非洲豬瘟病毒CD2v蛋白單克隆抗體的制備與鑒定

陳艷，祝賀，童明龍，陸冠亞，茹小桐，姜焱，周斌*，龍云鳳*

(1. 南京農業大學動物醫學院，江蘇 南京 210095；2. 南京海關動植物與食品檢測中心，江蘇 南京 210019；3. 蘇州海關綜合技術中心，江蘇 蘇州 215104)

非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染所引發的非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是豬的一種具有高度傳播性的急性、熱性、出血性傳染病，強毒株致死率可達到100%，臨床癥狀主要表現為高燒、嚴重抑郁、厭食、皮膚發紺和全身組織器官的出血性病變[1]。世界動物衛生組織(WOAH)將ASF列為法定報告動物疫病，我國也將之歸入必須重點防范的一類動物疫病名錄。2018年8月，ASFV首次傳播到我國，揭開了ASF在亞洲的首次暴發和持續流行的序幕[2-3]。據WOAH統計，自2021年1月至2023年3月，全球仍有41個國家報告發生ASF。ASFV雖然不會危害人類健康，但病毒的高致病性、對環境的強抵抗力和跨境傳播能力給全球的養豬業帶來了破壞性影響和巨大的經濟損失[4]。近期，ASFV疫苗的研發和臨床應用推廣取得了一定進展[5]，但ASF的防治和凈化策略仍側重于生物安全措施，提升豬群自身免疫力，全面監測與精準清除[6-7]。

ASFV是一種雙鏈的核質大DNA病毒，基因組長度約為170～190 kb，編碼68種結構蛋白和超過100種非結構蛋白[8]。其中由EP402R基因編碼的CD2v蛋白在病毒復制晚期表達，呈高度糖基化，參與ASFV感染的多個階段[9-11]。作為ASFV囊膜的主要組分和標識物，CD2v蛋白具有良好的免疫原性，可刺激產生ASFV特異性抗體并誘導細胞免疫應答，是候選亞單位疫苗抗原之一[12]。CD2v也是ASFV的關鍵毒力因子，能引起患豬的血細胞吸附，常作為減毒活疫苗的基因敲除靶標[13-14]。本研究將國內流行毒株ASFV Pig/HLJ/2018的CD2v膜內區基因序列插入到pET-28a(+)載體，通過原核表達系統獲得重組CD2v蛋白，并利用雜交瘤技術制備出8株針對CD2v蛋白的單克隆抗體，為ASFV診斷方法開發及病原學基礎研究提供了生物學工具。

1 材料與方法

1.1 主要材料

原核表達載體pET-28a(+)、重組質粒pET-32a-CD2v、小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)由本實驗室保存。ASFV陽性血清標準品購自中國獸醫微生物菌種保藏中心。P3代CD2v重組桿狀病毒、草地貪夜蛾蛹卵巢細胞(Sf9)由南京海關動植物與食品檢測中心保存。BALB/c小鼠購自江蘇華創信諾醫藥科技有限公司。

高保真PCR聚合酶Prime STAR、限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ、DNA Ladder、T4 DNA連接酶和DNA膠回收試劑盒購自TaKaRa公司。質粒提取試劑盒購自Omega公司。感受態細胞DH5α和BL21(DE3)購自北京擎科生物科技股份有限公司。HisTrap HP預裝式層析柱購自General Electric公司。250 kDa預染protein Marker、12.5% PAGE凝膠快速制備試劑盒、考馬斯亮藍染色液、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購自上海雅酶生物醫藥科技有限公司。GreenTaqMix、BCA蛋白濃度測定試劑盒、高敏型ECL化學發光檢測試劑盒購自南京諾唯贊醫療科技有限公司。聚偏二氟乙烯膜(PVDF)購自Merck公司。HRP標記山羊抗鼠IgG抗體、FITC標記山羊抗鼠IgG抗體、鼠源His單克隆抗體、小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒購自Proteintech公司。TMB底物和終止液購自碧云天生物技術有限公司。RPMI-1640培養基、胎牛血清購自Gibco公司。弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT和HT培養基購自Sigma公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 重組質粒的構建與鑒定

