膚癢顆粒中9 種成分含量同時(shí)測(cè)定及其化學(xué)模式識(shí)別研究

肖春霞，黃曉婧，許 莉，李婷婷，李 及，趙小勤

（成都市藥品檢驗(yàn)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥材質(zhì)量監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610045）

膚癢顆粒由蒼耳子（炒、去刺）、地膚子、川芎、紅花、白英5 味中藥組成，具有祛風(fēng)活血、除濕止癢功效，用于治療皮膚搔癢、濕疹、蕁麻疹等皮膚病［1］，目前該制劑質(zhì)量執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)收錄于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)（中藥成方制劑） 》第六冊(cè)，但只有性狀項(xiàng)、理化鑒別項(xiàng)、制劑通則檢查項(xiàng)，無(wú)專屬性質(zhì)量控制項(xiàng)目［1］，而局頒標(biāo)準(zhǔn)中的含量測(cè)定項(xiàng)也僅涉及阿魏酸或羥基紅花黃色素A，難以有效控制其整體質(zhì)量［2］。本實(shí)驗(yàn)選擇膚癢顆粒中蒼耳子、紅花、川芎、白英特征性成分，包括新綠原酸、咖啡酸、綠原酸、隱綠原酸、羥基紅花黃色素A、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯A，采用UHPLC 法測(cè)定其含量［3-4］，并進(jìn)行化學(xué)模式識(shí)別［5-6］，以期為更全面地控制該制劑質(zhì)量提供參考。

1 材料

Waters Acquity H class 超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）； XPE26 電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，0.001 mg）； AUX220 電子天平（日本島津公司，0.1 mg）； SK250H 超聲儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）； 20～200 μL 移液槍（德國(guó)Eppendorf 公司）； 超純水制備系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）。

綠原酸（純度96.8%，批號(hào)110753-201817）、咖啡酸（純度99.7%，批號(hào)110885-201703）、羥基紅花黃色素A （純度93.1%，批號(hào)111637-201810）、阿魏酸 （純度99.4%，批號(hào)110773-201915） 對(duì)照品均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供； 新綠原酸對(duì)照品 （ 純度≥98%，批號(hào)19042305） 由成都普菲德生物技術(shù)有限公司提供；隱綠原酸對(duì)照品 （純度99.1%，批號(hào)MUST-20042403） 由成都曼斯特生物科技有限公司提供；洋川芎內(nèi)酯I （純度≥98.0%，CAS 號(hào)94596-28-8，批號(hào)CFS202002）、洋川芎內(nèi)酯H （純度≥98.0%，CAS 號(hào)94596-27-7，批號(hào)CFS202001）、洋川芎內(nèi)酯A （純度≥98.0%，CAS 號(hào)62006-39-7，批號(hào)CFS202002） 對(duì)照品均由上海源葉生物科技有限公司提供。

乙腈為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司； 磷酸為色譜純，購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲醇為分析純，購(gòu)自廣東光華科技股份有限公司；水為超純水。

