降解菌Pseudomonas sp.AT2 對莠去津脅迫下水稻生長的影響機制

馬麗雅, 王 亞, 葛 靜, 生弘杰, 馮發運,李 勇, 李 梅, 余向陽*,

(1.江蘇省農業科學院 省部共建國家重點實驗室培育基地——江蘇省食品質量安全重點實驗室，南京 210014；2.江蘇省農業科學院 農產品質量安全與營養研究所，南京 210014)

莠去津 (atrazine，ATZ) 屬于三嗪類芽前、芽后除草劑，在玉米、高粱、甘蔗等作物上廣泛使用，主要防除多種一年生禾本科和闊葉雜草[1]，具有防治效率高、成本低廉、殺草譜廣等優點，在70 多個國家及地區應用廣泛[2]。與此同時，由于莠去津遷移性較強且消解半衰期長，導致其在農田土壤、毗鄰農田的地下水及地表水中頻頻被檢出，在種植玉米后的土壤中莠去津的檢出量可達0.9 mg/kg[3]。環境中殘留的莠去津易被植物吸收，對后茬敏感作物 (水稻[3]、小麥[4]、甘薯[5]等) 造成藥害，嚴重影響后茬作物的生長及安全生產。據報道，按照通常用量 (38%莠去津懸浮劑1.5 L/hm2)施用，莠去津對小麥的生長影響較大，可造成小麥旗葉干枯、籽粒偏小等現象[4]；采用低濃度莠去津 (0.2～0.8 mg/L) 處理水稻幼苗后，水稻生長受到抑制，細胞膜通透性增強，葉綠素含量下降，同時莠去津可在水稻籽粒中積累[6]。另外，莠去津還能通過食物鏈 (如谷物等) 進入人體，對動物及人類的神經系統、生殖系統及內分泌系統具有潛在的威脅[7-8]。因此，降低生態環境及農作物中莠去津的殘留，對農業生產及人類健康具有重要意義。

土壤中微生物無處不在，其對土壤物質循環和農藥殘留修復起著重要作用[9]，但殘留農藥反過來也會影響土壤微生物的多樣性[10-11]及功能基因的豐度[12]。同時，根際微生物也會影響植物對農藥的降解代謝[13]。研究表明，根際微生物可以聯合植物提高根際土壤中農藥的降解效率，緩解殘留農藥對植物的毒害作用。Ahmad 等[14]發現，將根際降解菌群接種于雙草醚 (2 和5 mg/L) 污染土壤，可以增強小麥對雙草醚的降解作用，降解率可高達100%；Salam 等[15]發現，在種植前將甘蔗莖稈浸泡在含假絲酵母菌酵母CandidaVITJzN04(3 × 105CFU/mL) 的YEPD 培養基中，處理5 d 后種植在林丹 (100 mg/kg) 污染土壤中，可以顯著增強甘蔗根際林丹的降解，使其降解半衰期從43.3 d減至7.1 d。近年來，關于莠去津降解菌的篩選及應用有較多報道[1,16-18]，同時降解菌的降解基因也已明確，包括atzA～atzF，其中模式菌株Pseudomonassp.ADP 包含了所有降解基因，能將莠去津完全礦化[19]。然而，目前關于莠去津降解菌的研究主要集中于離體條件下菌株對莠去津的降解功能探究，以及菌株在修復莠去津污染土壤中的應用，但關于莠去津降解菌在“土壤-植物”系統的修復應用報道較少，菌株對植物耐受莠去津脅迫的影響機制也尚不清楚。

本研究采用盆栽試驗模擬水稻的大田生長環境，研究了莠去津對水稻根際微生物菌群結構及降解基因豐度的影響，并從水稻根際土壤中分離純化出一株莠去津降解菌Pseudomonassp.AT2，將其應用于莠去津污染土壤，探究了AT2 對“土壤-水稻”系統中莠去津降解的影響及機制，以期為保障水稻的安全生產提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 藥劑及試劑 98%莠去津 (atrazine) 原藥購于先正達南通作物保護有限公司，稱取0.02 g (精確到0.0001 g) 莠去津原藥，用50 mL 乙腈完全溶解，配制成400 mg/L 的莠去津母液，于4 ℃保存，待用；乙腈為色譜純。無機鹽 (MSM) 培養基：MgSO4·7H2O 0.40 g，FeSO4·7H2O 0.20 g，K2HPO40.20 g，(NH4)2SO40.20 g，CaSO40.08 g，去離子水 1 L，pH 7.0～7.2，并于121 ℃滅菌20 min，備用。植物總RNA 提取試劑盒購于北京莊盟國際生物基因科技有限公司；反轉錄試劑盒、Green qPCR SuperMix 購于北京全式金生物技術股份有限公司；引物由通用生物 (安徽) 股份有限公司合成。