根據TMHMM-2.0蛋白質跨膜區預測工具的分析結果，針對ASFV Pig/HLJ/2018(GenBank：MK333180)分離株CD2v蛋白膜內區(688～1 083 bp，230～360 aa)設計常規PCR引物，F：5′-TGACGGATCCTCTTTACGAAAAAGAAAAAAAC-3′(下劃線處為BamHⅠ酶切位點)，R：5′-TGACCTCGAGAATAATTCTATCTACGTGAAT-3′(下劃線處為XhoⅠ酶切位點)，擴增產物長度為396 bp。以攜帶CD2v全長基因序列的重組質粒pET-32a-CD2v為PCR模板。反應體系為：Prime STAR 25 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 20 μL。PCR反應條件為：98 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 30 s，共35個循環；72 ℃延伸5 min。通過膠回收方法純化PCR產物。

將經過限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ處理后的目的片段和pET-28a(+)載體用T4連接酶連接8 h。之后轉化連接產物到感受態細胞DH5α中，從菌液PCR鑒定為陽性的單克隆過夜培養物中提取質粒，對重組質粒進行限制性雙酶切，陽性質粒由北京擎科生物科技股份有限公司測序。測序正確的重組質粒被命名為pET-28a-CD2v-intra并保存于-20 ℃。

1.3 重組CD2v蛋白的原核表達、純化及反應原性鑒定

將重組質粒pET-28a-CD2v-intra轉化到感受態細胞BL21(DE3)中，得到CD2v重組蛋白原核表達菌株CD2v-intra-pET-28a-BL21。將CD2v-intra-pET-28a-BL21的過夜培養物按1∶100體積比接種到含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中，在37 ℃、200 r/min條件下培養至對數生長期，即菌液OD600范圍應為0.6～0.8，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，繼續培養5～7 h后離心收集菌體。用PBS重懸菌體后在冰浴條件下進行超聲破碎，之后在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min。轉移上清液到新的離心管，并用PBS重懸沉淀，分別制備SDS-PAGE樣品，用以鑒定重組蛋白的表達形式。

使用His-tag鎳離子親和層析法純化重組蛋白。在預試驗中用梯度咪唑濃度的洗脫緩沖液洗脫，經SDS-PAGE測定重組蛋白的最佳洗脫濃度。后續洗脫時先用低咪唑濃度的除去雜蛋白，再用最佳濃度的緩沖液洗脫下重組蛋白。用SDS-PAGE鑒定重組蛋白的純度。用透析法對純化后的重組蛋白做脫鹽和濃縮處理。用BCA法測定重組蛋白的濃度。通過Western blot鑒定重組蛋白與His單克隆抗體、ASFV陽性血清標準品的反應性。

1.4 CD2v蛋白單克隆抗體制備

1.4.1 動物免疫

將10只6周齡BALB/c雌性小鼠平均分為免疫組和陰性對照組并編號。首次免疫時，以背部皮下多點注射方式給免疫組每只小鼠接種50 μg重組蛋白與等體積弗氏完全佐劑的乳化物。首次免疫后的第3周進行第2次免疫，第4周進行第3次免疫。第2、3次免疫時將弗氏完全佐劑換成弗氏不完全佐劑。整個免疫程序中，陰性對照組用等體積滅菌PBS處理。第3次免疫后7 d，采集小鼠眼眶血，通過間接ELISA測定小鼠血清效價。細胞融合前3 d，在效價達到1∶10 000的小鼠中選擇數值最高的1只，腹腔注射100 μg重組蛋白。

