重組CRM197-4GnRH去勢疫苗抗原分子的原核表達及免疫效果評價

高華義，劉堃，張璐，王永芳，任東興，郭鈺潔，武毅，申雁冰，付旭彬*，王敏*

(1. 天津科技大學 生物工程學院，天津 300457；2. 天津瑞普生物技術股份有限公司，天津 300308；3. 天津海關動植物與食品檢測中心，天津 300461；4. 南京農業大學動物醫學院，江蘇 南京 210095)

公豬生長過程中，體內會積聚大量雄性激素，使豬肉產生膻味，不僅影響口感、風味，還影響生豬飼喂效率，因此公豬往往需要閹割去勢。該過程耗費大量人力、物力，還容易導致閹割應激及外傷感染。自歐盟發布自愿中止公豬手術閹割宣言，免疫去勢替代家畜、寵物的手術閹割已成必然。

促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)也被稱為黃體生成素釋放激素，由下丘腦神經細胞分泌[1]。該激素形式多種多樣，目前至少已經發現24種，主要源自哺乳動物、魚、鳥等動物的神經組織，GnRH可以通過刺激垂體合成和分泌促性腺激素，對動物的生長和生殖有重要的作用[2-3]。通過對GnRH進行改造修飾，不僅可以解決免疫系統不能識別自身激素的問題，還可以提高GnRH的免疫原性，從而可以起到免疫去勢作用。在此過程中，還要特別注意其應用場景的需求，公豬免疫去勢需要維持一定的免疫有效期，以便可以通過調控體系發揮其免疫去勢作用[4-5]。

Ladd等[6]為了提升GnRH免疫去勢疫苗的免疫原性，分別將GnRH的第1、6、10位氨基酸與破傷風類毒素進行偶聯結合，通過免疫犬、兔子和大鼠，測定其血清中的抗體效價，與第6、10位氨基酸鏈接點疫苗相比，GnRH通過第1位氨基酸與破傷風類毒素進行的偶聯免疫效果最佳。Oonk等[7]通過用D型氨基酸Lys取代GnRH第6位氨基酸，并將經過修飾后的GnRH進行連接形成二聚體，與載體蛋白OVA相連，免疫公豬后，其免疫有效率達到100%；同時，通過用Ala依次替換GnRH的每個氨基酸，并與載體蛋白偶聯后免疫公豬，發現不同位置的氨基酸被取代后，其免疫原性受到的影響不同。作為全球唯一一個用于公豬免疫去勢的商業化產品，美國碩騰生產的異普克去勢疫苗是在GnRH的基礎上去掉了第1位的氨基酸，具有一定的免疫活性[8]。除了上述提到的通過進行氨基酸的替代以提升免疫去勢疫苗的效果，還可以通過增加抗原分子量，使其抗原表位增多，以多聚體的形式提升其刺激機體產生免疫反應的能力[9]。Oonk等[7]通過用BSA載體與單個GnRH連接，之后通過測定動物血清中睪酮濃度以驗證免疫有效率；并且通過同樣的方式將BSA與串聯的GnRH進行偶聯結合，進行睪酮濃度的測定；最后結果表明，串聯的GnRH與載體蛋白偶聯之后形成的新分子免疫有效率可以達到100%，顯著高于單個GnRH發揮的效用。Xu等[10]通過使用-hinge-MVP作為載體蛋白與單個GnRH和3個串聯的GnRH進行連接，通過測試其對大鼠免疫應答反應，發現3個串聯的GnRH與載體蛋白偶聯后所發揮的免疫應答反應顯著強于單個GnRH。

基于化學合成疫苗存在合成工藝復雜、生產成本高、批次間質控難度高等難題，國內外學者嘗試使用基因工程方法制備GnRH免疫去勢疫苗，其自身作為10個氨基酸的半抗原，半衰期較短，且無免疫原性，往往需要使用載體蛋白偶聯修飾。而載體蛋白與單個GnRH分子的結合，其結構不穩定，免疫動物后，動物機體往往難以有效識別并將之通過抗原遞呈細胞開展免疫應答，而GnRH多聚體偶聯載體蛋白后可以很好的產生免疫去勢作用。目前通過基因工程獲取的免疫去勢疫苗抗原因其表達量、免疫效果、純化工藝和生產成本等因素，難以大規模的商業化應用。因此，開發一種適合公豬免疫去勢、生產工藝簡單的免疫去勢基因工程疫苗，對我國生豬養殖行業意義重大。本研究采用白喉毒素無毒突變體(CRM197)與4拷貝GnRH串聯，制備重組CRM197-GnRH，并分析了其免疫去勢效果。

