響應面法優化柞蠶蛹蟲草活性肽提取工藝研究

劉博佳， 李正鈺， 柳葉飛， 王 澤，5， 徐方旭

（1.沈陽師范大學生命科學學院，遼寧沈陽 110034；2.沈陽師范大學糧食學院，遼寧沈陽 110034；3.沈陽師范大學實驗教學中心，遼寧沈陽 110034；4.遼寧省功能性蛹蟲草重點實驗室，遼寧沈陽 110034；5.沈陽市功能性蛹蟲草產業技術研究院，遼寧沈陽 110034；6.遼寧省蛹蟲草種質資源庫，遼寧沈陽 110034）

活性肽在自然界中廣泛存在并且具有多種生理活性（黃靜雅等，2020），可改善人們的健康狀況，用于疾病的預防及治療，例如免疫調節、增強骨密度、降血脂等（錢磊等，2016；李勇等，2010）。 因此，活性肽是篩選藥物、制備保健食品、食品添加劑以及疫苗的天然資源（李亞潔等，2020；李晶等，2014；張勝等，2010），在生物醫藥及保健食品領域具有廣闊的應用前景 （Xian 等，2021；Liu 等，2020；Wang等，2018；孫亞男等，2017；劉潔等，1997）。

活性肽是蛋白質的功能活性片段， 可以提供生長發育所需營養元素， 其跟蛋白質比起來有獨特的生理活性特點。活性肽由于體積小、在體內使用率高而有著良好的健康推動作用。近幾年，日本和英國等國家已用活性肽功能因子開發出各種美妝類產品和老年人食品等系列產品， 并取得良好的反饋，增加了社會和經濟效益。

柞蠶蛹蟲草富含蛋白質（都興范等，2021），是制備活性肽的首選材料。 但由于缺少產品精深加工，無法有效提高柞蠶蛹蟲草相關產品的附加值。目前， 以菌菇類為材料制備活性肽的研究已有較多報道（張芳藝等，2023；熊川等，2019；劉果等，2017），制備方式方法也很多，其中酶解法因具有工藝成熟、副產物生成少、專一性好、人體容易吸收等優勢而備受關注。 本文主要對柞蠶蛹蟲草蛋白的酶解條件進行優化（張禹等，2021； 蘆鑫等，2018；馬淑慧等，2017），旨在提供一種高效的柞蠶蛹蟲草蛋白酶解方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 供試材料：柞蠶蛹蟲草由沈陽師范大學特種菌業研究所提供。

主要試劑：硫酸銅，酒石酸鈉鉀，鹽酸，氫氧化鈉，硫酸，蒽酮，堿性蛋白酶，胰蛋白酶。

雙縮脲試劑配制： 溶解1.5 g 硫酸銅和6.0 g酒石酸鉀鈉于500 mL 去離子水中， 在攪拌下加入300 mL 的10%氫氧化鈉溶液， 用水稀釋到1 L，貯存于內壁涂以石蠟的瓶中備用標準牛血清蛋白溶液配制： 用0.05 mol/L 的氫氧化鈉溶液配制濃度為5 g/L 的牛血清蛋白溶液。

1.2 儀器與設備 ESJ-182 型電子天平購自中國沈陽市龍騰電子有限公司；TG1650-W 型高速離心機購自上海盧湘怡離心機儀器有限公司；CS-Ⅲ型高純水發生儀購自經緯分析儀器有限責任公司；SB25-12 型超聲波清洗機購自寧波新芝生物科技技術股份有限公司；H-H 型數顯恒溫水浴鍋購自金壇金城國勝實驗儀器廠；UV-5100 型紫外分光光度計購自上海元析儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 柞蠶蛹蟲草蛋白質的制備 柞蠶蛹蟲草干品置于55 ℃烘箱中，待完全烘干后稱取100 g 樣品加入1000 mL 水浸泡0.5 h，撈出后擠干水分剁碎，再放入之前用來浸泡的1000 mL 水中，溫火煮1 h 后用紗布過濾。重復2 次，再用多層紗布過濾，浸提液定容至1 L 備用。

用0.1 mol/L 的NaOH 溶液將上述浸提液pH調至10.0。浸提1 h，6000 r/min 離心15 min，取上清液，再用0.1 mol/L 的HCl 將上清液pH 調至等電點，靜沉1 h，待沉淀析出后，6000 r/min 離心15 min，得到蛋白質沉淀。 將沉淀調至中性后進行冷凍干燥制得柞蠶蛹蟲草蛋白粉， 保存到離心管中備用。

1.3.2 單因素試驗設計 在預試驗基礎上篩選結果，選取最佳的酶組合（堿性蛋白酶+胰蛋白酶），從加酶量、酶解時間、酶解pH 和反應溫度四個因素進行考察， 確定四個因素對柞蠶蛹蟲草蛋白液酶解程度的影響。

1.3.3 響應面優化試驗 在單因素試驗結果的基礎上，采用Design Expert 10 Box-Behnken 試驗設計方案，以酶解時間（A）、加酶量（B）、pH（C）和反應溫度（D）為影響因素，以多肽得率為響應值，設計四因素三水平的響應面試驗（王元川等，2023；金司陽等，2023）， 優化柞蠶蛹蟲草活性肽的提取工藝（鄭冰姝等，2021；張睿，2015），響應面試驗因素與水平設計詳見表1。