1.4.2 單克隆抗體的制備

細胞融合前1 d，分離小鼠腹腔巨噬細胞作為飼養細胞，密度調整到1×105/mL，按100 μL每孔加入到96孔板中培養。處死經過4次免疫的小鼠，分離脾細胞，在PEG4000作用下與對數生長期的SP2/0細胞按照5∶1的比例進行細胞融合。將融合細胞用含1×HAT和20% FBS的選擇培養基重懸，加入到含有飼養細胞的96孔細胞板中培養。細胞融合3 d后，每日觀察細胞狀態并統計融合率。細胞融合第5天后，每隔3 d用HAT選擇培養基半換液。細胞融合第14天后，用HT補充培養基半換液，取出的一半細胞培養上清液用間接ELISA方法測抗體水平，對陽性雜交瘤細胞至少進行2～3次亞克隆至抗體陽性率達100%，確立雜交瘤細胞系并建庫凍存，之后培養不再添加HT補充培養基。將陽性雜交瘤細胞連續傳代培養和凍存，逐代減少FBS含量至10%、5%甚至無血清，以利于抗體產生和后續抗體純化。測定不同代次的細胞培養物上清液中抗體效價，擴大培養能穩定分泌抗體的雜交瘤細胞株，于液氮中長期凍存。

1.4.3 間接ELISA方法

用碳酸鹽緩沖液(0.05 mol/L，pH=9.6)作為包被液將重組蛋白CD2v稀釋到5 μg/mL，按100 μL/孔加入到酶標板，37 ℃孵育1 h。之后用PBST洗滌4次，最后1次洗滌完將酶標板在吸水紙上拍干。用5%脫脂乳作為封閉液，按100 μL/孔加入到酶標板，37 ℃孵育1 h。按前述方法洗滌。將樣品和對照，按100 μL/孔加入到酶標板，37 ℃孵育1 h。按前述方法洗滌。將HRP標記山羊抗鼠IgG抗體以1∶5 000比例稀釋后，按100 μL/孔加入到酶標板，37 ℃孵育1 h。按前述方法洗滌。按100 μL/孔加入TMB顯色液，37 ℃避光顯色15 min。按100 μL/孔加入終止液。使用酶標儀讀取OD450 nm值，待檢樣品OD450 nm/陰性樣品OD450 nm值(S/N)≥2.1時判定為陽性。選擇PBS處理組的小鼠血清作為陰性對照，免疫組小鼠血清作為陽性對照。

1.4.4 腹水制備

準備16只12周齡BALB/c雌性小鼠，按2只/株單克隆抗體分組。給每只小鼠腹腔注射0.5 mL經高壓滅菌的液體石蠟。7 d后給每只小鼠腹腔接種5×105個雜交瘤細胞。5～7 d后，每日觀察小鼠狀態，對腹部明顯膨大，觸摸有波動感的小鼠用0.55 mm靜脈采血針收集腹水。采集到的腹水在4 ℃靜置過夜，次日12 000 r/min離心5 min，收集中間層，-80 ℃保存備用。

1.5 CD2v蛋白單克隆抗體的生物學特性鑒定

1.5.1 Western blot鑒定單克隆抗體的反應性

貼壁培養Sf9細胞至對數生長期，按MOI=1的劑量接種P3代CD2v重組桿狀病毒，同時設置未感染的Sf9細胞作為空白對照，于28 ℃培養36 h。反復凍融3次使細胞破碎，取100 μL加入25 μL 5×蛋白上樣緩沖液，混勻后煮沸10 min，進行SDS-PAGE并轉印到PVDF膜上。用5%脫脂乳封閉膜，以雜交瘤細胞上清液作為一抗、HRP標記山羊抗鼠IgG抗體為二抗，浸入ECL發光液數秒后在成像系統中觀察特異性條帶。

1.5.2 免疫熒光試驗(IFA)鑒定單克隆抗體的反應性

按1×106個細胞/孔的密度接種Sf9細胞至48孔板，培養至對數生長期。將P3代CD2v重組桿狀病毒按MOI=1的劑量感染細胞，同時設置未感染的Sf9細胞作為空白對照，于28 ℃培養36 h。用4%多聚甲醛固定細胞，加入2% BSA在37 ℃封閉2 h，以雜交瘤上清液作為一抗、FITC標記山羊抗鼠IgG抗體為二抗，在37 ℃各孵育1 h，每個步驟之后用PBS洗滌3次。在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5.3 單克隆抗體的亞型鑒定

