一測多評法同時測定天麻頭風靈膠囊中10 種成分的含量

郭緒生，邱學偉，李 麗，吳愛英，陳安珍，劉紅兵，盧京光，3?

（1.中國海洋大學，山東 青島 266000； 2.海洋中藥質量研究與評價重點實驗室，山東 青島 266000；3.青島市食品藥品檢驗研究院，山東 青島 266000）

頭痛是臨床上常見的主訴癥狀［1］，2018 年國際頭痛學會頒布了第3 版 《頭痛疾病的國際分類》［2］，將本病分為原發性頭痛、繼發性頭痛、痛性顱神經病變和其他面痛、其他類型頭痛。天麻頭風靈膠囊由天麻、牛膝、玄參、當歸、川芎、野菊花、槲寄生等10 味藥材組成，具有滋陰潛陽、祛風、強筋骨功效［3-4］，用于治療一般頭痛、長期手足麻木、慢性腰腿酸痛等癥［5］，但關于該制劑質量研究的文獻大多是對單一成分天麻素［6-9］或阿魏酸［10-11］的含量測定，導致其整體質量難以綜合評價。

一測多評法是由王智民［12］提出的通過測定1種代表性成分（對照品易得、價廉、有效） 含量，依據相對校正因子完成對多種成分（對照品難以獲得、價格昂貴） 含量測定的方法，能有效解決對照品缺乏的問題，節約檢測成本，從而完成對中藥及其復方制劑所含多成分的質量控制［13-16］。因此，本實驗建立一測多評法同時測定天麻頭風靈膠囊中天麻素、巴利森苷E、紫丁香苷、巴利森苷B、巴利森苷C、阿魏酸、巴利森苷A、蒙花苷、哈巴俄苷、肉桂酸的含量，以期為該制劑質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 infintiyⅡ高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）； LC-2030C 高效液相色譜儀（日本島津公司）； ME204T 電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； AS10200BT 超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）

1.2 試劑與藥物 天麻素（批號110807-202010，純度95.5%）、紫丁香苷 （批號111574-201605，純度95.2%）、阿魏酸（批號110773-201915，純度99.4%）、蒙花苷（批號111528-201911，純度98.5%）、哈巴俄苷 （批號111730-201709，純度95.9%）、肉桂酸 （批號110786-201604，純度98.8%） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；巴利森苷A （批號FS1625402，純度99.9%）、巴利森苷B （批號FS1625459，純度99.7%）、巴利森苷C （批號FS1625455，純度99.3%）、巴利森苷E （批號FS1625458，純度99.9%） 對照品均購自天津阿爾塔科技有限公司。天麻頭風靈膠囊分別來自陜西白云制藥有限公司（每粒0.2 g，批號170401、170501、170502、170503、170504）、貴州益佰制藥股份有限公司 （每粒0.2 g，批號170402、171101、171102、180301、180302、180401、180402）。陰性實驗所用中藥均由青島善大天源中藥飲片有限公司生產，經青島市食品藥品檢驗研究院吳愛英主任中藥師鑒定為正品。乙腈為色譜純（德國Merck 公司）； 其他試劑均為分析純； 水為純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 GL Science InertsilTMODS-3 色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相乙腈（A） -0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0 ～10 min，1.0% ～11.0%A； 10 ～18 min，11.0% ～13.0% A； 18 ～30 min，13.0% ～20.0% A； 30 ～40 min，20.0% ～35.0% A； 40 ～43 min，35.0% A； 43 ～45 min，35.0% ～80.0% A）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測波長220 nm （0 ～33 min，天麻素、巴利森苷E、紫丁香苷、巴利森苷B、巴利森苷C、阿魏酸、巴利森苷A）、280 nm （33 ～45 min，蒙花苷、哈巴俄苷、肉桂酸）［17-21］； 進樣量5 μL，色譜圖見圖1。由此可知，各成分色譜峰分離度均大于1.5，理論塔板數均不低于5 500，陰性無干擾。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取天麻素、巴利森苷E、紫丁香苷、巴利森苷B、巴利森苷C、阿魏酸、巴利森苷A、蒙花苷、哈巴俄苷、肉桂酸對照品適量，70% 甲醇制成質量濃度分別為0.197 0、0.410 4、0.205 2、0.448 8、0.243 8、0.263 6、0.420 0、0.062 24、0.193 8、0.401 2 mg/mL 的貯備液，精密吸取適量，70%甲醇稀釋成分別含上述成分37.627、32.799、7.814、35.796、9.684、10.481、50.350、12.261、7.434、1.903 μg/mL 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取本品內容物6 粒，混勻，取約1.2 g，精密稱定，置于100 mL 錐形瓶中，精密加入70% 甲醇50 mL，稱定質量，密塞，超聲（功率350 W，頻率50 kHz） 處理30 min，放冷，70%甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按處方和工藝，分別制成缺天麻、缺槲寄生、缺當歸和川芎、缺野菊花、缺玄參的陰性樣品，按 “2.2.2” 項下方法制備，即得。

2.3 線性關系考察 取“2.2.1” 項下對照品溶液適量，70% 甲醇稀釋成6 個質量濃度，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 吸取“2.2.1” 項下對照品溶液適量，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得天麻素、巴利森苷E、紫丁香苷、巴利森苷B、巴利森苷C、阿魏酸、巴利森苷A、蒙花苷、哈巴俄苷、肉桂酸峰面積RSD 分別為0.18%、0.12%、0.34%、0.15%、0.93%、0.41%、0.09%、0.22%、0.17%、0.55%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性試驗 取同一份本品 （批號170401），按“2.2.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得天麻素、巴利森苷E、紫丁香苷、巴利森苷B、巴利森苷C、阿魏酸、巴利森苷A、蒙花苷、哈巴俄苷、肉桂酸含量RSD 分別為0.38%、0.76%、0.54%、1.22%、0.83%、0.44%、1.52%、0.60%、0.45%、0.58%，表明該方法重復性良好。