1 材料與方法

1.1 試劑

TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性核酸內切酶、dNTPs、DNA Marker、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、DNA純化試劑盒，購自于TaKaRa公司；SDS-PAGE Marker，購于北京全式金生物技術股份有限公司；His Band Purification Kit，購于Novagen公司；BCG購于上海瑞楚生物科技有限公司；多肽抗原G1(GnRH+Th抗原表位)、GnRH陽性血清來源于天津瑞普生物技術股份有限公司；Montanide ISA 61 VG(油包水佐劑)、Montanide ISA 206 VG(水包油包水佐劑)、Montanide ISA 02 VG(水溶性佐劑)、Montanide IMS 1313 VG(納米水溶性佐劑)，購自于法國SEPPIC 公司；A8佐劑由南京農業大學提供；Sim-01佐劑和Bis-01佐劑由清華大學提供；酵母提取物、蛋白胨，購于OXOID 公司(英國)；飽和平衡酚(pH=8.0)購于生工生物工程(上海)股份有限公司；DAB顯色試劑盒購于南京生興生物技術有限公司；睪酮放免試劑盒購于北京北方生物技術研究所有限公司。

1.2 菌株、質粒和試驗動物

菌株：大腸桿菌BL21-DE3、大腸桿菌DH5α來源于天津瑞普生物技術股份有限公司。

質粒：pET22b(+)(氨芐青霉素抗性，Ampr)，pMD18-T(卡那霉素抗性，Kanr)來源于天津瑞普生物技術股份有限公司。

動物：未去勢的12周齡健康雄性大鼠100只，體重在240～260 g之間，由天津瑞普生物技術股份有限公司提供，經檢查不存在隱睪和睪丸發育問題。將大鼠隨機分成10組，每組10只，試驗在天津瑞普生物技術股份有限公司空港經濟區分公司動物房開展，常規適應性飼養1周，自由飲水和采食，飼料為不含任何抗生素和抗菌藥的全價鼠糧，至第13周齡開始做試驗。

1.3 重組CRM197-4GnRH的表達載體構建

1.3.1 構建表達系統

CRM197-4GnRH基因由深圳華大基因股份有限公司合成，在合成過程中與pMD18-T載體進行了連接，從而得到重組質粒pMD18-T-CRM197-4GnRH。用EcoRⅠ和XhoⅠ對pMD18-T-CRM197-4GnRH質粒和pET22b(+)載體進行雙酶切。采用大腸桿菌BL21按照感受態細胞的制備方法予以制備，24 h內使用。按照《分子克隆實驗指南》進行質粒的提取：在LB平板中挑取5個單菌落，在LB液體培養基(Amp)中37 ℃培養。取菌液離心，分別加入溶液Ⅰ和溶液Ⅱ，用等體積堿性飽和平衡酚/氯仿混合，將上清液與等體積氯仿混勻，將沉淀用2倍體積無水乙醇輕輕混勻沉淀烘干，用20 μL含有RNA酶的TE (TER)溶解質粒，37 ℃溫育0.5 h，僅余DNA片段。對質粒進行EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，送深圳華大基因股份有限公司測序。將所測序的質粒以BL(pET22b-CRM197-4GnRH)命名。

將重組菌BL(pET22b-CRM197-4GnRH)置于4 mL含Amp的LB液體培養基內，37 ℃過夜培養。用超聲破碎儀將所重懸的菌液處理，取上述所得的上清液80 μL，進行SDS-PAGE分析其是否有所需目的蛋白。

1.3.2 優化表達系統條件

挑取重組菌BL單菌落于含有Amp的LB液體培養基中，37 ℃培養8 h。將所取得的菌液按1%接種量接種到含Amp的LB液體培養基中，37 ℃，200 r/min培養2～3 h，當OD600值處于0.4～0.6時，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，37 ℃誘導培養，在第0、1、2、3、4、5、6、8、10 h分別吸取1 mL菌液，通過SDS-PAGE觀察蛋白表達量，確定最佳誘導時間。

