基于生物信息學技術和機器學習算法篩選急性心肌梗死核心基因

李淑娟，柯妍，劉旭東，賀茜，徐遙琴，田宇佳，盧冠軍，馬娟，朱澈，汪樂新，

作者單位：1.750004 寧夏回族自治區銀川市，寧夏醫科大學總醫院急診科 2.750003 寧夏回族自治區銀川市第一人民醫院全科醫學科 3.750004 寧夏回族自治區銀川市，寧夏醫科大學總醫院心胸外科 4.750004 寧夏回族自治區銀川市，寧夏醫科大學 5.750001 寧夏回族自治區銀川市婦幼保健院兒科

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）指動脈內壁斑塊導致流向心臟的血液減少甚至中斷，進而使心肌細胞發生缺血缺氧性損傷［1］。但心肌細胞是永久性細胞，其損傷后一般不能再生［2］，故早期篩查AMI高風險人群具有重要的現實意義。近年來生物信息學技術在疾病診斷和預測方面應用廣泛，而基因代謝組學作為生物信息學技術，其主要探究基因與疾病的關系［3-4］。目前，基于基因代謝組學探究肝癌、胃癌等核心基因的文獻較多［5-6］，但應用該技術篩選AMI核心基因的報道較少。機器學習是基于數據構建的計算模型。本研究旨在通過生物信息學技術和機器學習算法篩選AMI核心基因并進行驗證，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗時間

本實驗時間為2021—2022年。

1.2 采用生物信息學技術篩選差異表達基因

1.2.1 數據來源

從美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的高通量基因表達（Gene Expression Omnibus，GEO）數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載與AMI相關的3個mRNA基因芯片數據集（GSE34198、GSE66360和GSE83500），其中GSE66360〔非AMI患者20例（對照組），AMI患者17例（AMI組）〕和GSE83500〔健康對照者46例（對照組），AMI患者49例（AMI組）〕為測試集，GSE34198〔健康對照者46例（對照組），AMI患者49例（AMI組）〕為驗證集。

1.2.2 篩選差異表達基因

運用R 4.2.0軟件中的“limma包”，以|log2FC|＞1、P＜0.05為標準，篩選GSE66360和GSE83500中差異表達基因。

1.2.3 GO功能富集分析、KEGG通路富集分析

應用差異表達基因數據軟件對差異表達基因進行GO功能富集分析，分析其主要富集的生物過程（biological process，BP）、細胞成分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）；通過Metascape官網（https://metascape.org）對差異表達基因進行KEGG通路富集分析。

1.3 采用機器學習算法篩選核心基因

使用LASSO回歸方法縮小差異表達基因的范圍，然后使用支持向量機-遞歸特征消除（support vector machine-recursive feature elimination，SVM-RFE）方法在差異表達基因中尋找特征基因，取兩種機器學習算法的交集，即為核心基因。

1.4 核心基因表達水平及預測能力

比較測試集中AMI組和對照組核心基因表達水平，繪制ROC曲線以評估核心基因表達水平對測試集、驗證集受試者發生AMI的預測價值，AUC為0.5～1.0，其值越大提示核心基因表達水平對AMI的預測價值越高。

1.5 細胞實驗驗證核心基因

1.5.1 實驗細胞

大鼠心肌細胞株H9C2購自武漢普諾賽生物科技有限公司。

1.5.2 主要實驗試劑與儀器

胎牛血清（Gibco，美國），DMEM 培養基（Gibco，美國），總RNA提取試劑盒（Axygen，美國），PrimeScript? RT reagent Kit（Takara，日本），TB Green? Premix Ex Taq? Ⅱ（Takara，日本），IL1R2、NR4A2、TREM1引物〔生工生物工程（上海）股份有限公司〕；微量臺式離心機（5810R）（Eppendorf，德國），熒光定量PCR儀（Applied Biosystems）（德國耶拿分析儀器股份公司），厭氧培養袋及厭氧產氣包（AnaeroPack-Anaero）（三菱公司，日本）。

1.5.3 細胞培養

采用含10%胎牛血清的DMEM培養液培養心肌細胞，將其置于37 ℃、95% O2、5% CO2培養箱中培養，當細胞匯合度達80%左右時進行傳代。

1.5.4 構建衰老心肌細胞模型及分組

采用D-半乳糖8 mg/ml刺激第2代心肌細胞9 d以制備衰老心肌細胞。將衰老心肌細胞按5×106個的數量接種到25T培養瓶中，然后隨機將其分為正常氧組和缺氧/復氧組，其中正常氧組心肌細胞常規培養；缺氧/復氧組心肌細胞缺氧3 h后復氧2 h，以制備AMI細胞模型。

