不同玉米自交系對環磺酮的敏感性差異研究

高 玥, 黃冀楠, 許 賢, 李 杰, 李秉華, 趙鉑錘, 祁志尊,王貴啟, 郭建青, 劉小民*,

(1.河北北方學院 農林科技學院，河北 張家口 075000；2.河北省農林科學院 糧油作物研究所，河北省作物栽培生理與綠色生產重點實驗室，石家莊 050035；3.河北省石家莊市發展和改革委員會，石家莊 050011；4.河南省太行山林業有害生物野外科學觀測研究站，河南 安陽 455099)

玉米是我國的主要糧食作物，而雜草是影響玉米品質和產量的重要因素之一[1]。目前，施用化學除草劑仍是防除玉米田雜草的主要措施。研究表明，雜草已對多類除草劑產生了嚴重的抗性[2]。對羥基苯基丙酮酸雙氧化酶 (4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，HPPD) 為20 世紀90 年代新發現的除草劑作用靶標酶之一。HPPD 可以催化對羥基丙酮酸轉化為尿黑酸，進而轉化為光合作用中電子傳遞所需要的質體醌和生育酚[3]。此類除草劑能競爭抑制植物體內HPPD 的活性，使植物出現失綠、褪色癥狀，組織壞死，最終導致植物死亡[4]。該類除草劑因具有生物活性高、對作物安全性好、可用于防除抗性雜草等特點，成為近幾年除草劑研發的熱點。

環磺酮是2007 年由拜耳公司研發的HPPD 抑制劑類除草劑，具有內吸性和選擇性，可以用于玉米、向日葵等作物田防除多種闊葉雜草和禾本科雜草。環磺酮2021 年在中國登記后，近幾年在我國被廣泛的推廣應用，具有廣譜、高效和低殘留的優點，施藥后植物的受害癥狀主要為葉片白化，植株矮小，嚴重時整株死亡[5]。研究表明，環磺酮對玉米田大多數禾本科和闊葉雜草具有很好的防治效果，且對那些已對麥草畏、草甘膦和乙酰乳酸合成酶（ALS）抑制劑類除草劑產生抗性的雜草有滅殺效果[6]。與同類型的除草劑硝磺草酮相比，環磺酮的除草活性更高[7]，更耐雨水沖刷，且除草范圍廣，對后茬作物沒有影響[8-10]。

玉米對除草劑的敏感性與其自身的遺傳基礎有關。有研究表明，玉米5 號染色體短臂上的CYP等位基因nsf1與玉米對煙嘧磺隆、甲酰胺磺隆、硝磺草酮等除草劑的敏感性密切相關。Williams等[11]通過玉米對煙嘧磺隆和硝磺草酮的敏感性差異分析，將249 份玉米材料分為純合敏感基因型(nsf1nsf1)、雜合耐藥基因型 (NSF1nsf1) 和純合耐藥基因型 (NSF1NSF1) 3 類。雖然環磺酮對玉米的安全性較好，并可應用于爆裂玉米、甜玉米等特種玉米田，但仍有研究表明，部分甜玉米品種對環磺酮高度敏感。Bollman 等[12]發現，用環磺酮處理甜玉米品種‘Merit’ 7 d 后有52% 的葉片白化，14 d 后植株嚴重枯萎死亡。Williams 等[11]研究發現，環磺酮按有效成分184 g/hm2處理7 d后，對‘Shogun’、‘Merit’、‘177A’等7 個甜玉米品種可造成56%～100% 的藥害。我國玉米品種繁多，明確骨干自交系對除草劑的耐藥性水平，對指導除草劑在玉米田的安全應用、避免除草劑藥害發生、保障玉米生產安全具有重要的社會意義和經濟意義。本研究以‘Mo17’、‘PH6WC’、‘J525’和‘KH8’等玉米自交系為試驗對象，明確了環磺酮對耐、感玉米生長發育及體內生理生化指標的影響差異，旨在為環磺酮在玉米田的安全使用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試藥劑95%環磺酮（(tembotrione）原藥和8%環磺酮可分散油懸浮劑 (tembotrione 8% OD)，均由安徽久易農業股份有限公司生產；植物油助劑GY-Tmax，由北京廣源益農化學有限責任公司提供。供試自交系H B 0 5 (‘M o 1 7’)、H B 0 9(‘PH6WC’) 為耐藥型玉米，HB39 (‘J525’) 和HB82(‘KH8’) 為敏感型玉米，兩者均由河北省農林科學院糧油作物研究所提供。