1.1.2 供試土壤 采自江蘇省南京市農田 (0～20 cm)，土壤類型為黃棕壤 (N 35.03°；E 118.87°)，其基本理化性質為：pH 7.24，黏粒含量27%，有機質含量為24.61 g/kg，有機碳含量為7.44 g/kg。土樣去除植物根系后過2 mm 不銹鋼篩網，備用。

1.2 根際土壤微生物群落多樣性分析

莠去津污染土壤的制備參照程金金等[20]的方法。取1 mL 400 mg/L 的莠去津母液，采用100 mL丙酮稀釋后，均勻添加至500 g 供試土壤中并混合均勻，通風放置24 h 至丙酮揮發完全，獲得土壤中莠去津終濃度為0.8 mg/kg 的污染土壤，該濃度在已報道的土壤中莠去津的殘留濃度范圍內[3]。均勻噴灑去離子水至田間最大持水量的60%，以不添加莠去津的土壤作為空白對照。將消毒后的水稻種子置于育苗盤中，當生長至三葉一心期時，選取5 株長勢一致的水稻苗移栽至裝有500 g 土壤的燒杯中，每個處理重復4 次。每個燒杯中添加30 mL 無菌水，每天補充水至初始水平，置于水稻溫室中培養。培養條件：200 μmol/(m2·s)，14 h光照/10 h 黑暗；晝/夜溫度為30/25 ℃。培養6 d后，參照馮發運等[10]的方法收集每個燒杯中水稻的根際土壤，得到4 個平行的待測土壤樣品。利用FastDNA? Spin Kit (MP Biomedical，Solon，OH，美國) 提取土壤DNA，并通過NanoDrop 2000超微量核酸測定儀和瓊脂糖凝膠電泳法評估所提取DNA 的樣品質量。以合格的土壤DNA 樣品為模板，利用特異性引物338F (ACTCCTACGGGA GGCAGCAG) 和806R (GGACTACHVGGGT WTCTAAT) 對16S rRNA 基因的V3-V4 區進行擴增。采用AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒 (AXYGEN公司) 進行切膠回收，回收的產物送至上海美吉生物醫藥科技有限公司，基于Illumina Miseq 平臺進行高通量測序，并通過云平臺 (http://cloud.majorbio.com/) 進行數據分析。

1.3 根際土壤中莠去津降解基因豐度測定

根據已報道的莠去津降解基因引物[21]，采用定量PCR 儀Bio-Rad CFX96 對土壤中莠去津降解基因進行擴增，測定其豐度。將降解基因的PCR產物連接至pEASY-T3 載體，并驗證基因序列。選擇序列正確的質粒以10 倍梯度稀釋，測定不同濃度質粒的CT 值，并換算成拷貝數，建立莠去津降解基因質粒的標準曲線。將1.2 節中提取得到的不同土壤DNA 進行熒光定量PCR 擴增，并結合標準曲線計算各處理樣品中莠去津降解基因的拷貝數。采用Green qPCR SuperMix 進行熒光定量PCR 擴增，反應體系為：10 μL 2 × Mix，0.4 μL上游引物，0.4 μL 下游引物，1 μL DNA 模板，8.2 μL 無菌水。反應程序為：94 ℃ 30 s，1 個循環；94 ℃ 5 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40 個循環。

1.4 莠去津降解菌的篩選及鑒定

取1.2 節中制備的土壤樣品5 g，置于LB 液體培養基中富集培養24 h 后，依次轉移至含莠去津 (2、10 和 50 mg/L) 的MSM 液體培養基中梯度馴化3 次。取馴化培養后的菌液涂布于莠去津終濃度為10 mg/L 的MSM 固體培養基上，培養24 h后，挑取不同形態的菌落進行多代劃線培養，得到純化菌株[22]。將純化后的單一菌株接種于含10 mg/L 莠去津并以其為唯一碳源的MSM 液體培養基中進行復篩，同時以不接菌的處理組為對照，30 ℃、180 r/min 振蕩培養4 d 后，通過高效液相色譜儀測定莠去津含量并計算降解率。MSM 液體培養基中莠去津的提取與檢測參考李陽陽等[1]的方法。提取其中具有降解功能菌株的DNA，用16S rRNA 基因通用引物進行PCR 擴增，并將擴增后的產物送至南京擎科生物科技有限公司測序，利用NCBI 比對測序結果并構建系統進化樹，結合菌株的形態及生理生化特征，確定降解菌的菌屬。