2.4.3 穩定性試驗 取同一份本品 （批號170401），按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得天麻素、巴利森苷E、紫丁香苷、巴利森苷B、巴利森苷C、阿魏酸、巴利森苷A、蒙花苷、哈巴俄苷、肉桂酸峰面積RSD 分別為0.14%、1.19%、1.09%、0.40%、1.84%、0.44%、1.19%、0.72%、0.67%、1.36%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.4.4 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含量已知的本品（批號171101） 0.6 g，共6 份，按100%水平精密加入對照品溶液，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，天麻素、巴利森苷E、紫丁香苷、巴利森苷B、巴利森苷C、阿魏酸、巴利森苷A、蒙花苷、哈巴俄苷、肉桂酸平均加樣回收率分別 為 102.23%、100.06%、100.29%、101.16%、98.82%、101.18%、101.25%、99.01%、98.53%、99.60%，RSD 分別為 2.57%、2.59%、1.65%、1.62%、1.42%、1.36%、1.64%、2.52%、2.98%、1.65%。

2.5 相對校正因子計算 取對照品溶液適量，在“2.1” 項色譜條件下分別進樣1、3、5、8、10 μL測定，以紫丁香苷為內標，計算其他9 種成分的相對校正因子fk/s，公式為fk/s＝fk/fs＝ （CkAs） /（CsAk），其中Ck為其他成分含量，Ak為其他成分峰面積，Cs為內標含量，As為內標峰面積，結果見表2。

表2 各成分相對校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

2.6 耐用性試驗

2.6.1 儀器、色譜柱 取“2.2.1” 項下對照品溶液適量，分別考察Agilent 1260 Infintiy Ⅱ、LC-2030C 色譜儀，以及 GL Science InertsilTMODS-3 （150 mm× 4.6 mm，5 μm）、NanoChrom ChromCoreTMC18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）、Agilent Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱對各成分相對校正因子的影響，結果見表3，可知均無明顯影響（RSD＜3.0%）。

表3 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.6.2 體積流量、柱溫 取“2.2.1” 項下對照品溶液適量，分別考察不同體積流量（0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 mL/min）、柱溫 （25、28、30、32、35 ℃） 對各成分相對校正因子的影響，結果見表4～5，可知均無明顯影響（RSD＜2.0%）。

表4 不同體積流量對相對校正因子的影響Tab.4 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

表5 不同柱溫對相對校正因子的影響Tab.5 Effects of different column temperatures on relative correction factors

2.6.3 色譜峰定位 取“2.2.1” 項下對照品溶液適量，分別在“2.6.1” 項儀器、色譜柱上測定保留時間，計算相對保留時間ti/s，結果見表6，可知均無明顯變化（RSD＜3.24%）。

表6 各成分相對保留時間Tab.6 Relative retention time of various constituents

2.7 樣品含量測定 取12 批樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，分別采用外標法、一測多評法計算含量，并通過SPSS 17.0 軟件進行t檢驗，結果見表7，可知2 種方法所得結果無顯著差異（P＞0.05）。

表7 各成分含量測定結果（mg/g，n＝3）Tab.7 Results for content determination of various constituents （mg/g，n＝3）

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法選擇 課題組前期分別采用不同試劑（50%甲醇、70%甲醇、甲醇、稀乙醇、乙醇） 進行提取，并分別考察了超聲、回流提取，以及不同提取時間（20、30、40 min），發現70%甲醇超聲提取30 min 時效率最高，而且操作簡便，各成分色譜峰良好，故選擇其作為供試品溶液制備方法。

3.2 色譜條件選擇 本實驗分別考察了流動相甲醇-水、甲醇-磷酸、乙腈-水、乙腈-磷酸，發現乙腈-0.1%磷酸洗脫時基線噪音小，各成分色譜峰分離度更好。通過全波長掃描發現，天麻素、巴利森苷E、紫丁香苷、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A 在220 nm 處有最大吸收，而阿魏酸在該處也有較強吸收，并且峰形、分離度良好，故選擇220 nm 測定上述7 種成分； 哈巴俄苷、肉桂酸分別在280、276 nm 處有最大吸收，而蒙花苷在280 nm 處有較強吸收，并且峰形、分離度良好，故選擇280 nm 測定上述3 種成分。

3.3 內標選擇 由于紫丁香苷具有性質穩定、含量高、對照品易得價廉的特點，故本實驗選擇其作為內標。

3.4 成分分析 陜西白云制藥有限公司所生產的天麻頭風靈膠囊中所有成分均可測得，而貴州益佰制藥股份有限公司所生產的缺少部分藥味成分，需引起關注。

4 結論

本實驗建立一測多評法同時測定天麻頭風靈膠囊中天麻素、巴利森苷E、紫丁香苷、巴利森苷B、巴利森苷C、阿魏酸、巴利森苷A、蒙花苷、哈巴俄苷、肉桂酸10 種成分的含量，該方法準確，重復性好，可用于該制劑質量控制，能有效降低檢驗成本，從而為客觀評價其整體質量提供依據。