1.2 環磺酮對玉米苗期生長的影響

采用室內生物測定法[13]。選取籽粒飽滿、大小勻稱的玉米種子放入高10 cm、直徑11 cm 育苗盆中培養，溫度25 ℃，每盆兩粒種子，3 次重復。待玉米長到三葉一心時，使用3WP-2000 型噴霧塔 (農業農村部南京農業機械化研究所) 進行莖葉噴霧處理，噴霧壓力0.3 MPa，噴液量450 L/hm2。環磺酮處理劑量 (有效成分，下同) 敏感型玉米為：0、30、60、90、120、180 和240 g/hm2，耐藥型玉米為：0、120、240、360、480、600 和720 g/hm2。于藥后14 d 測定玉米株高和鮮重，計算抑制率。

1.3 環磺酮對玉米主根生長的影響

采用垂直根長法[14]。稱取環磺酮原藥1.030 g，用丙酮溶解后用蒸餾水定容到1000 mg/L，作為母液。用蒸餾水將母液分別稀釋到0.1、1、10 和100mg/L，以清水為對照。將玉米種子用酒精沖洗1 min，用次氯酸鈉浸泡10 min 后，再用自來水沖洗3 次，最后用蒸餾水將種子浸泡24 h。第2 天將處理好的玉米種子置于玻璃板上，用兩張濾紙固定，將玻璃板垂直放在保鮮盒中，保鮮盒中放入不同濃度的藥液。于7 d 后測量主根根長。以抑制率概率值 (y) 和濃度對數值 (x) 建立回歸方程 (y=a+bx)，計算IC50值 (mg/L)。

1.4 環磺酮對玉米葉片類胡蘿卜素和葉綠素含量的影響

按照1.2 節中的方法培養玉米，待其長到三葉一心時，采用環磺酮按有效成分120 g/hm2處理。分別在施藥后0、3、5 和7 d 采集0.1 g 新鮮的玉米葉片，去掉中脈，在黑暗條件下研磨后倒入10 mL試管中，加入V(乙醇) :V(蒸餾水) = 95 : 5 混合液，于黑暗條件下浸提3 h。待材料完全變白后，取浸提液于96 孔板中，將波長分別調至665、649 和470 nm 處讀取吸光值 (A)。按公式 (1)～(4)計算葉綠素a 含量、葉綠素b 含量、葉綠素總含量和類胡蘿卜素含量。

其中，Ca為葉綠素a 含量，Cb為葉綠素b 含量，Ct為葉綠素總含量，Cc為類胡蘿卜素含量，單位均為mg/g；V為提取液體積，mL；D為稀釋倍數；m為樣本質量，g。

1.5 超氧化物歧化酶 (SOD) 和過氧化物酶 (POD)活性測定

按照1.2 節的方法培養玉米，待其長到三葉一心時，采用環磺酮有效成分120 g/hm2處理。分別于施藥后0、1、3、5 和7 d 采集新鮮的玉米葉片，冰浴勻漿，使用索萊寶 (Solarbio) 生物科技有限公司提供的SOD 和POD 試劑盒進行測定。

1.6 數據處理與分析

數據采用Microsoft Excel 及DPS 17.1 軟件進行處理，并利用新復極差法(Duncan's 法)進行單因素差異顯著性分析，顯著性水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 環磺酮對玉米幼苗生長的影響

2.1.1 環磺酮對玉米株高的影響 環磺酮按30 g/hm2(有效成分，下同) 施用4 d 后，敏感型玉米植株開始表現出藥害癥狀，葉片出現白化現象；對玉米株高的抑制率隨著用藥量的增加而逐漸增大，其中在60 g/hm2處理下對HB82 株高的抑制率達52.87%，在240 g/hm2處理下抑制率高達64.63%。而耐藥型玉米在施用環磺酮后，植株葉片并未出現白化現象，各處理間株高抑制率變化幅度較小，在720 g/hm2處理下對HB05 和HB09 的株高抑制率分別為48.61%和38.05% (圖1)。

圖1 環磺酮對玉米株高的影響Fig.1 Effect of tembotrione on maize plant height

2.1.2 環磺酮對玉米鮮重的影響 由圖2 可知，環磺酮對不同玉米自交系的鮮重抑制率存在明顯差異。在30 g/hm2處理下，對敏感型玉米HB82、HB39 的鮮重抑制率分別為38.59%和24.94%，在240 g/hm2處理下對其鮮重抑制率分別高達70.06%和66.02%。而耐藥型玉米HB05 在施用環磺酮120 g/hm2后，鮮重抑制率僅為4.44%，720 g/hm2處理下鮮重抑制率為21.93%；HB09 在120～720 g/hm2處理下，鮮重抑制率為22.39%～43.63%。

