不同采集地豬屎豆資源生產性能與飼料化評價

呂仁龍， 孫郁婷， 王燕茹， 張雨書， 李 茂， 周漢林， 楊虎彪

（1.中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所，海南海口 571101；2.中國熱帶農業(yè)科學院湛江實驗站，廣東湛江 524013）

豬屎豆（Crotalaria pallida Ait）為豆科蝶形花亞科豬屎豆屬一年生草本植物，因其具有耐瘠、耐旱且營養(yǎng)價值豐富的特點，作為綠肥被廣泛應用。豬屎豆 （野生品種） 初花期粗蛋白質含量高達21%、粗纖維含量也高于20%，具有作為飼用作物應用的潛力（鄒知明，2008）。 然而，豬屎豆中含有非營養(yǎng)物質野百合堿 （Crotaline）（Verdoom，1992），在一定程度上限制了其作為動物飼料的應用，但Duke 等（1981）的研究發(fā)現(xiàn)，豬屎豆葉片中的生物堿在經自然干燥后幾乎完全被降解， 表明科學合理的對其加工， 豬屎豆可以作為一種動物蛋白飼料來進一步挖掘其應用前景。

在前期工作中， 研究者對多種豬屎豆進行了粗略評價， 發(fā)現(xiàn)了一些野百合堿含量極低或未檢出的品種， 如光萼豬屎豆和三尖葉豬屎豆（張新蕊，2011）， 這似乎為豬屎豆資源飼料化應用提供了契機。 Metha 等（2021）在反芻動物飼糧中添加豬屎豆屬的菽麻（Crotalaria juncea L.） 青貯后，顯著提高了日糧在瘤胃內的干物質（DM）、 有機物（OM）和粗蛋白質（CP）的消化率。 在本課題組前期工作中， 針對所保存的300 余份資源， 篩選了10 余份未檢出（或極低含量）野百合堿的豬屎豆樣本，并進行了栽培試驗，通過對栽培效果、營養(yǎng)成分和瘤胃消化特性開展評價， 結果發(fā)現(xiàn)了幾個不同采集地的資源在粗蛋白質含量和干物質消化率上優(yōu)勢明顯， 具有作為飼料的巨大潛力（孫郁婷，2022）。 為進一步驗證其營養(yǎng)參數(shù)， 摸索在青貯加工后的發(fā)酵特性及其消化特性， 掌握部分資源飼料化的可行性，討論未來其利用方式方法，本研究主要針對已篩選的15 份豬屎豆資源，進行栽培試驗，分析其生產性能、營養(yǎng)變動、青貯和消化特性， 篩選作為粗飼料資源的優(yōu)勢品種， 重點培育，為下一步飼料化應用提供技術支撐。

1 試驗設計

1.1 栽培試驗 15 份豬屎豆資源材料由國家熱帶牧草種質資源中期（備份）庫提供。該15 份資源未檢測出野百合堿和光萼野百合堿（武漢邁特維爾生物科技有限公司）。 各資源信息如表1 所示。

表1 試驗材料

在中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物牧草基地（N19°31′22.63″，E109°34′36.00″） 選定3 塊試驗田，每塊試驗田設定15 個小區(qū)（3 m×5 m）。 2022年5 月19 日將篩選出的15 份材料種子經過挑選， 用酒精及過氧化氫溶液處理后在80 ℃熱水浸泡2 h，待種子吸漲后，分別在各試驗田中分別進行條播，行距30 ～35 cm。 在生長期間，定時施肥4 次（平均每30 d 施肥一次，施肥量約為15 g復合肥/株）。 自出苗日起（2022 年5 月23 日全部出苗）， 以各個小區(qū)為單位分別觀察各植株有20%開花時，進行刈割。將收割的樣品置于80 ℃烘箱烘干48 h，磨粉過篩，用于營養(yǎng)成分分析。本試驗期間天氣情報來源于海南氣象信息服務網數(shù)據，如表2所示。本試驗所栽培的各資源根據不同植株草產量分成3 個小組（表3）進行試驗統(tǒng)計分析。