取建庫的雜交瘤細胞上清液，使用小鼠抗體亞型鑒定試劑盒對單克隆抗體的亞型進行鑒定，具體操作按照說明書執行。

2 結果

2.1 重組質粒的構建與鑒定

ASFV Pig/HLJ/2018(GenBank：MK333180)CD2v蛋白膜內區基因(688～1 083 bp，230～360 aa)的PCR擴增產物長度與預期的396 bp相符(圖1A)。CD2v-intra-pET-28a-DH5α重組菌的菌液PCR鑒定均為陽性(圖1B)。重組質粒pET-28a-CD2v-intra經過雙酶切鑒定后獲得的片段與目的基因大小一致(圖1C)。基因測序結果顯示，重組質粒的插入序列與目的基因完全一致。

2.2 重組CD2v蛋白表達、純化及鑒定

SDS-PAGE結果顯示，重組菌株CD2v-intra-pET-28a-BL21經IPTG誘導后大量表達分子量約為23 kDa的融合蛋白，與預期大小相符，重組蛋白部分為可溶性表達，部分為包涵體形式(圖2A)。通過His-tag鎳離子親和層析法純化的CD2v重組蛋白在電泳后染色呈單一條帶，純化效果良好(圖2B)。Western blot顯示His單克隆抗體和ASFV陽性血清標準品均能特異性識別CD2v重組蛋白，充分表明CD2v重組蛋白成功表達并且具有良好的反應原性(圖3)。

M. 蛋白Marker；1. pET-28a-BL21全菌；2. 未誘導的CD2v-intra-pET-28a-BL21；3～5. 分別為誘導CD2v-intra-pET-28a-BL21裂解后全菌、上清液、沉淀；6. 流穿液；7～10. 分別為含50、100、200、300 mmol/L咪唑的洗脫液。

M.蛋白Marker；1. pET-28a-BL21裂解物；2. CD2v-intra-pET-28a-BL21裂解物。

2.3 單克隆抗體的制備

在小鼠第3次免疫后采集眼眶血，按本研究建立的ELISA方法測定小鼠血清抗體效價，結果顯示，免疫組小鼠的抗CD2v蛋白抗體效價均達到1∶10 000，可用于細胞融合。

按本研究建立的ELISA方法篩選陽性雜交瘤細胞，并通過有限稀釋法進行2～3次亞克隆，最終獲得8株分泌抗CD2v蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞，分別命名為RH1、RH3、RH4、RH5、RH6、RH8、RH9、RH10。如表1所示，在經過連續傳代培養和數次凍存后，雜交瘤細胞培養基上清液中的抗體效價仍維持在1∶12 800的較高水平，表明其分泌抗體的能力穩定。本研究制備的腹水中CD2v抗體效價均達到1∶640 000，可為后續單克隆抗體的應用提供充足材料。

表1 單克隆抗體效價測定

2.4 單克隆抗體的反應性鑒定

Western blot結果如圖4所示，8株CD2v單克隆抗體均能識別昆蟲桿狀病毒系統表達的重組CD2v全長蛋白，曝光后出現的2條特異性條帶，1條為44 kDa左右的非糖基化CD2v蛋白，另1條為85 kDa左右的糖基化CD2v蛋白。IFA試驗中(圖5)，His標簽抗體組產生的特異性綠色熒光表明感染重組桿狀病毒的Sf9細胞成功表達了CD2v全長蛋白，8株CD2v單克隆抗體中有6株抗體能識別真核重組CD2v蛋白，分別是RH1、RH4、RH5、RH6、RH9和RH10。單克隆抗體不與陰性對照發生反應。

