糞菌移植治療DSS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的免疫學(xué)機(jī)制研究

劉 揚, 劉 青, 路 明

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肛腸外科, 烏魯木齊 830054)

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)屬于一類復(fù)發(fā)性、慢性結(jié)腸炎癥性疾病。研究認(rèn)為,其發(fā)病機(jī)制可能與免疫功能紊亂、環(huán)境、腸道微生物、遺傳等多因素相關(guān)[1],但具體機(jī)制仍需深入研究。UC的治療主要依賴內(nèi)科藥物,如氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑等,但其療效較為局限且副作用明顯,而糞菌移植(Fecal microbiota transplantation,FMT)作為一種特殊的微生物移植方法,在功能性便秘、肝衰竭、自身免疫性腦脊髓炎、潰瘍性結(jié)腸炎(UC)等疾病方面具有較好的治療效果[2]。然而,FMT在UC中的具體作用機(jī)制尚不明確。有實驗結(jié)果顯示,經(jīng)FMT治療后,由葡聚糖硫酸鈉(DSS)所致UC小鼠的體重、大便性狀和遠(yuǎn)端結(jié)腸病理改變均有顯著改善,說明FMT能夠改善DSS所致的小鼠結(jié)腸炎[3]。FMT通過重建腸道微生態(tài)平衡、調(diào)整和抑制腸道紊亂引起的免疫炎癥反應(yīng),穩(wěn)定腸道免疫以達(dá)到治療效果[4]。本研究旨在通過DSS誘導(dǎo)形成小鼠UC模型,驗證FMT的療效及其可能的免疫學(xué)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑雄性C57BL/6J,SPF級小鼠60只,8周齡,體重20～24 g,由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供(使用許可證號:202310061)。葡聚糖硫酸鈉(DSS)(源葉公司,貨號:02160111080);HE染色試劑盒(經(jīng)科化學(xué),貨號:L9406);ELISA試劑盒(貨號: JL15150)、 小鼠白介素-6(IL-6)試劑盒(貨號:FB-0111F1)、小鼠白介素-17(IL-17)試劑盒(貨號:FB-0063F1)、小鼠白介素-22(IL-22)試劑盒(貨號:FB-0079F1)、小鼠白介素-35(IL-35)試劑盒(貨號:FB-0071F1)、小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)試劑盒(貨號:FB-0189F1)、小鼠可溶性Fas試劑盒(貨號:FB-0182F1)均購自武漢豐賓生物科技有限公司。本實驗已通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會的審批(審批號:202310061)。

1.2 糞菌的制備取10只雄性 C57BL/6J小鼠(不參與后續(xù)實驗)的新鮮晨便5 g,溶于10 mL無菌生理鹽水中,分別經(jīng)2.0、1.0、0.5和0.25 mm不銹鋼篩過濾,6 000 r/min,離心15 min,收集菌體,無菌生理鹽水洗滌3遍,25 mL滅菌生理鹽水重懸,置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 動物分組、模型制備及處理[5]對50只雄性 C57BL/6J小鼠逐個稱重,編號。采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白組(n=10)、模型組(n=20)、研究組(n=20)。空白組自分組首日起自由飲用滅菌蒸餾水,正常飲食,連續(xù)30 d。模型組和研究組自分組首日起自由飲用2%DSS溶液,正常飲食,連續(xù)30 d,誘導(dǎo)形成潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型。判定標(biāo)準(zhǔn):光鏡下結(jié)腸黏膜病理學(xué)檢查提示,黏膜變薄,上皮結(jié)構(gòu)缺失,腺體分布無規(guī)則性,固有層充血水腫,伴大量炎癥細(xì)胞浸潤及毛細(xì)血管充血、淋巴管明顯擴(kuò)張,彌漫分布小潰瘍等病變。臨床觀察排便次數(shù)≥3次、排便質(zhì)量為稀便或黏液便、排便量的增加符合潰瘍性結(jié)腸炎的臨床癥狀時確認(rèn)模型成功。造模成功后,空白組不予處理,模型組予以生理鹽水灌腸,研究組予以糞便混懸液生理鹽水混合物灌腸,每3天灌腸1次,共2次。根據(jù)小鼠體重,本研究灌腸量設(shè)定為1.0 mL/次。在造模及實驗過程中,用于留取大便的小鼠存活6只,空白組存活6只,模型組存活7只,研究組存活8只,共27只。