1.5.5 qPCR法檢測IL1R2、NR4A2、TREM1 mRNA相對表達量

在25T培養瓶中收集正常氧組和缺氧/復氧組心肌細胞，按照總RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA，將RNA反轉錄成cDNA，采用2-ΔΔCt法計算IL1R2、NR4A2、TREM1 mRNA相對表達量。基因引物序列和產物長度見表1，擴增條件見表2。實驗獨立重復9次。

表1 基因引物序列和產物長度Table 1 Gene primer sequence and product length

表2 基因引物擴增條件Table 2 Gene primer amplification conditions

1.6 統計學方法

采用GraphPad Prism 6.0統計學軟件進行數據處理。計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 差異表達基因篩選結果

從GSE66360和GSE83500中篩選出145個AMI差異表達基因，其中上調差異表達基因125個、下調差異表達基因20個，見圖1。

圖1 差異表達基因的火山圖Figure 1 Volcano map of differentially expressed genes

2.2 GO功能富集分析結果

GO功能富集分析結果顯示，差異表達基因主要涉及的BP為細菌的防御反應、中性粒細胞趨化性、粒細胞趨化性、中性粒細胞遷移、粒細胞遷移、骨髓白細胞遷移、白細胞趨化性、細胞對白介素1的反應、白介素1介導的信號通路；主要涉及的CC為三級顆粒、特殊顆粒、分泌顆粒管腔、細胞質小泡腔、富含纖維膠凝蛋白1的顆粒膜、特殊顆粒管腔、三級顆粒膜、液泡管腔；主要涉及的MF為碳水化合物的結合物、免疫受體活性、晚期糖基化終末產物受體結合物、IgG結合物、病毒顆粒結合物、細胞核糖皮質激素受體結合物、肽聚糖溶血活性、核視黃醇X受體結合物、低聚糖結合物、調理素結合物。

2.3 KEGG通路富集分析結果

KEGG通路富集分析結果顯示，差異表達基因主要涉及的信號通路為天然免疫反應應答、吞噬細胞殺傷的正性調節的信號通路。

2.4 核心基因

在差異表達基因中，通過LASSO回歸分析篩選出10個特征基因，見圖2；通過SVM-RFE方法篩選出10個特征基因，見圖3；取交集得到9個核心基因，分別為NFIL3、IL1R2、NR4A2、IRAK3、VCAN、CCL20、TREM1、LYZ、ITLN1，見圖4。

圖2 差異表達基因的LASSO回歸分析結果Figure 2 LASSO regression analysis results of differentially expressed genes

圖3 差異表達基因的SVM-RFE方法分析結果Figure 3 SVM-RFE method analysis results of differentially expressed genes

圖4 差異表達基因的韋恩圖Figure 4 Venn diagram of differentially expressed genes

2.5 AMI核心基因表達水平及其預測價值

在測試集中，AMI組僅IL1R2、NR4A2、TREM1表達水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖5。ROC曲線分析結果顯示，IL1R2、NR4A2、TREM1 表達水平預測測試集受試者發生A M I 的AUC分別為0.648〔95%CI（0.534～0.756）〕、0.623〔95%CI（0.511～0.728）〕、0.622〔95%CI（0.502～0.730）〕，見圖6；IL1R2、NR4A2、TREM1 表達水平預測驗證集受試者發生A M I 的AUC分別為0.834〔95%CI（0.761～0.898）〕、0.866〔95%CI（0.802～0.923）〕、0.808〔95%CI（0.729～0.880）〕，見圖7。

圖5 測試集中對照組與AMI組IL1R2、NR4A2、TREM1表達水平比較的箱式圖Figure 5 Box plot of comparison of IL1R2，NR4A2 and TREM1 expression levels between the control group and the AMI group

圖6 IL1R2、NR4A2、TREM1表達水平預測測試集受試者發生AMI的ROC曲線Figure 6 ROC curve of IL1R2，NR4A2 and TREM1 expression levels in predicting AMI in subjects in test set

圖7 IL1R2、NR4A2、TREM1表達水平預測驗證集受試者發生AMI的ROC曲線Figure 7 ROC curve of IL1R2，NR4A2 and TREM1 expression levels in predicting AMI in subjects in validation set