表2 2022 年5 ～7 月儋州市天氣概況

表3 不同品種豬屎豆產量分組及莖葉比

1.2 青貯試驗 在15 個試驗小區(qū)中， 分別采集豬屎豆樣品約500 g，切割至2 ~ 3 cm 長度，充分混合后，自然晾曬（控制水分約75%），取200 g 半干樣品裝入一個的聚乙烯青貯袋中（30 cm×20 cm），每個樣品重復2 次，共計15×3×2=90 袋，用真空打包機（Sinbo，Shanghai China） 抽真空后進行密封，保存于暗室（室溫）發(fā)酵60 d。

1.3 體外培養(yǎng)試驗 參考呂仁龍等（2019）的方法進行體外培養(yǎng)。 選用4 只單獨飼養(yǎng)在代謝籠的海南黑山羊（平均體重16.2 kg）。按照能量維持標準，每日8：30 和16：00 飼喂。 日糧粗精比為5：5，粗飼料為新鮮王草；水和礦物質鹽自由攝取。馴化期為15 d，在第16 天早晨飼喂2 h 后，分別在口腔中插入導管， 抽取山羊的瘤胃液，39 ℃水浴條件下帶回實驗室。 經過四層紗布過濾后的瘤胃液等比例混合后再與緩沖液按1：2 的比例混合。在50 mL 玻璃培養(yǎng)瓶中稱取烘干粉碎的豬屎豆樣品約0.3 g，并與30 mL 培養(yǎng)液混合。 通入CO2排凈瓶中的空氣。 密封后，置于39 ℃水浴搖床中培養(yǎng)6 h，振蕩頻率為50 次/min。

1.4 指標測定

1.4.1 株高及莖葉比測定 刈割前， 在每個小區(qū)內隨機取10 株，測量其從地面到植株最高部位的絕對高度，取平均值為株高。刈割的植株將莖和葉部分離，分別放入80 ℃烘箱進行48 h 烘干，測定干物質含量并計算莖葉比（干物質基礎）。

1.4.2 產量測定 當試驗區(qū)內的植株有20%左右開花時，留茬30 cm 刈割，將刈割后的植株全部稱重，并計算產量。

1.4.3 土壤采集與成分分析 在試驗田中隨機選擇10 個點，分別取0 ～20 cm 土樣和20 ～40 cm土樣，分別過40 目篩，各土壤樣品參照《土壤農業(yè)化學常規(guī)分析方法》（1983）測定速效鉀、有效磷、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮有機質和全氮含量（表4）。

表4 試驗地土壤理化性質及營養(yǎng)成分

1.4.4 營養(yǎng)成分測定 將青貯前后的樣品干燥后粉碎過篩。 參照Van Soest （1991）的方法，分析中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）、粗蛋白質、粗纖維（CF）、K、P、粗脂肪（EE）及粗灰分（CA）含量。

1.4.5 干物質消化率 采用過濾法測定干物質消化率（NRC，2001）。用抽濾瓶和布氏漏斗將培養(yǎng)液和殘渣泵入濾紙上， 將有殘渣的濾紙放入100 ℃烘箱烘干12 h，取出稱量。 計算公式如下：

干物質消化率/%=[1-培養(yǎng)后干物質重量/（培養(yǎng)樣品鮮重×干物率）]×100。

1.4.6 青貯發(fā)酵特性 豬屎豆發(fā)酵60 d 后開封，取50 g 樣品浸泡在200 mL 蒸餾水中24 h （4 ℃冷藏），之后用四層紗布將提取汁過濾，用精密pH計（雷磁PHS-3C，上海）測定濾液的pH。取10 mL過濾液，放入離心機（HERMLE，美國），設定轉速12000 r/min， 離心5 min，再取部分上清液用一個微孔濾膜（0.22 μm）過濾至進樣瓶。采用高效液相色譜儀（HPLC）分析各揮發(fā)性脂肪酸組成的含量，條件設定方法同呂仁龍等（2019）。 揮發(fā)性氨態(tài)氮的含量利用苯酚次氯酸鈉比色法進行分析，取1 mL培養(yǎng)液稀釋液，加入4 mL 的0.2 mol/L 鹽酸溶液，再加入苯酚和次氯酸鈉混勻后放入60 ℃水浴鍋加熱，進行顯色反應，待樣品冷卻后用分光光度計（波長560 nm）測定吸光度。