1.5 降解菌對莠去津脅迫下水稻的影響

試驗共設置4 組處理：1) 對照土壤 + 對照水稻；2) 對照土壤 + 接菌水稻；3) 含莠去津土壤 +對照水稻；4) 含莠去津土壤 + 接菌水稻，其中莠去津含量均為0.8 mg/kg。選擇降解能力最強的菌株AT2 為目標菌株，用滅菌后的生理鹽水配制菌懸液至OD600約為1.0。將2 份長勢一致的三葉一心期水稻苗置于上述菌懸液中浸根處理12 h，得到2 份接菌水稻；2 份對照水稻采用等量的無菌生理鹽水進行相同處理。將處理后的4 份水稻分別種植于對照土壤和莠去津污染土壤中，培養6 d 后測定水稻的相關生理指標、土壤和水稻中莠去津的含量以及水稻中莠去津降解基因的表達量。土壤和水稻中莠去津的提取與檢測方法采用Ma 等[23]的方法，回收率為89.6%～102.3%，滿足殘留農藥檢測要求。

水稻中莠去津降解基因表達量的測定：通過液氮將植物樣品研磨至粉末，利用植物總RNA 提取試劑盒提取RNA，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳和超微量紫外分光光度計檢測RNA 的完整性和純度，取上述合格的RNA 樣品 (1.0 μg)，經gDNA Eraser 消除DNA 后合成cDNA，并作為模板進行熒光定量PCR 擴增。根據已報道的水稻中莠去津降解基因[6,23-27]設計特異性引物，并以OsActin為內參基因。熒光定量PCR 體系與反應程序同1.3 節。

1.6 數據分析

通過Excel 2016 和Origin 2021 軟件制圖。試驗結果采用SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析(ANOVA)，并用Tukey 檢驗進行多重比較；或采用Student’st-test (t檢驗) 進行分析。

2 結果與分析

2.1 莠去津對水稻根際土壤微生物多樣性的影響

對莠去津脅迫下水稻根際土壤的微生物多樣性進行分析，α多樣性結果如表1 所示。各處理樣本覆蓋度均在98%以上，能較好地覆蓋樣本微生物群落的多數物種。另外，莠去津脅迫顯著降低了Sobs 指數、Chao 指數和Simpson 指數，但對Shannon 指數無顯著影響，表明莠去津脅迫可降低水稻根際土壤中細菌的豐富度和多樣性。

表1 不同處理土壤中細菌α 多樣性指標Table 1 Alpha diversity indexes of rhizosphere soil samples under different treatment

為了分析莠去津對根際土壤細菌群落β多樣性的影響，在屬水平上進行了主坐標分析 (PCoA)。結果表明：第一組分 (PC1) 和第二組分 (PC2) 的方差貢獻率分別為64.31%和17.7%，累計貢獻率為82.01% (圖1A)。另外，莠去津處理組樣品點和對照組樣品點在二維平面上能完全分開，說明莠去津可影響土壤細菌的群落結構。進一步篩選得到不同處理下存在顯著差異的優勢菌屬，結果如圖1B 所示：莠去津處理顯著降低了戴沃斯菌屬(Devosia)、氫孢菌屬 (Hydrogenispora)、代爾夫特菌屬 (Delftia) 的相對豐度，而噬氫菌屬 (Hydrogenophaga)、瘤胃梭菌屬 (Ruminiclostridium)、鞘氨醇桿菌屬 (Sphingobacterium)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)、金黃桿菌屬 (Chryseobacterium)、芽孢桿菌屬 (Bacillus) 和窄食單胞菌屬 (Stenotrophomonas)的相對豐度則顯著增加。

圖1 不同處理下水稻根際細菌在屬水平上的主坐標分析 (PCoA) (A) 和組間差異明顯的優勢菌屬 (B)Fig.1 PCoA analysis of rice rhizosphere bacteria at genus level (A) and dominant bacterial genera with significant differences between groups (B) under different treatments

2.2 根際土壤中莠去津降解基因豐度的變化特征

土壤中莠去津降解基因 (TrzN、AtzB、AtzC、AtzD、AtzE) 豐度檢測結果如圖2 所示，莠去津對不同降解基因豐度的影響存在差異。首先，相較于對照組，參與水解反應的基因TrzN、AtzB、AtzC在莠去津處理的根際土壤中豐度更高，其中TrzN基因的豐度為對照組的46 倍，而基因AtzD和AtzE在不同處理之間無顯著差異。以上結果表明，莠去津處理會改變土壤中降解基因的豐度，影響根際土壤中降解功能菌菌群。

