牛呼吸道合胞體病毒一步法實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應用

梁曉珊，寧鵬，李小龍，鮑顯偉，李昊，石亞楠，王雪妍，郭雪蓮，許立華

(寧夏大學動物科技學院，寧夏 銀川 750021)

牛呼吸道合胞體病(bovine respiratory syncytial disease，BRSD)是由牛呼吸道合胞體病毒(bovine respiratory syncytial virus，BRSV)引起的一種呼吸道傳染病，是牛呼吸道疾病綜合征(bovine respiratory disease complex，BRDC)的主要疾病之一[1]。BRSV主要通過空氣飛沫傳播，可感染牛、羊等多種反芻動物，其中2～6月齡犢牛的發病率高，但單獨感染后死亡率較低[2-3]。牛感染BRSV后，可繼發細菌感染，出現嚴重間質性肺炎、上呼吸道感染等多種嚴重臨床癥狀，引起泌乳奶牛產奶量下降或廢絕、妊娠母牛流產和犢牛死亡。已有研究發現BRSV影響牛氣管上皮細胞對多殺性巴氏桿菌的黏附作用，使病原侵入下呼吸道后發生更為嚴重的繼發感染[4-5]。BRSD傳染性強，在全球范圍內流行，增加奶牛及肉牛養殖、治療成本，嚴重影響我國畜牧業經濟穩定發展。

BRSV的熒光定量PCR檢測方法靶基因多為N基因及部分F基因，而隨著病毒的傳播變異，這些檢測技術具有一定的局限性[6-8]。近期，郭兵等[8]根據BRSV的F基因建立TB Green Ⅱ 熒光定量PCR檢測方法，該方法特異性良好且最低檢測限達39 copies/μL。常益銘等[9]根據N基因建立恒溫隔絕式熒光RT-PCR檢測方法，該方法敏感性高，最低檢測限為3.45 copies/μL。上述的檢測方法可為BRSV的檢測提供新的技術支撐，但在檢測中，反轉錄過程中反復開蓋容易造成污染，影響結果的準確性。

綜上，本研究基于BRSV M基因保守序列，建立檢測BRSV的一步法實時熒光定量PCR，并初步應用于牧場臨床樣品檢測，旨在為寧夏地區BRSD的流行病學調查提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 核酸及臨床樣品

BRSV陽性樣品，牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)、牛支原體、牛冠狀病毒、牛細小病毒、金黃色葡萄球菌、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、牛源腸球菌等病原的核酸樣品均由本實驗室保存。94份臨床樣品采自寧夏各規模化牧場。

1.2 主要試劑

病毒RNA提取試劑盒(Kit R6874)、瓊脂糖膠回收試劑盒(Kit D2500)購自廣州飛揚生物工程有限公司；逆轉錄試劑盒(6210A)、pMD18-T(6011)等購自寶生物工程(大連)有限公司；2 ×TaqPlus Master Mix(P211)、HiScript II U+One Step qRT-PCR Probe Kit(Q223)購自諾唯贊生物科技股份有限公司；氨芐青霉素、瓊脂糖購自大連美侖生物技術有限公司；LB液體培養基、LB固體培養基購自生工生物工程有限公司；5 × Prestained Loading Dye、Prestained DL2000 DNA Marke 購自禮美生物科技(上海)有限公司；50 × TAE緩沖液購自北京雷根生物技術有限公司；DH5α、質粒小提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

M. DL-2000 Marker；1. pMD18-T-BRSV-重組質粒。

1.3 試驗方法

1.3.1 引物及探針設計與合成

基于 GenBank數據庫中BRSV現有病毒基因組序列，使用MAFFT對序列進行比對，選擇BRSV M蛋白基因保守區域，使用NCBI Primer designing Tool 引物設計工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設計BRSV通用型引物及探針(表1)。其中，TaqMan探針使用5′-FAM、BHQ1-3′修飾，擴增后的目的片段大小為141 bp。引物及探針交由生工生物工程有限公司合成。

表1 BRSV引物、探針序列信息

1.3.2 標準質粒構建

使用BRSV-F、BRSV-R對BRSV的cDNA進行擴增及膠回收后，與pMD18-T在16 ℃條件下進行過夜連接，并轉化至DH5α，獲得重組質粒pMD18-T-BRSV。經測序驗證正確后使用質粒小提試劑盒進行質粒提取，使用NanoDrop One測質粒濃度后分裝至于-80 ℃ 冰箱保存。