將所取得的菌液按1%接種量分別接種到含Amp的LB、TB、SOB、TSB液體培養基內，37 ℃，200 r/min培養2～3 h，當OD600值處于0.4～0.6之間時，以終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導5 h，吸取1 mL培養的菌液。通過SDS-PAGE觀察蛋白表達量，從而確定表達所用的最佳培養基。

將重組菌BL按上述方法培養后，將其分裝到5個試管內，分別用終濃度0、0.1、0.25、0.5、0.75 mmol/L IPTG進行誘導表達，37 ℃作用5 h，吸取1 mL培養的菌液。通過SDS-PAGE觀察蛋白表達量，從而確定最佳IPTG誘導濃度。

1.4 疫苗的配比與免疫

CRM197-4GnRH+Bis-01組疫苗的制備：稱取10.0 mg CRM197-4GnRH，溶于90 mL的PBS中，除菌過濾，取50 mL抗原溶液加入至50 mL高壓滅菌的Bis-01佐劑中，充分乳化，疫苗檢驗合格后分裝于西林瓶中，濃度為50 μg/mL。

CRM197-4GnRH+02 VG組疫苗的制備：稱取10.0 mg CRM197-4GnRH，溶于90 mL的PBS中，除菌過濾，取50 mL抗原溶液加入至50 mL 高壓滅菌的Montanide ISA 02 VG佐劑中，充分乳化，疫苗檢驗合格后分裝于西林瓶中，濃度為50 μg/mL。

CRM197-4GnRH+Sim-01組疫苗的制備：稱取10.0 mg CRM197-4GnRH，溶于90 mL的PBS中，除菌過濾，取50 mL抗原溶液加入至50 mL 高壓滅菌的Sim-01佐劑中，充分乳化，疫苗檢驗合格后分裝于西林瓶中，濃度為50 μg/mL。

CRM197-4GnRH+206 VG組疫苗的制備：稱取10.0 mg CRM197-4GnRH，溶于90 mL的PBS中，除菌過濾，取50 mL抗原溶液加入至50 mL 高壓滅菌的Montanide ISA 206 VG佐劑中，充分乳化，疫苗檢驗合格后分裝于西林瓶中，濃度為50 μg/mL。

CRM197-4GnRH+A8+02 VG組疫苗的制備：稱取10.0 mg CRM197-4GnRH，溶于90 mL的PBS中，除菌過濾，將A8和Montanide ISA 02 VG按1∶1比例配制組合佐劑，取50 mL抗原溶液加入至50 mL 高壓滅菌的組合佐劑中，充分乳化，疫苗檢驗合格后分裝于西林瓶中，濃度為50 μg/mL。

CRM197-4GnRH+BCG+02 VG組疫苗的制備：稱取10.0 mg CRM197-4GnRH，溶于90 mL的PBS中，除菌過濾，將BCG和Montanide ISA 02 VG按1∶1比例配制組合佐劑，取50 mL抗原溶液加入至50 mL 高壓滅菌的組合佐劑中，充分乳化，疫苗檢驗合格后分裝于西林瓶中，濃度為50 μg/mL。

CRM197-4GnRH+BCG+1313 VG組疫苗的制備：稱取10.0 mg CRM197-4GnRH，溶于90 mL的PBS中，除菌過濾，將BCG和Montanide IMS 1313 VG按1∶1比例配制組合佐劑，取50 mL抗原溶液加入至50 mL 高壓滅菌的組合佐劑中，充分乳化，疫苗檢驗合格后分裝于西林瓶中，濃度為50 μg/mL。

CRM197-4GnRH+61 VG組疫苗的制備：稱取10.0 mg CRM197-4GnRH，溶于90 mL的PBS中，除菌過濾，取50 mL抗原溶液加入至50 mL 高壓滅菌的Montanide ISA 61 VG佐劑中，充分乳化，疫苗檢驗合格后分裝于西林瓶中，濃度為50 μg/mL。

G1+61 VG組疫苗的制備：稱取10.0 mg多肽抗原G1，溶于90 mL的PBS中，除菌過濾，取50 mL抗原溶液加入至50 mL 高壓滅菌的Montanide ISA 61 VG佐劑中，充分乳化，疫苗檢驗合格后分裝于西林瓶中，濃度為50 μg/mL。