1.4.7 瘤胃發(fā)酵特性 培養(yǎng)結束后， 用玻璃注射器插入培養(yǎng)瓶橡膠塞測定培養(yǎng)瓶內氣體總量，使用雷磁PHS-3C 精密pH 計測定培養(yǎng)液的pH。 培養(yǎng)液各揮發(fā)性脂肪酸（VFA）組成含量采用高效氣相色譜儀（GC，安捷倫，7890B）測定。 揮發(fā)性氨態(tài)氮分析方法同上。

1.5 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據采用SAS 9.2 軟件（SAS，2004）進行統(tǒng)計分析，各組內各品種豬屎豆的營養(yǎng)成分、 體外發(fā)酵特性， 青貯豬屎豆營養(yǎng)成分、 發(fā)酵特性及體外培養(yǎng)參數(shù)等采用單因素方差進行分析，以P＜0.05 作為差異顯著性標準。

2 結果

2.1 不同豬屎豆資源栽培效果 由表3 可知，第一組（產量＜7 t）中，T4 的生物量最高，約為6.88 t/hm2，高于產量最低的T7 組1.8 倍（3.84 t/hm2）。 T6 和T15 的株高最高，分別為85.8 cm 和83.8 cm。 莖/葉的干物質比值方面，T7 為表現(xiàn)最低。 在第二組（產量7 ～9 t）中，T1 和T12 生物量最高，分別為8.58 t/hm2和8.82 t/hm2。 T1 的株高為83.4 cm，顯著高于其他品種，T3 的莖/葉干物質比值最低，為0.49。 第三組（產量＞9 t）中，T5 的生物量最大，為12.7 t/hm2，T14 株高為109.4 cm，顯著高于同組中的其他品種，T13 莖/葉的干物質比值為0.42，T14最高，為0.73。

2.2 不同豬屎豆資源在青貯前后營養(yǎng)成分含量的變化 由表5 和表6 可知，在新鮮豬屎豆中，第一組的T6 和T7 粗蛋白質（CP）含量最高，分別為41.8%和43.7%，T15 的中性洗滌纖維和粗纖維含量最高，分別為43.6%和20.8%，T4 的磷含量在同組中含量最高，T15 的鉀含量表現(xiàn)最高。在第二組的幾個品種之間， 粗蛋白質含量沒有表現(xiàn)出顯著差異，粗蛋白質含量平均為37.9%。各品種之間的中性洗滌纖維和粗纖維含量沒有顯著差異。 第三組中各品種豬屎豆的粗蛋白質和中性洗滌纖維含量沒有顯著差異。三組中15 個豬屎豆品種的粗脂肪含量均高于10%。

表5 不同豬屎豆種質原樣營養(yǎng)成分

表6 不同豬屎豆種質青貯樣營養(yǎng)成分

2.3 不同豬屎豆資源青貯后的發(fā)酵品質 由表7可知， 第一組和第二組各品種之間的pH 沒有顯著差異，在第三組中，T13 pH 最低，為5.40（P＜0.05），其他品種高于T13 且各品種之間無顯著差異（P＞0.05）。揮發(fā)性氨態(tài)氮含量在各分組的各品種之間沒有顯著差異。 各處理組的各品種之間乳酸含量差異顯著，第一組的T6，第二組的T1 和第三組的T13 含量最高（在各組中），第二組和第三組的各品種之間乙酸和丁酸含量沒有顯著差異（P＞0.05），在第一組中，T6 的乙酸和丁酸含量明顯偏高（P＜0.05）。

表7 不同豬屎種質豆青貯樣發(fā)酵品質

2.4 青貯前后的不同豬屎豆在體外培養(yǎng)后對消化率和瘤胃液發(fā)酵特性的影響 由表8 和表9 可知，在新鮮的豬屎豆中，第三組的T13 干物質消化率最高，為56.3%，其次是第一組的T6 和第二組的T1，分別為49.9%和49.5%（P＜0.05）。 在產氣量方面，第三組的T13 最高，為29.0 mL/g，其次是第二組的T1，為26.2 mL/g（P＜0.05）。 第一組和第三組各品種之間的瘤胃液揮發(fā)性氨態(tài)氮沒有明顯差異（P＞0.05），第二組中T1 的揮發(fā)性氨態(tài)氮最高。 在揮發(fā)性脂肪酸方面，T7 的乙酸含量明顯高于同組其他品種（P＜0.05）。 在青貯豬屎豆中，第一組的T8 和第三組的T13 干物質消化率最高，分別為46.7%和44.3%，這兩個品種的產氣量均明顯高于同組中其他品種。

