南酸棗葉原花青素的提取工藝優化及抗氧化活性研究

張 強， 渠淑潔， 戴 航

（廣西中醫藥大學藥學院公共衛生管理學院，廣西南寧 530299）

南酸棗又名廣棗，在我國主要分布在江西、廣西、廣東、湖南、湖北、浙江、福建和貴州等地（堯云萍等，2021），目前也有人工育種種植（黃文輝等，2022）。 南酸棗的果實和樹皮都可以入藥（黃雨佳等，2021）， 南酸棗果實中含有營養成分和生物活性物質（Zeng 等，2019），如蛋白質、多糖、氨基酸、維生素、有機酸和酚類物質等，樹皮和樹葉中含有黃酮類化合物及苷類（周劍等，2017）。南酸棗果核具有醒酒、殺蟲作用，可以與一些植物合用，制成蚊香；樹皮具有抑菌、止血作用，樹葉具有明目作用，在醫學、食品等領域有很大的應用前景。 聶韡等（2022）發現，南酸棗果皮提取物的有較好的抗過敏功效。

原花青素含有酚羥基，具有抗癌、抗腫瘤、降血糖和預防心血管疾病等活性（楊博，2011），可用于治療白內障、 干眼癥和視網膜類疾?。ɡ畲宏柕龋?004）。 原花青素具有抗氧化能力、 自由基清除能力和抗衰老能力，且其毒副作用低，生物利用度高，可以用于化妝品和保健品的制作中（胥鑫萌等，2021）。 蔣彤等（2021）通過HPLC-MS 鑒定了南酸棗果皮含16 個原花青素成分。 南酸棗收貨后，葉子掉落后會當做肥料或者自然處理后遺棄，造成了大量資源浪費。南酸棗自然資源豐富，從南酸棗葉子中提取原花青素， 可為天然來源的抗氧化劑開發提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 南酸棗葉來源于南寧植物園。試驗所用試劑種類及來源見表1。

表1 試驗用試劑

1.2 儀器 試驗用儀器設備及來源見表2。

表2 試驗用儀器設備

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品準備 將清洗干凈的南酸棗葉，于110 ℃烘干24 h 至恒重，用粉碎機粉碎，過20 目篩，得南酸棗葉干粉備用。南酸棗葉原花青素提取步驟如下： 稱取南酸棗葉粉末一定量于磨口錐形瓶中，按一定液固比加入丙酮，置于預定溫度的超聲波振蕩器中提取，提取結束后將提取溶液2000 r/min 離心20 min，取上清液，進行旋轉蒸發后，得到原花青素粗提物，貼好標簽，備用。

1.3.2 紫外光譜 以甲醇為參比溶液， 把濃度為0.12 mg/mL 的南酸棗葉原花青素提取物進行紫外掃描，確定其最大吸收波長。

1.3.3 繪制標準曲線 取一定量兒茶素標準品，加入甲醇溶劑溶解后， 將其配制成標準溶液母液。配制濃度為0.04 ～0.20 mg/mL （間隔0.02 mg/mL）的標準溶液各5.0 mL。 配制0.04 g/mL 香草醛-甲醇溶液。 取香草醛-甲醇溶液5.0 mL，各系列濃度標液3.0 mL， 鹽酸1.0 mL， 混合于10 mL容量瓶，甲醇定容到10 mL，置于暗處反應1 h。于500 nm 測定吸光值，記錄數值，并作標準曲線。

1.3.4 樣品含量的測定 取一定量的南酸棗葉原花青素粗提物放置于燒杯中，溶解后定容（甲醇溶液）， 參照1.3.3 的試驗方法測定南酸棗葉原花青素得率。 根據標準曲線方程求出待測液中的原花青素含量， 然后求出1.0 g 南酸棗葉樣品中原花青素物質的含量（以兒茶素計，mg/g）。

1.3.5 單因素試驗 原花青素的提取中， 丙酮-水提法提取率最高（余修亮等，2018），可能是由于花青素中的酚羥基容易與丙酮的C=O 形成締合作用（李春陽等，2004）。因此本試驗采用丙酮作為提取溶劑。

1.3.5.1 時間對南酸棗葉原花青素得率的影響取1.0 g 南酸棗葉樣品粉末于錐形瓶中， 按液固比1:20 加入丙酮（70%）20 mL，于40 ℃分別提取4、6、8 min 和10 min。 結束后將提取液離心后旋蒸，得南酸棗葉原花青素粗品，備用，依據1.3.4 步驟計算原花青素得率。

1.3.5.2 料液比對南酸棗葉原花青素得率的影響取1.0 g 南酸棗葉樣品粉末于錐形瓶中， 按液固比1:15、1:20、1：25 和1:30 加入丙酮（70%），于40 ℃超聲提取8 min。 結束后將提取液離心后旋蒸，得南酸棗葉原花青素粗品，備用，依據1.3.4 步驟計算原花青素得率。