圖2 環磺酮對玉米鮮重的影響Fig.2 Effect of tembotrione on maize fresh weig ht

2.2 環磺酮對玉米主根生長的影響

從圖3 可以看出，環磺酮對玉米主根生長有一定的抑制作用，在同一濃度處理下，對敏感型玉米主根根長的抑制作用明顯高于耐藥型玉米，濃度越高對主根根長的抑制作用越明顯。1000 mg/L處理對敏感型玉米HB82 和HB39 的根長抑制率分別為90.94%和85.35%，對耐藥型玉米HB05 和HB09 的抑制率分別為76.65%和78.07%。由表1數據可以看出，環磺酮對敏感型HB82 和HB39的IC50值分別為13.48 和16.13 mg/L，對耐藥型玉米HB05 和HB09 的IC50分別為223.50 和37.42 mg/L，兩者的IC50值相差較大。

表1 環磺酮對玉米主根的影響(120 g a.i./hm2)Table 1 Effect of tembotrione on taproots of maize (120 g a.i./hm2)

圖3 環磺酮對玉米主根生長的影響Fig.3 Effect of tembotrione on the growth of maize taproots

2.3 環磺酮對玉米幼苗類胡蘿卜素和葉綠素含量的影響

HPPD 抑制劑類除草劑可以阻斷植物體內酪氨酸的正常代謝，導致類胡蘿卜素的缺乏, 從而誘導葉綠素光氧化作用減弱，影響植物的光合作用。施用環磺酮后，葉綠素a、b，葉綠素總含量和類胡蘿卜素含量均隨用藥時間的增加呈現不同程度的下降趨勢 (表2)。施藥7 d 后，敏感型玉米HB82 和HB39 體內類胡蘿卜素含量分別下降83.72%和74.02%，耐藥型玉米HB05 和HB09 分別下降40.83%和33.33%；敏感型玉米和耐藥型玉米的葉綠素總含量有明顯的差異，敏感型玉米HB82 的下降趨勢最明顯，下降87.76%，而耐藥型玉米HB09 下降33.65%；葉綠素a 和葉綠素b的變化趨勢與葉綠素總含量變化趨勢一致，敏感型玉米HB82 葉綠素a 含量由0.837 mg/g 下降至0.102 mg/g，HB39 由0.540 mg/g 下降至0.159 mg/g；耐藥型玉米HB05 由0.546 mg/g 下降至0.217 mg/g，HB09 由0.668 mg/g 下降至0.442 mg/g。HB82 和HB39 葉綠素b 含量分別下降0.184 和0.086 mg/g，HB09 和HB05 分別下降0.055 和0.079 mg/g。表明環磺酮對敏感型玉米葉片中葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總含量和類胡蘿卜素含量影響較大，葉片受害較重，光合作用受到嚴重抑制。而耐藥型玉米在施用環磺酮后，葉片受害較輕，對葉綠素a、葉綠素b，葉綠素總含量和類胡蘿卜素含量影響較小。

表2 環磺酮對玉米葉片類胡蘿卜素和葉綠素含量的影響 (120 g a.i./hm2)Table 2 Effect of tembotrione on carotenoids and chlorophyll content in maize leaves (120 g a.i./hm2)

2.4 環磺酮對不同玉米自交系SOD 和POD 酶活性的影響

SOD 活性測定結果如圖4 所示，與對照組相比，環磺酮處理誘導了不同玉米自交系體內SOD 酶活性的增加。不同玉米自交系SOD 酶活性均呈現出先上升后下降的趨勢，在第3 天出現最高值，然后下降。敏感型玉米和對照組相比活性變化幅度大，藥后3 d 與對照組相比，敏感型HB82活性提高69.02%，HB39 提高93.63%；而耐藥型玉米HB05 和HB09 的SOD 酶活性與對照組相比變化幅度不大。

圖4 環磺酮對玉米葉片SOD 酶活性影響 (120 g a.i./hm2)Fig.4 Effect of tembotrione on SOD enzyme activity in maize leaves (120 g a.i./hm2)

POD 活性測定結果 (圖5) 表明，施用環磺酮后，不同玉米自交系體內POD 酶活性均高于對照組。整體呈先上升后下降趨勢，HB82、HB39 和HB05 在藥后5 d 出現最高值，HB09 在藥后3 d 出現最高值。與對照組相比，藥后5 d， HB82 升高182.19%，HB39 升高163.23%；藥后3 d，HB09升高28.09%，HB05 變化最小，僅升高4.20%。敏感型玉米與耐藥型玉米相比具有較大的差異。

圖5 環磺酮對玉米葉片POD 酶活的影響Fig.5 Effect of tembotrione on POD enzyme activity in maize leaves