1.3.3 反應條件優化

基于HiScript II U+One Step qRT-PCR Probe Kit的推薦體系，以107copies/μL的pMD18-T-BRSV標準質粒為模板。使用梯度溫度法對反應體系的溫度進行優化，其中，梯度溫度分別為58 ℃、57.4 ℃、56.2 ℃、54 ℃、51.3 ℃、49.2 ℃、47.7 ℃、47 ℃等8種；使用棋盤法對引物及探針濃度進行優化，其中引物的濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和0.9 μmol/L，探針濃度設計為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40和0.45 μmol/L，確定該引物探針最佳擴增條件。

1.3.4 標準曲線的建立

以102～109copies/μL 重組質粒為模板，每個稀釋度的標準質粒使用1.3.3中優化后的最佳條件進行3次重復檢測，繪制該檢測方的標準曲線。

1.3.5 敏感性檢測

選取濃度為100～109copies/μL 10個不同的濃度pMD18-T-BRSV重組質粒為模板，對檢測方法的敏感性進行驗證。

1.3.6 特異性檢測

采用1.3.1設計的引物探針及優化后的反應條件對IBRV、牛支原體、牛冠狀病毒、牛細小病毒、金黃色葡萄球菌、BVDV、牛源腸球菌、BRSV等8種病原的核酸進行擴增，以ddH2O為陰性對照，以107copies/μL標準質粒為陽性對照；采用優化后的最優反應條件進行該方法的特異性驗證。

1.3.7 重復性檢測

將pMD18-T-BRSV重組質粒進行10倍倍比稀釋，選取105、106和107copies/μL的pMD18-T-BRSV重組質粒為模板，對該檢測方法的組內重復性及組間重復性進行驗證，使用變異系數評估該檢測方法的重復性。

1.4 臨床樣品檢測

對收集到的94份血清樣品，使用病毒RNA提取試劑盒提取核酸后進行檢測，并使用魏碩佟等[10]建立的BRSV單一PCR檢測方法進行檢測，比較兩種檢測方法的檢測結果，評估建立的BRSV一步法實時熒光定量PCR檢測方法在實際生產應用中的可行性。

2 結果與分析

2.1 重組質粒標準品的構建

以BRSV 核酸為模板，逆轉錄后使用表1中引物BRSV-F、BRSV-R 進行 PCR擴增，擴增產物經電泳純化回收后與pMD18-T載體連接，構建重組質粒標準品。以pMD18-T-BRSV重組質粒為模板，使用BRSV特異性引物BRSV-F、BRSV-R對質粒pMD18-T-BRSV-F進行擴增，擴增產物大小為141 bp，與預期目的片段大小一致，結果見圖1。

2.2 BRSV熒光定量PCR檢測方法的反應條件優化

2.2.1 溫度優化

使用58 ℃、57.4 ℃、56.2 ℃、54 ℃、51.3 ℃、49.2 ℃、47.7 ℃、47 ℃ 8種不同溫度對擴增反應的退火溫度進行優化，試驗結果表明，該反應體系最優擴增條件為：55 ℃ 15 min逆轉錄；95 ℃ 30 s預變性；95 ℃ 10 s、54 ℃ 30 s，共40個循環。

2.2.2 引物及探針濃度優化

采用棋盤法對擴增體系中的引物及探針濃度進行優化，試驗結果表明，該引物及探針的最優反應體系(20 μL)：2 × One Step U+Mix 10 μL，One Step U+Enzyme Mix 1 μL，ddH2O 5.8 μL，上下游引物各0.4 μL，探針0.4 μL，模板RNA 2 μL。

2.3 標準曲線的建立

使用優化后的最佳反應條件，以102～109copies/μL 8種濃度的重組質粒為模板進行擴增，每個濃度的模板進行3個重復；擴增后對Ct值求取平均值后結合模板質粒濃度繪制標準曲線；根據擴增結果及模板拷貝數繪制的標準曲線為y=-0.299 8x+11.724，R2=0.997 4，斜率k=-0.299 8，表明該標準曲線線性關系良好(見圖2)。