1.3.5.3 溫度對南酸棗葉原花青素得率的影響取1.0 g 南酸棗葉樣品粉末于錐形瓶中， 按液固比1:20 加入丙酮（70%）20 mL，分別在30、35、40、45、50 ℃超聲提取8 min。結束后將提取液離心后旋蒸，得南酸棗葉原花青素粗品，備用，依據1.3.4步驟計算原花青素得率。

1.3.5.4 丙酮濃度對南酸棗葉原花青素得率的影響 稱取1.0 g 南酸棗葉粉末于磨口錐形瓶中，設定超聲溫度為45 ℃， 按料液比1:20 加入體積分數為50%、60%、70%、80%和90%的丙酮進行試驗，超聲提取8 min。 結束后對提取液離心，濃縮后得南酸棗葉原花青素粗提取物， 備用， 依據1.3.4 方法進行定量分析。

1.3.6 正交試驗設計 在單因素試驗的基礎上，選擇超聲時間、料液比、超聲溫度、丙酮濃度4 個因素，以南酸棗葉原花青素的得率作為考察指標，設計正交試驗。 因素水平見表3。

表3 正交試驗因素水平

1.3.7 南酸棗葉原花青素的抗氧化活性

1.3.7.1 南酸棗葉原花青素對超氧自由基清除能力 將4.5 mL Tris-HCl 溶液30 ℃保溫15 min，之后加入1 mL 梯度濃度的南酸棗葉原花青素溶液和0.4 mL 25 mmol/L 的鄰苯三酚溶液，上下振蕩搖勻，之后在30 ℃保溫5 min，加入1 mL 濃度為8 mol/L 的氯化氫終止反應，然后在325 nm 處測定吸光度（A1），空白以蒸餾水代替樣品液，測定吸光度（A0）。 Vc 作為陽性對照進行試驗，并按照下列公式計算樣品對超氧陰離子自由基的清除率：

取不同濃度的南酸棗葉原花青素提取物0.1 g，稱取壞血酸0.1 g，蒸餾水溶解，定容25 mL，此溶液為母液。 分別從原花青素和壞血酸母液中移取不同體積的溶液，用10 mL 容量瓶進行定容，配成一系列濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、4 mg/mL的樣品液，備用。分別配制三氯乙酸、三氯化鐵、鐵氰化鉀溶液。 移取鐵氰化鉀2 mL、磷酸緩沖溶液3 mL 和不同濃度樣品液2 mL，定容至25 mL，混合均勻，在50 ℃水浴加熱30 min，稍冷，依次加入2.5 mL 三氯乙酸和2 mL 三氯化鐵，定容。在700 nm處進行測定，記錄數據。

1.3.7.2 南酸棗葉原花青素清除DPPH 自由基的研究 參考王晴晴等（2017）的方法測定南酸棗葉原花青素對DPPH 的清除效果，以空白樣對儀器進行校準。 分別取梯度濃度的南酸棗葉原花青素溶液2.0 mL 溶液于試管中，之后用移液器加濃度為0.04 mg/mL 的DPPH 2 mL， 于暗處放置300 min后在517 nm 測定吸光度（A1）； 以無水乙醇代替DPPH，按照上述方法測定吸光度（A2）；空白組按上述方法測定吸光度（A0），Vc 作為陽性對照進行試驗， 并按照下列公式計算樣品對DPPH 自由基的清除率：

1.3.7.3 南酸棗葉原花青素清除羥基自由基的研究 稱取0.1 g 南酸棗葉原花青素提取物和0.1 g壞血酸，用蒸餾水溶解，定容25 mL，此溶液為母液。 配制濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、4 mg/mL的南酸棗葉提取液。 移取2 mL 的水楊酸乙醇溶液（6 mmol/L），2 mL 的硫酸亞鐵溶液（6 mmol/L）和2 mL 的不同濃度的樣品溶液， 最后移取2 mL的雙氧水溶液（6 mmol/L），定容到25 mL，水浴30 min（37 ℃），于526 nm 下測定，吸光度值記為A1， 以純水代替樣品時溶液的吸光度值記為A2，不加雙氧水時的溶液作為空白。

1.4 數據處理 所有結果均表示為 “平均值±標準偏差”（±SD），并采用SPSS 20.0 軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 標準曲線圖

2.1.1 全波長掃描 由圖1 可知， 最大吸收波長λmax為500 nm。

圖1 全波長掃描圖

2.1.2 標準曲線圖 南酸棗葉原花青素所得的標準曲線如圖2 所示， 橫軸表示的是溶液的濃度（mg/mL），縱軸表示的是溶液吸光度A，線性方程式為：y=1.77317x-0.00845，R2=0.9973， 由其線性方程式可知，在濃度為0.06 ～0.2 mg/mL，原花青素線性關系良好。

圖2 標準曲線圖

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 時間對南酸棗葉原花青素得率的影響 從圖3 可知，在4 ~ 8 min 內，南酸棗葉原花青素得率與時間呈正相關關系， 在8 min 時提取率達到最大，繼續延長時間，南酸棗葉原花青素的提取率有所下降。 可能是因為超聲時間過長破壞南酸棗葉原花青素部分結構。因此，將正交優化范圍確定為6 ~ 10 min。