M. 蛋白Marker；1. Sf9細胞；2. 表達重組CD2v全長蛋白的Sf9細胞。

圖5 IFA鑒定CD2v蛋白單克隆抗體與真核重組CD2v蛋白的反應性

2.5 單克隆抗體的亞型鑒定

由表2可見，8株單克隆抗體的輕鏈類型均為Kappa型；RH1、RH5、RH9這3株單克隆抗體的重鏈亞型為IgG2b，其余5株單克隆抗體的重鏈亞型為IgG1。

表2 CD2v單克隆抗體亞型鑒定

3 討論

自首次發現ASFV至今已有一個世紀，盡管先前的研究工作較為全面地揭示了ASFV的病原學特征、傳播機制和致病機制，但仍存在很多未知和待解決的問題[15]。未來的研究應繼續深入探索ASFV與宿主之間的相互作用以及病毒的免疫逃避機制，為ASF的防治提供更好的科學支持。ASFV單克隆抗體的制備可以為上述研究提供有力的生物學工具。單克隆抗體是由單一B細胞克隆所產生，能特異性識別單一抗原表位，被廣泛地應用于病原的基礎研究和臨床治療與診斷，如鑒定蛋白的表達與定位、靶向傳遞藥物、阻斷病原感染、富集和純化生物制品、檢測靶抗原等[16]。Hagoss等[17]利用其制備的7株單克隆抗體鑒定出一個新的ASFV CP312R蛋白保守性抗原表位，并通過激光共聚焦試驗證實CP312R蛋白主要定位于細胞質中。Zhang等[18]則利用ASFV p30單克隆抗體開發了一種夾心膠體金試紙條，適用于多種臨床樣本現場檢測，試紙條與熒光定量PCR(qPCR)的一致性為95.42%，檢出限達2.16 ng p30蛋白。

囊膜蛋白CD2v在ASFV感染過程中發揮著重要作用。CD2v蛋白介導了ASFV感染細胞周圍紅細胞的黏附與聚集，促進病毒在體液中的擴散[9]。通過其胞內C端結構域與肌動蛋白結合配體SH3P7結合，CD2v蛋白可促進ASFV在宿主細胞內的復制和傳播[19]。CD2v蛋白胞內C端結構域還靶向反式高爾基體網絡(TGN)調節蛋白復合物AP-1，從而影響胞內物質轉運，在病毒感染細胞的免疫逃逸方面發揮潛在作用[20]。通過激活NF-κB，CD2v蛋白可誘導豬淋巴細胞和巨噬細胞中的IFN信號傳導與凋亡[21]。作為良好的免疫原，CD2v蛋白能刺激機體產生特異性抗體，是ASFV血清學診斷的主要標識物。針對CD2v蛋白的單克隆抗體不僅有助于深入研究靶抗原的生物學功能，還對多種ASFV抗原抗體檢測方法的開發有著重要意義。CD2v蛋白屬于單次跨膜蛋白，含有一段強疏水性的氨基酸序列。這種跨膜結構與信號肽結構相似，原核細胞中簡單的細胞器難以像真核細胞一樣完成這類結構的識別及切除，引導內質網、高爾基體重新包裝及分泌這一復雜過程。因此，本研究選擇對國內流行毒株ASFV Pig/HLJ/2018的CD2v蛋白C末端膜內區(688～1 083 bp，230～360 aa)進行原核表達。重組CD2v蛋白的相對分子量在23 kDa左右，與預期相符，誘導產物有約50%以可溶性形式表達。重組蛋白具有良好的抗原性，可被ASFV陽性血清識別，也可刺激小鼠產生高水平的血清抗體。經過細胞融合、雜交瘤細胞篩選和2～3次亞克隆，本研究共制備出8株能穩定分泌CD2v蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞，并收獲了高抗體效價的腹水。Western blot試驗證實了8株CD2v蛋白單克隆抗體良好的反應性，可識別糖基化(約85 kDa)和非糖基化(約44 kDa)的真核重組CD2v全長蛋白。其中6株抗體可通過IFA試驗識別感染CD2v重組桿狀病毒的Sf9細胞。8株單克隆抗體的輕鏈類型均為Kappa型，RH1、RH5和RH9這3株單克隆抗體的重鏈亞型為IgG2b，其余5株單克隆抗體的重鏈亞型為IgG1，均適合用protein A/G、分子篩層析和離子交換層析等常規抗體純化方法[16]。

本研究制備的8株ASFV CD2v蛋白膜內區單克隆抗體將有助于加速解析病毒蛋白的結構與功能，探究病毒與宿主的相互作用和病毒的免疫逃避機制，從而更高效地篩選出抗病毒藥物，更有針對性地開發疫苗。同時也為本研究后續完成靶抗原B細胞表位作圖、中和抗體篩選以及建立高特異、高靈敏性的血清學診斷方法奠定了基礎。