膚癢顆粒共120 批，來(lái)自6 家企業(yè)，具體見(jiàn)表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters Acquity UPLC ? BEH C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）； 流動(dòng)相乙腈（A） -0.01% 磷酸 （B），梯度洗脫 （0 ～25 min，3% ～4%A； 25 ～30 min，4% ～10%A； 30 ～40 min，10% ～18% A； 40 ～48 min，18% ～30% A； 48 ～55 min，30% ～50% A； 55 ～58 min，50% ～70% A；58～60 min，70%A）； 體積流量0.4 mL/min； 柱溫35 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)0 ～21 min 325 nm，21 ～25 min 390 nm，25～40 min 322 nm，40 ～60 min 278 nm；進(jìn)樣量1 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取咖啡酸、洋川芎內(nèi)酯H 對(duì)照品適量，25%甲醇制成每1 mL 分別含兩者0.638 6、0.286 5 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液①； 精密稱取洋川芎內(nèi)酯I 對(duì)照品適量，25%甲醇制成每1 mL 含0.804 5 mg 該成分的溶液，作為對(duì)照品溶液②； 精密稱取洋川芎內(nèi)酯A 對(duì)照品適量，25%甲醇制成每1 mL 含0.743 6 mg 該成分的溶液，作為對(duì)照品溶液③； 精密稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、羥基紅花黃色素A、阿魏酸對(duì)照品適量，置于25 mL 量瓶中，25%甲醇溶解，精密加入對(duì)照品溶液①、③各1 mL，對(duì)照品溶液②2.5 mL，25%甲醇定容至刻度，即得每1 mL 分別含新綠原酸0.203 9 mg、咖啡酸0.025 5 mg、綠原酸0.384 9 mg、隱綠原酸0.403 5 mg、羥基紅花黃色素A 0.621 9 mg、阿魏酸0.095 9 mg、洋川芎內(nèi)酯I 0.080 5 mg、洋川芎內(nèi)酯H 0.011 5 mg、洋川芎內(nèi)酯A 0.029 7 mg 的貯備液，精密吸取1.25 mL，置于50 mL 量瓶中，25% 甲醇稀釋至刻度，即得每1 mL分別含新綠原酸5.097 5 μg、咖啡酸0.637 5 μg、綠原酸9.622 5 μg、隱綠原酸10.087 5 μg、羥基紅花黃色素A 15.547 5 μg、阿魏酸2.397 5 μg、洋川芎內(nèi)酯I 2.012 5 μg、洋川芎內(nèi)酯H 0.287 5 μg、洋川芎內(nèi)酯A 0.742 5 μg 的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 參考文獻(xiàn)［7-8］ 報(bào)道，精密稱取本品粉末1.0 g 或0.6 g （低蔗糖） 或0.3 g（無(wú)蔗糖），置于錐形瓶中，精密加入25%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照處方和工藝，分別制成缺紅花，缺川芎，缺蒼耳子、川芎和白英的陰性樣品，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1” 項(xiàng)下貯備液適量，25%甲醇稀釋成系列質(zhì)量濃度，分別精密吸取1 μL，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品峰面積（Y） 對(duì)其進(jìn)樣量（X） 進(jìn)行回歸［6］，結(jié)果見(jiàn)表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得各成分峰面積RSD 分別為新綠原酸0.83%、咖啡酸2.11%、綠原酸0.70%、隱綠原酸0.93%、羥基紅花黃色素A 0.92%、阿魏酸0.88%、洋川芎內(nèi)酯I 0.71%、洋川芎內(nèi)酯H 0.67%、洋川芎內(nèi)酯A 1.81%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取本品（S1） 1 g，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、4、8、12、20、24 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各成分峰面積RSD 分別為新綠原酸0.90%、咖啡酸2.35%、綠原酸0.44%、隱綠原酸0.66%、羥基紅花黃色素A 0.81%、阿魏酸0.43%、洋川芎內(nèi)酯I 0.49%、洋川芎內(nèi)酯H 0.49%、洋川芎內(nèi)酯A 1.94%，表明溶液在24 h 穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份本品（S1），研細(xì)，精密稱取6 份，每份1 g，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各成分含量RSD 分別為新綠原酸2.24%、咖啡酸1.58%、綠原酸1.76%、隱綠原酸2.48%、羥基紅花黃色素A 2.83%、阿魏酸2.68%、洋川芎內(nèi)酯I 1.15%、洋川芎內(nèi)酯H 1.06%、洋川芎內(nèi)酯A 2.42%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含量已知的本品（S1） 9 份，每份0.5 g，分為3 組，分別精密加入對(duì)照品溶液 （每1 mL 含新綠原酸40.78 μg、咖啡酸5.10 μg、綠原酸76.98 μg、隱綠原酸80.70 μg、羥基紅花黃色素A 124.38 μg、阿魏酸19.18 μg、洋川芎內(nèi)酯I 16.10 μg、洋川芎內(nèi)酯H 2.30 μg、洋川芎內(nèi)酯A 5.94 μg） 1、2、3 mL，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，新綠原酸、咖啡酸、綠原酸、隱綠原酸、羥基紅花黃色素A、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯A 平均加樣回收率分別為97.14%、95.50%、96.80%、96.91%、99.51%、102.25%、94.97%、98.06%、93.89%，RSD 分別為0.85%、1.64%、1.84%、2.38%、2.33%、1.33%、1.75%、1.59%、2.88%。

2.4 樣品含量測(cè)定 取6 家企業(yè)120 批樣品，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各成分含量測(cè)定結(jié)果Tab.3 Results for content determination of various constituents

然后，以各成分平均含量為指標(biāo)繪制雷達(dá)圖［6，9］，見(jiàn)圖2。由此可知，企業(yè)Q1、Q4、Q6 整體輪廓均較大，表明樣品中各成分平均含量較高，其中Q1 輪廓基本呈現(xiàn)一個(gè)類圓形，表明產(chǎn)品質(zhì)量良好； Q3 輪廓明顯小于其他企業(yè)，表明產(chǎn)品可能存在質(zhì)量較低的風(fēng)險(xiǎn)； Q5 輪廓呈現(xiàn)一個(gè)銳尖角形，阿魏酸含量較高，其余成分含量較低，并且該企業(yè)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)中收載了阿魏酸，雖然嚴(yán)格保證了該成分質(zhì)量，但忽略了產(chǎn)品整體質(zhì)量； 同一成分在不同企業(yè)樣品中的含量差異很大，例如Q4 樣品中羥基紅花黃色素A 含量是在Q3 樣品中的42 倍，阿魏酸含量?jī)H是在Q5 樣品中的1/5。