圖3 時間對南酸棗葉原花青素得率的影響

2.2.2 料液比對南酸棗葉原花青素得率的影響如圖4 所示，隨著液料比的增加，南酸棗葉原花青素的提取率呈上升趨勢，而液料比為1：20 時；南酸棗葉原花青素的得率最大；后面繼續增大樣品的液料比，南酸棗葉原花青素的得率呈下降趨勢。 可能是后面有其他雜質溶出，與南酸棗葉原花青素的溶出形成競爭關系，使得原花青素的得率降低。因此，將料液比正交優化范圍確定為1/15~1/25。

圖4 料液比對南酸棗葉原花青素得率的影響

2.2.3 溫度對南酸棗葉原花青素得率的影響 如圖5 所示，在30 ～45 ℃，南酸棗葉原花青素得率隨溫度升高而增加；在溫度超過45 ℃，南酸棗葉原花青素得率呈下降趨勢，可能由于溫度較高時，原花青素有分解情況發生， 且丙酮揮發變強。 因此，將溫度的正交優化范圍確定為40 ~ 50 ℃。

圖5 溫度對南酸棗葉原花青素得率的影響

2.2.4 丙酮濃度對南酸棗葉原花青素得率的影響如圖6 所示，在丙酮體積分數為0.5 ～0.7，南酸棗葉原花青素得率隨體積分數升高而增加； 在丙酮體積分數為0.7 時， 南酸棗葉原花青素得率達12.35 mg/g，之后有所下降，可能由于丙酮濃度高時，其他成分溶出也增加，使得原花青素溶出相對變少。因此，將丙酮體積分數的正交優化范圍確定為0.6 ~ 0.8。

圖6 溫度對南酸棗葉原花青素得率的影響

2.2.5 南酸棗葉原花青素正交試驗 依照正交設計原理和單因素試驗結果，選取超聲時間（A）、料液比（B）、溫度（C）和丙酮體積分數（D）四個因素，采用四因素三水平L9（34）正交試驗對南酸棗葉多酚的提取進行優化，結果見表4。

表4 正交試驗優化結果

由表4 分析可得，超聲時間、料液比、溫度和丙酮體積分數對超聲波輔助提取南酸棗葉原花青素的順序次第為溫度（C）＞丙酮體積分數（D）＞料液比（B）＞超聲時間（A），丙酮超聲輔助提取的最佳工藝條件為A2B3C2D2，即超聲時間8 min、料液比1：25、溫度45 ℃、丙酮體積分數0.7。在該條件下進行三次平行試驗， 南酸棗葉多酚得率為16.59、16.71 mg/g 和16.86 mg/g，平均得率為16.85 mg/g，試驗結果具有較高的穩定性和可靠性。

2.3 抗氧化活性研究

2.3.1 南酸棗葉原花青素的超氧自由基清除能力由圖7 可知， 南酸棗葉清除超氧自由基的能力隨濃度增加呈增大趨勢，在0.1 ～0.5 mg/mL 濃度下，清除能力快速上升， 之后趨于平緩， 在濃度為2 mg/mL 時對超氧自由基清除率可達75%。 在相同濃度條件下， 南酸棗葉原花青素對超氧自由基的清除能力弱于VC。

圖7 南酸棗葉原花青素對超氧自由基的清除能力

2.3.2 南酸棗葉原花青素對DPPH 清除能力 由圖8 可知，在0.5 ～1.5 mg/mL 內，南酸棗葉原花青素對DPPH 的清除能力隨濃度增加而增強。 在1.5 ～3.0 mg/mL， 南酸棗葉原花青素對DPPH 的清除能力趨于穩定。 結果表明南酸棗葉原花青素對DPPH 有清除作用，但弱于VC。 南酸棗葉原花青素對DPPH 自由基的IC50為0.83 mg/mL。

圖8 南酸棗葉原花青素清除DPPH 自由基能力

2.3.3 南酸棗葉原花青素對羥基自由基清除能力由圖9 可知，在濃度0.5 ～2.0 mg/mL 內，南酸棗葉原花青素對OH 的清除能力隨濃度增加較快，在2.0 ~ 3.0 mg/mL 增加緩慢而趨于穩定。 表明南酸棗葉原花青素對OH 有一定的清除作用， 但弱于VC，其對OH 自由基的IC50為1.5 mg/mL。

圖9 南酸棗葉原花青素清除羥基自由基能力

3 結論

試驗通過超聲輔助法提取南酸棗葉原花青素，考察了提取時間、料液比、溫度和丙酮濃度對得率的影響， 結合正交試驗設計對提取工藝進行了優化。 結果顯示： 南酸棗葉原花青素超聲輔助法最佳條件為超聲時間8 min、料液比1∶25、溫度45 ℃、丙酮體積分數0.7。 該條件下，原花青素得率可達16.85 mg/g。 抗氧化試驗測試表明，南酸棗葉原花青素對超氧自由基、OH 和DPPH 自由基有一定的清除能力， 其中對DPPH 和OH 自由基IC50分別為0.83 mg/mL 和1.50 mg/mL。 說明南酸棗葉原花青素有較好的抗氧化活性。