供參考。