圖2 各成分平均含量雷達(dá)圖Fig.2 Radar chart for average contents of various constituents

2.5 化學(xué)模式識(shí)別研究

2.5.1 熱圖聚類分析 以120 批樣品中各成分含量為指標(biāo)，采用Heml-1.0 軟件，選擇歐式距離、遠(yuǎn)鄰法進(jìn)行熱圖聚類分析［10］，結(jié)果見(jiàn)圖3。其中，行代表各成分，列代表樣品，通過(guò)顏色冷暖（紅綠深淺） 來(lái)顯示各成分含量高低。

圖3 各成分含量熱圖聚類分析Fig.3 Heatmap clustering analysis of contents of various constituents

由此可知，企業(yè)Q1、Q4、Q6 整體條帶顏色偏暖，表明樣品中各成分含量較高； Q3 整體條帶顏色均偏冷，表明樣品中各成分含量較低，與圖2 一致； Q1、Q4 樣品基本各自聚類，而Q6 樣品分散于兩者分組中，表明其質(zhì)量一致性較差； 除Q6外，其余企業(yè)樣品各自聚為一類，表明其各自質(zhì)量一致性較好，但不同企業(yè)樣品質(zhì)量一致性較差；C6 （阿魏酸） 聚為一類，其他成分聚為一類，表明阿魏酸是區(qū)分各樣品的主要成分［9］。

2.5.2 主成分分析 以各成分含量為變量，采用SIMCA 14.1 軟件對(duì)120 批樣品進(jìn)行主成分分析［9，11-13］，發(fā)現(xiàn)貢獻(xiàn)率最大的2 個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率超過(guò)64%，可較好地體現(xiàn)膚癢顆粒基本特征和主要信息［14］。因此，本實(shí)驗(yàn)以上述2 個(gè)主成分為坐標(biāo)軸構(gòu)建主成分平面，將多元變量通過(guò)降維方式投影在二維平面上，觀察樣品整體分布情況和各變量對(duì)樣品分布的貢獻(xiàn)［14］，結(jié)果見(jiàn)圖4～5。

圖4 主成分分析得分散點(diǎn)圖Fig.4 Score scatter plot for principal component analysis

圖5 主成分分析載荷圖Fig.5 Loading plot for principal component analysis

由此可知，企業(yè)Q1 ～Q5 分別出現(xiàn)明顯的分類，表明樣品質(zhì)量一致性較好； Q6 分散在Q1、Q4中，表明其質(zhì)量一致性較差，與圖3 一致； C6（阿魏酸） 離原點(diǎn)的距離最遠(yuǎn)，表明它是不同企業(yè)樣品質(zhì)量差異的重要指標(biāo)［9］。

3 討論

課題組前期發(fā)現(xiàn)，不同企業(yè)提供的投料藥材紅花、川芎主要成分含量差異較大，并且工藝和參數(shù)存在較大差異。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，同一企業(yè)生產(chǎn)的不同批次樣品之間質(zhì)量一致性較好，而不同企業(yè)生產(chǎn)的存在較大差異，這就需要有關(guān)部門強(qiáng)化監(jiān)管意識(shí)，企業(yè)采用合格原料藥材并嚴(yán)格按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)投料和生產(chǎn)，以期保證藥品質(zhì)量［15］。

中藥藥效是多種成分的綜合效應(yīng)，作用機(jī)制復(fù)雜［16］，故活性成分越多，含量越高，藥效可能越好。本實(shí)驗(yàn)查閱文獻(xiàn)［17-21］ 發(fā)現(xiàn)，羥基紅花黃色素A 來(lái)源于紅花，阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯A 均來(lái)源于川芎，新綠原酸、咖啡酸、綠原酸均來(lái)源于蒼耳子、川芎、白英，隱綠原酸來(lái)源于蒼耳子、白英。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立UHPLC 法同時(shí)測(cè)定6 家企業(yè)120批膚癢顆粒中新綠原酸、咖啡酸、綠原酸、隱綠原酸、羥基紅花黃色素A、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯A 的含量，覆蓋了方中80%的藥味，具有較強(qiáng)的代表性，并且采用雷達(dá)圖、熱圖聚類分析、主成分分析等化學(xué)模式識(shí)別手段，能較全面地反映該制劑整體質(zhì)量情況，從而為其質(zhì)量控制提供可行的技術(shù)參考和客觀數(shù)據(jù)。