圖2 pMD18-T-BRSV熒光定量PCR標準曲線

2.4 敏感性試驗

采用優化后的反應體系及擴增條件，以100～109copies/μL 10個不同的濃度pMD18-T-BRSV重組質粒為模板進行擴增。試驗結果表明，該反應體系陰性對照無擴增，檢測下限為10 copies/μL(圖3)。

N. ddH2O；1～10. pMD18-T-BRSV質粒濃度分別為109，108，107，106，105，104，103，102，10和1 copies/μL。

2.5 特異性試驗

使用表1的引物及探針對IBRV、牛支原體、牛冠狀病毒、牛細小病毒、金黃色葡萄球菌、BVDV、牛源腸球菌、BRSV 8種病原的核酸進行擴增。試驗結果表明，除陽性對照及BRSV核酸正常擴增外，陰性對照及其他病原無擴增(圖4)，即檢測方法可與其他呼吸道病原進行鑒別，表明該方法特異性較好。

S. pMD18-T-BRSV標準質粒；N. ddH2O；1. BRSV；2. IBRV；3. 牛支原體；4. 牛冠狀病毒；5. 牛細小病毒；6. 金黃色葡萄球菌；7. BVDV；8. 牛源腸球菌。

2.6 重復性試驗

使用最優體系及最佳擴增條件對105、106和107copies/μL的pMD18-T-BRSV重組質粒為模板，對該檢測方法的組內重復性及組間重復性進行驗證。結果如表2所示，該檢測方法的組內及組間的變異系數均小于2%，表明方法的重復性較好。

表2 實時熒光定量PCR組內及組間重復性試驗

2.7 臨床樣品檢測

用本研究建立的BRSV一步法實時熒光定量PCR檢測方法，對取自寧夏不同牧場的94份血清樣本進行檢測，同時使用魏碩佟等[10]建立的BRSV普通PCR檢測方法檢測，結果如表3所示。BRSV一步法實時熒光定量PCR方法檢出陽性樣品5份，檢出率為5.3%；普通PCR方法檢出0份。說明本研究建立的方法比普通PCR方法能更靈敏地檢測到BRSV。

表3 實時熒光定量PCR組內及組間重復性試驗結果

3 討論

近年來，我國多地區存在BRSV的流行，嚴重困擾養牛業的健康發展。魏碩佟等[10]發現寧夏地區BRSV陽性率為15.05%；姜利霞等[11]發現湖南省BRSV陽性率為0.84%；趙毅等[12]發現東北三省BRSV感染率為32.75%。預防BRSD及其他呼吸道傳染病的主要措施是加強飼養管理和疫苗接種。疫苗接種雖然取得了較好的防控效果，但目前依然存在局限性，影響疫苗的整體免疫效果[13]。因此對該病的主動高效檢測及監測，對BRSD的防控有重要意義。

熒光定量PCR技術已被應用于多種疾病的檢測診斷。研究人員已采用SYBR Green Ⅰ染料法和TaqMan探針基于N基因建立多種針對BRSV的檢測方法，如孫曉波等[14]基于SYBR Green Ⅰ染料法建立N基因熒光定量PCR；韋佳塔等[15]與齊力格爾等[16]建立N基因熒光探針PCR檢測方法。在熒光定量PCR檢測中，探針和引物的選擇對檢測方法建立至關重要，對檢測靈敏度和準確性影響很大[17]。本研究以BRSV M蛋白為靶標基因，設計特異性引物探針，通過對優化反應條件、引物和探針濃度等多種條件進行優化，選取最適引物探針濃度及反應條件，建立一步法實時熒光定量PCR。

本研究建立的BRSV一步法熒光定量PCR檢測方法具有特異性強、敏感性高的特點，檢測下限可以達到 10 copies/μL，且可有效減少反復開蓋導致的交叉污染。此外，該檢測方法重復性好，組內及組間的變異系數均小于2%。對本實驗室2023年第一季度收集的94份血清樣本進行檢測，發現BRSV陽性率為5.3%，提示BRSD在寧夏地區存在一定的流行，該檢測結果對了解寧夏地區BRSD的流行病學信息具有一定意義。

綜上，在今后的疫病監測工作中，應加強對包括BRSD在內的牛呼吸道疾病的檢測與監測，防范BRSD在我國發生大范圍流行。此外，要進一步加強BRSV的致病機制研究，為研發有效疫苗以防范BRSD發生大規模流行提供理論支撐。