表8 不同豬屎豆種質原樣體外培養(yǎng)產氣、pH 及瘤胃發(fā)酵情況

表9 不同豬屎豆種質青貯樣體外培養(yǎng)產氣、pH 及瘤胃發(fā)酵情況

3 討論

3.1 不同豬屎豆資源的生物量和莖葉比 生物量是篩選飼用牧草的首要條件，T2、T5、T13 和T4大于9 tDM/hm2，顯著高于第一組和第二組品種，莖葉比值方面，比值越小，表明葉片部分越多，植物營養(yǎng)大部分集中在葉片部分，因此，根據生物量和莖葉比情況，T5 和T13 品種具有作為飼料資源進一步選育推廣的巨大潛力。

3.2 影響屎豆青貯前后粗蛋白質含量變化的因素 粗蛋白質含量是評定粗飼料營養(yǎng)價值的重要指標之一。 本試驗中， 青貯前第一組的T6（41.8%）、T7（43.7%），第二組的T1（39.1%），第三組的各品種之間無顯著差異。青貯后第一組的T4（39.8%）、T8（39.9%），第二組的T3（42.5%）和第三組的T13（36.5%）粗蛋白質含量在各組中最高。青貯厭氧發(fā)酵過程中， 產生大量能夠降解碳水化合物的酶類， 對青貯原料中纖維素等大分子物質的降解，可使青貯飼料中粗蛋白質含量增加（王啟芝，2020）。本研究中，經過青貯前后蛋白質含量統(tǒng)計后，發(fā)現(xiàn)除T3、T4 和T8 外，其他品種的粗蛋白質含量在青貯后均呈下將趨勢。 導致這種情況發(fā)生的原因， 可能是青貯樣中的粗蛋白質受到植物酶的作用，降解為非蛋白氮等，而在微生物的進一步作用下降解為氨， 從而影響了植株的粗蛋白含量（穆勝龍，2018）。氨態(tài)氮含量的高低也能夠說明青貯飼料中蛋白質分解程度，植物在青貯過程中，會因為酶和微生物的作用而造成蛋白質的降解（榮輝，2013），在本研究中，豬屎豆青貯過后其氨態(tài)氮含量約為10.29%，與胡海超等（2021）對青貯木薯莖葉（8.15%）的研究相比偏高，說明相比木薯莖葉青貯，豬屎豆青貯對蛋白質損耗更多。研究表明， 高品質青飼料的pH 一般為3.8 ~ 4.2 （王堅，2014）。在本試驗中，豬屎豆青貯后pH 為5.2~6.5，這也是導致豬屎豆青貯樣粗蛋白質含量降低的一個重要原因。 McDonald 等（1991）也曾指出，在高的pH 環(huán)境以及梭菌的發(fā)酵活動能夠造成大量蛋白質的降解。

3.3 青貯豬屎豆的發(fā)酵品質 本試驗并沒有發(fā)現(xiàn)豬屎豆青貯的發(fā)酵規(guī)律， 三個組豬屎豆在青貯后的pH 平均值分別為5.94、5.96 和5.95，青貯整體品質相對較差， 通過對各組分品種青貯有機酸組成分析發(fā)現(xiàn)， 盡管各分組中的乳酸含量表現(xiàn)了顯著差異，但并沒有顯示出變化規(guī)律，乙酸和丁酸在第二組和第三組內， 各品種之間也沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異。影響青貯品質的因素較為復雜，如植物的刈割階段、添加劑使用、發(fā)酵溫度、微生物組成以及原料中可溶性碳水化合物、 糖分的含量和種類（李勝開，2017）。