圖2 莠去津處理對根際土壤中莠去津降解基因豐度的影響Fig.2 Effect of atrazine on the abundance of atrazine degrading genes in rhizosphere soil

2.3 菌株AT2 對莠去津脅迫下水稻生長的影響

通過分離篩選純化，獲得8 株對莠去津具有降解功能的菌株，分別命名為AT1～AT8，對莠去津的體外降解率在40.8%～88.9%之間 (表2)。根據16S rRNA 基因序列同源性比對，發現8 株菌株分別隸屬于假單胞菌屬 (Pseudomonassp.)、芽孢桿菌屬 (Bacillussp.)、類芽孢桿菌屬 (Paenibacillussp.)、金黃桿菌屬 (Chryseobacteriumsp.) 和腸桿菌屬 (Enterobactersp.)。以其中降解能力最強的Pseudomonassp.AT2 為目標菌株，通過對水稻株高、根長、干重、葉綠素和MDA 含量進行測定，評估了接菌和未接菌水稻耐受莠去津脅迫的能力。結果如表3 所示：在莠去津脅迫下，水稻生長明顯受到了抑制，葉綠素含量下降，同時伴隨著MDA 含量增加，說明氧化脅迫增強。接種降解菌株AT2 后，水稻中MDA 含量與單獨莠去津處理組相比顯著下降，表明菌株AT2 可緩解莠去津對水稻的氧化脅迫損傷。另外，在莠去津脅迫下，接菌處理組水稻的株高、根長、干重和葉綠素含量相較于未接菌組分別增加了34.6%、27.6%、28.6%和76.3%，進一步證明降解菌AT2 對莠去津脅迫具有緩解作用。

表2 8 株莠去津降解菌的篩選鑒定Table 2 Identification of 8 atrazine-degrading strains

表3 莠去津脅迫下菌株Pseudomonas sp.AT2 對水稻生長的影響Table 3 Effect of Pseudomonas sp.AT2 on the growth of rice plants under atrazine stress

2.4 菌株AT2 對水稻和土壤中莠去津降解的影響

為明確降解菌AT2 對土壤-水稻系統中莠去津降解的影響，測定了接菌和未接菌處理下水稻及土壤中莠去津的含量。結果顯示：接菌組水稻地上組織和根中莠去津的含量分別比未接菌組水稻低57.5%和47.1%，且莖葉中含量明顯高于根中含量；土壤中莠去津含量變化趨勢與水稻相似，接菌組土壤中莠去津含量顯著低于未接菌組，其含量僅為未接菌組土壤的85.1% (圖3)。研究表明，降解菌AT2 可顯著促進土壤-水稻系統中莠去津的降解。為進一步評估AT2 對水稻吸收和運輸莠去津能力的影響，分析了莠去津的富集系數 (BCF) 和轉運系數 (TF)。由表4 中結果可知，接種AT2 后根和葉的富集系數均顯著下降，同時轉運系數也從3.34 下降至2.68，表明接種菌株AT2 減少了莠去津向水稻地上部分的轉運。

圖3 接種Pseudomonas sp.AT2 菌株對水稻和土壤中莠去津含量的影響Fig.3 Effect of Pseudomonas sp.AT2 inoculation on atrazine (ATZ) content in rice and soil

2.5 菌株AT2 對水稻中莠去津降解基因的影響

農藥在植物中的代謝主要通過三相代謝完成。為評估AT2 對水稻中莠去津降解基因表達的影響，從已報道的莠去津降解基因中選擇6 個參與I 相和II 相代謝的關鍵基因，測定了不同處理下降解基因的表達量。結果如圖4 所示：在無莠去津脅迫情況下，接菌組水稻和未接菌對照組水稻中降解基因的表達量無顯著差異；莠去津脅迫下，水稻的防御系統被激活，莠去津降解基因的表達量顯著增加，其中P450 基因的表達量是無莠去津脅迫對照組的10.7 倍。另外，莠去津脅迫下，接菌組水稻中莠去津降解基因的表達量明顯高于未接菌組水稻，與未接菌組相比，接菌組水稻中編碼漆酶、甲基轉移酶、糖基轉移酶、P450、谷胱甘肽S-轉移酶和硫氧還蛋白的基因表達量分別提高了1.5、1.3、2.7、1.7、2.5 和1.3倍。研究表明，接種降解菌AT2 激活了水稻中莠去津的降解基因，從而可促進水稻中莠去津的降解代謝。