1.4 HE染色觀察結(jié)腸組織病理形態(tài)表現(xiàn)[6]取最終存活的所有小鼠病變結(jié)腸部分組織,置于4%多聚甲醛中固定24 h,常規(guī)脫水、包埋和切片,根據(jù)HE試劑盒說明書進(jìn)行蘇木素-伊紅染色,中性樹膠封片,通過顯微鏡觀察結(jié)腸組織病理受損情況。

1.5 ELISA法檢測血清中炎癥因子水平[7]在第2次灌腸結(jié)束后第2天處死小鼠,采集小鼠眼底靜脈血1.0～1.5 mL,置于干燥的滅菌血清分離管內(nèi),室溫靜置2 h,待自然凝固,2 000 r/min,離心15 min,分離血清,-20℃冰箱存儲備用。通過ELISA法測定腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-35(IL-35)、白介素-22(IL-22)、白介素-17(IL-17)與可溶性Fas等細(xì)胞因子水平。通過空白孔調(diào)零,測定每孔450 nm處的吸光度值(OD)。

1.6 腸道菌群測定[8]采用光岡氏腸內(nèi)細(xì)菌群分析法定量測定腸道菌群值及雙歧桿菌與腸桿菌的數(shù)量比值(B/E值),取模型組和研究組小鼠各0.5 g糞便,加入滅菌生理鹽水充分振搖做成1︰10的均勻稀釋菌液。取20 μL稀釋菌液接種于腸桿菌、腸球菌、酵母菌、擬桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌及梭菌的選擇性培養(yǎng)基中。需氧菌置于37℃普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,厭氧菌置于28℃～37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。參照API細(xì)菌鑒定系統(tǒng)(API bacterial identification system)的厭氧菌三級鑒定法鑒定菌種至屬水平,計算各平板的平均菌落數(shù),結(jié)果以每克濕糞的菌落形成單位(CFU)的對數(shù)值表示,即為菌群值。若B/E>1表示腸道菌群組成正常,若B/E<1表示腸道菌群失調(diào),且B/E比值越低,提示菌群失調(diào)越嚴(yán)重。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠排便次數(shù)、排便量及體重的比較與空白組比較,模型組平均每日排便次數(shù)和排便量明顯增多,體重下降(P<0.05);與模型組比較,研究組每日排便次數(shù)和排便量減少,體重上升(P<0.05),見表1。

表1 各組小鼠排便次數(shù)、排便量和體重的比較

2.2 各組小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)表現(xiàn)空白組黏膜形態(tài)未見異常,腺體規(guī)則分布,各層結(jié)構(gòu)完全且清晰,未見潰瘍與炎性細(xì)胞浸潤。模型組黏膜變薄,上皮結(jié)構(gòu)缺失,腺體分布無規(guī)則性,固有層顯示充血水腫,伴大量炎癥細(xì)胞浸潤及毛細(xì)血管充血、淋巴管明顯擴(kuò)張,彌漫分布小潰瘍;研究組小鼠結(jié)腸黏膜病變程度較模型組有所減輕,但部分仍可見淋巴管輕度擴(kuò)張,伴少量炎癥細(xì)胞浸潤,見圖1。

空白組 模型組 研究組

2.3 各組小鼠腸道菌群的變化與空白組比較,模型組和研究組腸桿菌、腸球菌、擬桿菌和梭菌的菌群值顯著升高,B/E值降低(P<0.05);與模型組比較,研究組酵母菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌的菌群值顯著增加,B/E值升高(P<0.05),見表2。

表2 各組小鼠腸道菌群的比較濕糞)

2.4 各組小鼠血液中炎癥因子水平比較與空白組比較,模型組和研究組TNF-α、IL-6、IL-22與IL-17水平升高,IL-35與可溶性Fas水平降低(P<0.05);與模型組比較,研究組TNF-α、IL-6、IL-22與IL-17水平降低,IL-35和可溶性Fas水平升高(P<0.05),見表3。

3 討論

結(jié)腸黏膜連續(xù)性炎癥是UC的主要特征[9],但其發(fā)病原因尚不完全清楚。FMT是指向患者的腸道內(nèi)植入健康者糞便內(nèi)所含的所有菌群,以調(diào)控腸道微生態(tài)平衡,減輕炎癥反應(yīng),幫助修復(fù)腸黏膜[10]。因此,FMT作為一類新療法受到廣泛重視。FMT可使UC小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,增強(qiáng)有益菌群數(shù)量,抑制有害菌群生長。Zhang等[11]研究表明,糞便菌群移植可通過調(diào)節(jié)腸道菌群,改善Th1/Th2和Th17/Treg失衡以控制實驗性潰瘍性結(jié)腸炎。但關(guān)于FMT治療UC的免疫學(xué)機(jī)制研究尚有待深入研究。