本研究青貯水分約為70%，貯藏溫度為28 ℃左右，是一個較好的外部環(huán)境。 有研究表明，牧草的水溶性碳水化合物（WSC）含量不足，會導致乳酸菌發(fā)酵活動受到影響，無法產生足量的乳酸，而在牧草自然青貯過程中， 附著在牧草上的乳酸菌數(shù)量和種類也是影響青貯發(fā)酵品質的一個重要因素（尉志霞，2019）。 本研究中總體乳酸含量偏低，約為7.6 g/kg，而第一組的T9、第三組的T2 乳酸含量分別為4.24、4.29 g/kg，顯著低于總體乳酸含量約0.8 個百分點， 這表明豬屎豆本身附著的乳酸菌數(shù)量及種類較少， 同時WSC 含量也不足，導致其青貯效果較差。 牧草的緩沖能也會對其青貯產生一定的影響，有研究指出，豆科牧草的蛋白質含量較高，因而也具有較高的緩沖能，這使得豆科牧草更難青貯（徐春城，2013）。 本研究中，豬屎豆樣品青貯后總體粗蛋白質含量也在34.8%左右，這使得豬屎豆擁有較高的緩沖能而影響其青貯效果。 盡管如此，T7、T1、T10 的pH 較低，乳酸含量較高，具有進一步挖掘豬屎豆青貯技術的潛力。

豬屎豆整體產量偏低， 基本定位是作為蛋白粗飼料進一步利用， 在未來應重點從混合青貯來進一步評價其價值和品質， 如與禾本科或高糖粗飼料混合發(fā)酵。另一方面，可考慮將其作為發(fā)酵型全混合日糧中的一個重要原料來進一步提升其應用價值。

3.4 影響豬屎豆青貯前后體外培養(yǎng)發(fā)酵參數(shù)變化的因素 體外產氣量可以直觀的反映出飼料的可消化性， 可以一定程度上反映反芻動物瘤胃中飼料降解特性和微生物的活動趨勢，是衡量飼料營養(yǎng)價值的一項重要指標 （Son，2003）。 本研究中，第一組的T6（25.7 mL/g）、T9（25.0 mL/g），第二組的T1（26.2 mL/g）和第三組的T13（29.0 mL/g）青貯前在各組中產氣量最高，而青貯后第一組的T8（21.5 mL/g），第二組的T3（19.0 mL/g）和第三組的T13（26.0 mL/g）產氣量在各組中最高，通過數(shù)據對比發(fā)現(xiàn)上述幾份種質的干物質消化率在該組中也最高。 通常情況下，產氣量與飼料中干物質消化程度呈正相關（楊晶晶，2020）。 本試驗再次驗證了這一現(xiàn)象。 據研究發(fā)現(xiàn)，體外發(fā)酵所產生的氣體量與發(fā)酵底物中的中性洗滌纖維呈負相關， 與飼料中的粗蛋白質含量呈正相關（Nsahlai，1994）。在本試驗中，豬屎豆原樣的中性洗滌纖維、 酸性洗滌纖維含量略低于青貯樣，但粗蛋白質含量及產氣量均略高于青貯樣，進一步驗證了這個說法。本試驗中瘤胃pH 為6.8 ～7.0，處于正常水平。 Van （1994） 的研究表明，pH 為6.7±0.5 是纖維素分解菌生長和活性的最適宜范圍。 此外，Sniffen 等（1992）發(fā)現(xiàn)，瘤胃pH 大于6.0 是蛋白質消化的最適宜范圍。 在反芻動物的碳代謝中，約66%的碳來自揮發(fā)性脂肪酸，是反芻動物進行生命活動的重要碳源，也是產生體脂的原料之一（王隆，2022；張華，2018）。研究表明，反芻動物體外干物質的消化率越高，產生的揮發(fā)性脂肪酸的濃度就越高， 瘤胃的pH 也就越低（莫放，2011；Stritzler，1998）。 相比豬屎豆青貯前后，瘤胃發(fā)酵產生的乙酸含量有所降低，而丙酸含量顯著升高， 這與張雨書（2022）、 Maggiolino等（2019）對木薯莖葉青貯的研究結果相似。本試驗中，體外培養(yǎng)變化結果表明，第一組的T4，第二組的T1、T3 及第三組的T2、T13 品種都有著較高的蛋白質利用率和干物質消化率。

4 結論

本試驗結果表明，豬屎豆單一青貯效果不佳，需結合混合青貯或添加促發(fā)酵劑來進一步探究其青貯技術。 T1（云南玉溪）、T4（海南海口）和T13（海南東方）品種具有較高粗蛋白質含量和較高的干物質消化率， 具有作為培育高產高蛋白牧草的潛力。T5 和T13 具有顯著偏高的生物量。綜上，本研究中T13（海南東方）品種具有作為新型蛋白飼料資源進一步利用的巨大潛力。