3 結論與討論

除草劑對玉米的安全性除了受氣候和土壤等環境因素的影響之外，還與玉米品種密切相關[15]。本研究借鑒董曉雯等[16]和陳錫嶺等[17]的方法，分析了環磺酮脅迫對玉米幼苗和主根生長的影響。結果表明，環磺酮對玉米幼苗生長和主根根長具有不同程度的抑制作用，不同玉米自交系對環磺酮的耐藥性存在明顯差異，環磺酮120 g/hm2處理對敏感型玉米產生傷害，影響其光合作用，阻礙玉米生長發育所需物質的運輸，導致玉米營養物質供應不足，代謝能力減弱，藥害嚴重；而對耐藥型玉米的生長發育無明顯影響。敏感型玉米HB82和HB39 在環磺酮30 g/hm2處理下葉片出現白化，而生產上常用的骨干自交系‘Mo17’ (HB05)、‘PH6WC’ (HB09) 即使在720 g/hm2劑量下葉片也沒有出現失綠現象。‘Mo17’在育種中做出巨大貢獻，先后培育出‘丹玉13’和‘中單2 號’等品種?！甈H6WC’培育的雜交后代有‘先玉335’，我們在前期研究中驗證了‘先玉335’為耐環磺酮的品種 (結果未發表)。已有研究表明，不同玉米品種對不同類型除草劑的敏感性存在顯著差異。董曉雯等[16]測定了32 個玉米品種對有效成分60 g/hm2煙嘧磺隆的敏感性，發現‘泰玉2 號’等7 個玉米品種對煙嘧磺隆敏感，植株生長受到嚴重抑制，而‘農大2008’等4 個玉米品種生長正常，無明顯藥害癥狀。謝娜等[18]研究發現，氯吡嘧磺隆對甜玉米的IC10值為94.87 g/hm2(有效成分，下同)，而對‘強盛16’的IC10值為230.19 g/hm2，相差2.43 倍。郭玉蓮等[19]研究表明，‘吉單27’、‘先玉335’、‘東農888’和‘墾粘1 號’對氟磺胺草醚敏感性差異顯著，耐藥倍數相差5.71～8.83 倍。

HPPD 抑制劑類除草劑可以阻礙玉米體內質體醌 (PQ) 的合成，質體醌作為光合作用中關鍵的輔助因子，影響類胡蘿卜素的生成，使植物逐漸白化，葉綠素含量下降[20]。葉綠素含量的高低能反映作物光合作用狀態的變化，因此葉綠素含量是反映逆境脅迫下光合作用的重要指標。本研究中，隨著施藥時間的推移，葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總含量和類胡蘿卜素含量均呈不同程度的下降趨勢，其中敏感型玉米的下降幅度大于耐藥型玉米，二者差異明顯。郭玉蓮等[19]研究了不同玉米品種對氟磺胺草醚的敏感性差異，發現施用氟磺胺草醚后不論是敏感還是耐藥型玉米體內葉綠素含量均受到抑制，但對耐藥品種葉綠素抑制率變化幅度較敏感品種小，二者間差異極顯著。王一[21]對不同耐旱脅迫下兩個玉米自交系苗期生長發育以及生理生化特性的研究發現，耐旱玉米自交系體內葉綠素a、葉綠素b 和葉綠素總含量受脅迫影響較敏感型玉米自交系小。

除草劑使用不當容易對玉米造成傷害，當玉米受到除草劑等非生物脅迫時，細胞內會生成大量的活性氧如超氧自由基、過氧化氫等，植物體內抗氧化系統為防止細胞的氧化損傷，啟動保護酶來維持植物細胞的穩定。超氧化物歧化酶(SOD) 和過氧化物酶 (POD) 是植物體內重要的保護酶，是評價植物氧化反應的重要指標。本研究發現，環磺酮脅迫誘導了玉米體內SOD 和POD活性的增加，整體呈先上升后下降的趨勢，其中敏感型玉米的增長幅度明顯高于耐藥型玉米。石小堰[22]研究表明，在2,4-D 丁酯、乙草胺和莠去津3 種除草劑處理下，抗感玉米體內SOD 和POD的活性與對照組相比都有一定的升高。高鵬[23]關于谷子和玉米對煙嘧磺隆敏感性差異的生理機制研究發現，玉米施用煙嘧磺隆后體內S O D和POD 活性升高，其中 ‘農大108’和‘迪甜8 號’玉米體內SOD 和POD 活性隨用藥時間的推移呈現先升高后降低的趨勢。

有關不同自交系玉米品種對環磺酮敏感性差異的生理機制，還需要從酶學、生理學等方面進行深入研究。