本研究探討利用FMT治療DSS所致UC小鼠的效果及相關(guān)的免疫學(xué)機(jī)制。結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組小鼠平均每日排便次數(shù)和排便量明顯增多,體重下降。提示模型組小鼠腸道發(fā)生炎癥侵害,免疫功能受到影響,體重下降。與模型組比較,研究組每日排便次數(shù)和排便量減少,體重上升。說明糞菌移植治療后腸道菌群趨于平衡,有益菌成為優(yōu)勢菌,腸道炎癥改變逐漸減輕,小鼠腸道吸收功能及免疫功能逐步恢復(fù),體重逐步增加。本研究結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組和研究組小鼠TNF-α、IL-6、IL-22與IL-17水平顯著升高,而可溶性Fas與IL-35水平顯著降低。與模型組比較,研究組小鼠TNF-α、IL-6、IL-22與IL-17水平顯著降低,而可溶性Fas與IL-35水平升高。提示小鼠結(jié)腸受到炎癥侵害時TNF-α、IL-6、IL-22與IL-17等促炎因子表達(dá)水平增高,可溶性Fas與IL-35水平等抑炎因子水平降低,炎癥反應(yīng)劇烈。對小鼠進(jìn)行FMT治療后,TNF-α、IL-6、IL-22與IL-17等促炎因子水平顯著降低,可溶性Fas與IL-35等抑炎因子水平增高,炎癥反應(yīng)被控制,提示腸道FMT治療可抑制腸道炎癥反應(yīng),穩(wěn)定腸道免疫[12]。組織病理形態(tài)結(jié)果顯示,空白組小鼠結(jié)腸黏膜形態(tài)無異常,腺體規(guī)則分布,各層結(jié)構(gòu)完整且清晰,未見潰瘍與炎性細(xì)胞浸潤。模型組小鼠結(jié)腸黏膜變薄,上皮結(jié)構(gòu)缺失,腺體分布無規(guī)則性,固有層顯示充血水腫,可見廣泛的炎癥細(xì)胞浸潤、淋巴管明顯擴(kuò)張和彌漫分布小潰瘍。表明在潰瘍性結(jié)腸炎模型中,DSS處理會引起免疫失調(diào)和炎癥反應(yīng)的增強(qiáng)[13]。潰瘍性結(jié)腸炎模型的建立導(dǎo)致了結(jié)腸組織的病理性損傷,免疫反應(yīng)失衡及炎癥因子的異常表達(dá)[14-15]。

基于以上結(jié)論,通過FMT治療UC小鼠。結(jié)果顯示,與模型組比較,研究組小鼠結(jié)腸黏膜病變程度有所減輕,部分小鼠仍可見輕度的淋巴管擴(kuò)張,伴有少量的炎癥細(xì)胞浸潤。提示糞菌移植可改善潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸組織病理損傷。在菌群值方面,與空白組比較,模型組和研究組小鼠腸桿菌、腸球菌、擬桿菌和梭菌的菌群值顯著升高,B/E值降低。與模型組比較,研究組小鼠酵母菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌的菌群值顯著升高,B/E值升高。提示糞菌移植可重建腸道菌群,維護(hù)腸道微生態(tài)平衡,降低潰瘍性結(jié)腸炎的炎癥反應(yīng)[16],促進(jìn)腸道菌群平衡,且抑制炎癥因子的釋放,促進(jìn)腸黏膜的修復(fù)[17-18]。

綜上所述,FMT能夠改善DSS所致的UC小鼠的結(jié)腸組織病理性損傷,抑制TNF-α、IL-6、IL-17與IL-22等促炎因子水平的上調(diào),通過升高IL-35和可溶性Fas等抑炎因子的水平來降低炎癥反應(yīng)。FMT通過重建腸道微生態(tài)平衡、調(diào)整和抑制腸道紊亂引起的免疫炎癥反應(yīng),穩(wěn)定腸道免疫以達(dá)到治療效果。這為進(jìn)一步研究UC的免疫學(xué)機(jī)制提供了新的線索和證據(jù)。

(本文編輯： 王艷、 尼麗帕爾·亞熱)