圖4 不同處理下水稻中莠去津降解基因的表達量Fig.4 Transcriptional expression of defense genes involved in atrazine (ATZ) degradation in rice under different treatments

3 討論與結論

根際微生物是植物根際微域的重要組成部分，是衡量根際活力和質量的重要指標之一[28]。農藥一方面可被植物直接吸收或殘留在土壤中，對植物根際微生物造成直接影響，另一方面還可通過改變植物的根系分泌物，從而間接影響根際微生物的結構[13]。本研究發現，莠去津處理下，Sobs、Chao 和Simpson 指數均顯著下降，可能是莠去津進入土壤后抑制了根際微生物的活性，從而降低了水稻根際微生物的多樣性指數和豐富度指數。已有研究表明，當有機污染物進入土壤后，土壤中部分微生物能以有機污染物為碳源進行生長，并導致該部分微生物豐度增加[29-30]。在本研究的細菌豐度分析中，發現莠去津處理顯著增加了水稻根際土壤中鞘氨醇桿菌屬、假單胞菌屬、金黃桿菌屬及芽孢桿菌屬的豐度，而這些菌屬均與有機污染物的降解密切相關[31-33]。另外，在水稻根際土壤莠去津降解基因豐度變化的研究中，發現參與水解反應的降解基因TrzN、AtzB和AtzC的豐度受莠去津脅迫影響而顯著增加，推測可能在莠去津處理下，部分具有特定功能的菌株(如降解菌) 豐度增加并協同植物促進對莠去津的降解，從而發揮抵御藥劑脅迫的作用。

目前已有研究表明，降解菌可有效緩解莠去津對后茬敏感作物的藥害[34-35]。本研究在莠去津污染的根際土壤中分離篩選獲得8 株莠去津降解菌，其中Pseudomonassp.AT2 的降解能力最強。將菌株AT2 接種于水稻根際，可有效緩解莠去津對水稻生長的抑制，接菌組水稻株高、根長、干重和葉綠素含量均顯著增加。MDA 作為細胞膜脂質過氧化的產物，常用于評價植物的氧化脅迫程度[36]。本研究發現，莠去津脅迫下，根際接種菌株AT2 后，水稻體內MDA 含量顯著下降，這可能是由于接種AT2 增強了水稻對活性氧的清除能力，從而減輕莠去津對水稻的氧化脅迫損傷。

在農藥降解研究領域，目前已明確根際微生物可以聯合植物在農藥降解過程中發揮功效[14-15]。Rani 等[37]研究發現，向日葵接種根際細菌菌株Paenibacillussp.ITISM08、Bacillussp.PRB77和Bacillussp.PRB101 后，植物體內硫丹的積累量明顯減少，土壤中硫丹 (初始質量濃度為5 mg/L)的降解率可達到92%。本研究發現，水稻根際接種菌株AT2 不僅可顯著降低水稻根和葉中莠去津的積累量，同時還可促進土壤中殘留莠去津的降解，與Rani 等的研究結果類似。據報道，農藥在植物中的代謝解毒主要通過植物酶系的誘導轉化實現。農藥進入植物后首先在細胞色素P450 酶系(CYPs)、漆酶等酶系的作用下進行氧化、還原和水解等反應，進一步通過糖基轉移酶、谷胱甘肽S-轉移酶等酶系與植物體內的親水型分子結合形成II 相代謝產物，同時降低對植物的毒性，該II 相代謝產物隨后能被Ⅲ相代謝轉運子識別，將結合物沉積在液泡中或通過主動運輸排出至細胞間隙[38-39]。本研究發現，莠去津脅迫下，參與水稻中I 相 (P450、漆酶) 和II 相代謝 (甲基轉移酶、糖基轉移酶、谷胱甘肽S-轉移酶、硫氧還蛋白) 的關鍵降解基因在菌株AT2 作用下顯著上調表達，推測這可能是菌株AT2 能夠促進水稻中莠去津降解，修復莠去津對水稻毒害的內在原因。

綜上，本研究揭示了莠去津脅迫可降低水稻根際細菌α多樣性，導致微生物群落結構發生改變，同時還可增加根際土壤中莠去津降解基因的豐度。另外，接種莠去津降解菌Pseudomonassp.AT2 則能緩解莠去津對水稻的脅迫損傷，激活水稻中莠去津降解基因的表達，進而促進“土壤-水稻”系統中莠去津的降解代謝，阻控殘留莠去津向水稻地上部轉移富集。研究結果可為利用功能微生物定向修復殘留農藥污染，保障作物的安全生產提供理論基礎。