表1 響應面試驗因素與水平設計

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 加酶量對多肽得率的影響 由圖1 可知，當底物一定時， 多肽得率隨加酶量的增加呈先升高后下降最終趨于平緩的趨勢。 當加酶量達到2%時，多肽得率最大，為75%。隨著酶量的繼續增加在2% ~ 2.5%時， 多肽得率呈下降趨勢， 降至60%之后， 盡管酶量繼續增加， 多肽得率穩定在60%左右。 因此2%的加酶量為最佳比例。

圖1 加酶量對多肽得率的影響

2.1.2 反應溫度對多肽得率的影響 由圖2 可知，從總體上看，在一定的溫度變化范圍內，多肽的得率隨溫度的升高而升高，當溫度達到55 ℃時多肽提取率最高，為50%。 當溫度高于55 ℃后，多肽得率有輕微下降的趨勢，但差異較小。通過酶的相關特性可知， 當溫度過高時會影響酶的活性，導致轉化率降低，所以推測高于55 ℃后的下降趨勢是因此產生。 所以，確定多肽提取的最佳溫度為55 ℃，并將55 ℃作為響應面試驗設計的中心點。

圖2 反應溫度對多肽得率的影響

2.1.3 反應時間對多肽得率的影響 由圖3 可知，酶解時間達2 h 的多肽得率最高，為55%。 短于或長于這個時間， 多肽的得率均低于55%，由圖可明顯看出，隨著時間的繼續延長，多肽得率呈下降趨勢，當酶解時間到6 h 后，多肽得率基本平穩，在45%左右輕微波動。 因此，應選擇2 h 作為最佳酶解時間。

圖3 酶解時間對多肽得率的影響

2.1.4 pH 對多肽得率的影響由圖4 可知，多肽得率隨pH 的增加呈先增加后減少的趨勢。 pH為7 ～8 時多肽得率穩定在48%左右，當pH 繼續升高到9 后，此時多肽得率最高，達到55%。 pH升高到10 時，多肽得率仍穩定在55%。 而后，隨著pH 的繼續升高，多肽得率開始下降。 因此，pH在9 ～10，均是可選擇的最佳酶解pH。

圖4 pH 對多肽得率的影響

2.2 響應面優化試驗分析 采用Box-Behnken設計方法，以多肽得率為評定指標，分別進行29組試驗， 采用Design-Expert 10 軟件對數據進行響應面回歸擬合，響應值（Y）和各因子（A、B、C、D） 之間的二次回歸模型為：Y=83.52-0.63A-0.87B-8.95C+2.57D-17.88AB+3.57AC+16.55AD-1.48BC +4.55BD +6.3CD -17.54A2-14.01B2-15.21C2-13.26D2。 回歸模型方差分析見表2。

表2 響應面試驗方差分析

失擬項P 值為0.1726＞0.1， 表明二次模型擬合程度較好， 能準確反映不同條件對柞蠶蛹蟲草多肽得率的影響。模型系數分析表明，預測值與實際值之間誤差較小，一次項對模型具有顯著性影響（P＜0.05），根據F 值可知，試驗各因素對柞蠶蛹蟲草多肽得率影響的強弱順序依次為：pH＞加酶量＞反應溫度＞酶解時間。

2.3 響應面交互作用分析 利用Design-Expert 10 軟件繪制四個因素交互作用對柞蠶蛹蟲草多肽提取率影響的響應圖。 由圖5 可知，pH、酶解時間、反應溫度和加酶量對多肽得率的影響均顯著，其中，pH 對多肽得率的影響最為顯著。 通過對響應面坡度， 等高線密度以及性狀等多方面對比分析四種因素對柞蠶蛹蟲草多肽得率的影響順序為：pH＞酶解時間＞反應溫度＞加酶量。

圖5 四因素對多肽得率影響的響應面圖

2.4 最佳提取工藝的確認與驗證 根據響應面軟件得出的數據分析可知， 柞蠶蛹蟲草蛋白液最優酶解條件為：酶解時間2.81 h、加酶量2%、pH 9.77、反應溫度56.04 ℃。考慮到試驗的可操作性，調整最佳酶解條件為： 酶解時間2.8 h、 加酶量2%、pH 9.7、反應溫度56 ℃。 按照修正條件進行三次平行試驗進行驗證， 測得柞蠶蛹蟲草多肽得率平均值為86.1%，與預測值87.52%接近，表明最佳提取條件下提取的多肽得率比較穩定， 該模型能較好地預測輔助提取柞蠶蛹蟲草活性肽。

3 結論

本試驗在單因素試驗的基礎上， 對柞蠶蛹蟲草蛋白的提取條件采用響應面法進行優化。 結果表明， 柞蠶蛹蟲草蛋白的最優提取條件為酶解時間2.8 h、加酶量2%、pH 9.7、反應溫度56 ℃。 在此條件下， 提取的多肽得率為86.1%， 與預測值87.52%接近，說明該條件下提取的柞蠶蛹蟲草多肽得率較高，該模型具有較好的預測性，可為今后柞蠶蛹蟲草產業化開發應用提供依據。