2.6 qRT-PCR法驗證核心基因mRNA相對表達量

缺氧/復氧組心肌細胞IL1R2、NR4A2、TREM1 mRNA相對表達量高于正常氧組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 正常氧組與缺氧/復氧組心肌細胞IL1R2、NR4A2、TREM1 mRNA相對表達量比較（±s，n=9）Table 3 Comparison of relative expression levels of IL1R2，NR4A2 and TREM1 mRNA between normal oxygen group and hypoxia/reoxygenation group

表3 正常氧組與缺氧/復氧組心肌細胞IL1R2、NR4A2、TREM1 mRNA相對表達量比較（±s，n=9）Table 3 Comparison of relative expression levels of IL1R2，NR4A2 and TREM1 mRNA between normal oxygen group and hypoxia/reoxygenation group

組別IL1R2NR4A2TREM1正常氧組0.187±0.0430.127±0.0440.424±0.279缺氧/復氧組0.245±0.0290.257±0.0292.784±2.639 t值3.3157.3742.668 P值0.004＜0.0010.028

3 討論

AMI發病迅速且具有較高的死亡率［7-8］。目前，冠狀動脈造影是診斷AMI的“金標準”，但其屬于有創檢查，故尋找AMI非創傷性診斷方法具有臨床價值。本研究通過生物信息學技術和機器學習算法篩選出9個AMI核心基因，且在測試集中，AMI組僅IL1R2、NR4A2、TREM1表達水平高于對照組；ROC曲線分析結果顯示，IL1R2、NR4A2、TREM1表達水平預測測試集受試者發生AMI的AUC分別為0.648、0.623、0.622，三者預測驗證集受試者發生AMI的AUC分別為0.834、0.866、0.808；且缺氧/復氧組心肌細胞IL1R2、NR4A2、TREM1 mRNA相對表達量高于正常氧組，提示IL1R2、NR4A2、TREM1是AMI核心基因。

RONG 等［9］研究表明，IL1R2 基因多態性（rs11674595、rs4851527、rs2072472和rs3218977）可能與中國漢族人群骨質疏松癥的發病有關，但其在AMI中的作用有待深入挖掘。NR4A2屬于核受體4A亞家族，其編碼類固醇甲狀腺激素類維生素A受體，是核受體轉錄因子，而核受體轉錄因子在哺乳動物神經元發育、炎癥、記憶形成等方面具有調節作用。研究表明，NR4A2基因突變與癲癇發作、神經發育異常和機體發育異常有關［10-13］。KARKI等［14］研究表明，NR4A2在膠質母細胞瘤中是促癌基因，且其在心血管應激反應中具有重要作用。ASHRAF等［15］研究表明，在成年哺乳動物心臟，特別是在心肌細胞中，在β-腎上腺素能刺激下NR4A2表達明顯上調，其特異性過表達導致終末分化的心肌細胞重新進入細胞周期和DNA復制增加，但不導致心肌細胞分裂。TREM1是髓樣細胞觸發性受體家族成員，屬于免疫球蛋白超家族受體，其主要功能是識別外源性抗原和毒性物質，從而調節炎癥反應［16］。LIU等［17］研究表明，TREM1放大了腦源性和腸源性免疫原性成分的促炎反應，在TREM1上表達的觸發受體可在多種心血管疾病中驅動炎癥反應。VANDESTIENNE等［18］研究表明，TREM1可參與腹主動脈瘤的病理生理過程。KIMMOUN等［19］研究表明，TREM1與心源性休克患者90 d死亡率和各種器官損傷有關，但其在AMI中的具體分子機制尚不清楚。

4 結論

綜上所述，IL1R2、NR4A2、TREM1是AMI核心基因，三者有望成為AMI潛在的生物標志物。但本研究仍存在一定局限性：（1）無法闡明IL1R、NR4A2、TREM1導致AMI的具體機制；（2）無法明確IL1R、NR4A2、TREM1是否與其他組學有關，如代謝組學、蛋白組學等。

作者貢獻：李淑娟進行文章的構思與設計，負責撰寫、修訂論文；柯妍進行研究的實施與可行性分析；劉旭東、賀茜、徐遙琴進行數據收集、整理、分析；田宇佳、盧冠軍、馬娟、朱澈進行結果分析與解釋；汪樂新負責文章的質量控制及審校，并對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。