1.5 抗體有效性的效果分析

將動物分為空白對照(A組)、CRM197-4GnRH+Bis-01(B組)、CRM197-4GnRH+02 VG(C組)、CRM197-4GnRH+Sim-01(D組)、CRM197-4GnRH+206 VG(E組)、CRM197-4GnRH+A8+02 VG(F組)、CRM197-4GnRH+BCG+02 VG(G組)、CRM197-4GnRH+BCG+1313 VG(H組)、CRM197-4GnRH+61 VG(I組)和G1+61 VG(J組)共10組。在大鼠第13周齡之時進行首免，間隔兩周后加強注射1次，每次免疫劑量為50 μg/只，注射體積為1 mL/只；其中空白對照用等體積的PBS進行注射。于第13周齡首免前，眼眶取血法采血0.75 mL，從首免開始每隔兩周采血1次直至第31周齡試驗結束。將采集的血樣首先置于室溫條件下0.5 h，之后放置于4 ℃保存過夜，3 500 r/min離心10 min后，將所得血清置于-20 ℃保存。所有組的免疫注射方式均為背部皮下注射，每組10只。

1.6 統計學分析

把數據輸入IBM SPSS Statistics 21統計學軟件進行處理，通過方差檢驗、多重比較分析其顯著性與否。

2 結果

2.1 重組CRM197-4GnRH蛋白的純化

為了構建CRM197-4GnRH重組表達載體，通過將CRM197-4GnRH基因連接到了pMD18-T載體，得到了質粒pMD18-T-CRM197-4GnRH；用EcoRⅠ、XhoⅠ將pMD18-T-CRM197-4GnRH和pET22b(+)載體進行了雙酶切，然后通過使用Agarose Gel DNA Purification Kit將目的片段CRM197-4GnRH與酶切后pET22b(+)載體的回收；以片段∶載體=5∶1(摩爾比)將目的片段CRM197-4GnRH與pET22b(+)載體的連接；然后將連接載體通過轉化進入了感受態細胞DH5α中，并通過堿裂解法提取了質粒pET22b-CRM197-4GnRH。經過EcoRⅠ和XhoⅠ的雙酶切鑒定，結果表明雙酶切有一個1 827 bp左右的片段(圖1)，與目的片段預期大小一致，經過測序表明確為所需目的片段。

通過挑取重組菌BL及宿主菌BL pET-22b(+)單菌落，加入IPTG誘導其蛋白表達。經表達條件的優化，確定最優的表達條件為：誘導表達時間5 h，培養基為LB液體培養基，IPTG誘導濃度為0.5 mmol/L。經過最優表達條件的誘導，將沉淀物用原培養基1/10體積的無菌PBS重懸，將其進行了超聲破碎，經SDS-PAGE分析，發現重組菌表達產物在65 kDa左右有1條明顯的條帶，與預期結果相符合(圖2)。

1. 重組菌菌體蛋白；M. 蛋白Marker；2. 原始菌菌體蛋白對照。

將誘導表達重組菌進行超聲裂解，用0.5% TritonX-100洗滌后，用8 mol/L的尿素進行溶解，將溶解后的融合蛋白CRM197-4GnRH過His鎳柱，將之前和之后的洗脫液分別用離心管收集，中間5 mL洗脫液所進行的洗脫作為所需目的蛋白。將經洗脫后的樣品經SDS-PAGE分析，發現在65 kDa處有明顯條帶(圖3)，與預期一致，說明成功表達了融合蛋白。

1. 純化后的蛋白；M. 蛋白Marker。

M. 蛋白Marker；1. 純化后的表達蛋白。

Westem blot分析發現，所表達的蛋白可以與大鼠GnRH特異性抗血清發生反應，經顯色后發現僅有1條清晰條帶(圖4)，表明所獲得的融合蛋白免疫學活性較好。

2.2 CRM197-4GnRH的免疫原性

通過間接ELISA 法測定大鼠免疫后不同時期血清中GnRH抗體水平，發現所有的試驗組都有較高的、不同水平的抗體滴度值，免疫組抗體滴度與空白對照組相比較，免疫組大鼠血清抗體滴度均顯著升高(P<0.05)，說明各疫苗組均產生了免疫應答，與預期一致(圖5)。同時，發現不同佐劑免疫組在二免后4周左右達到穩定峰值，大概持續10周維持較高水平，然后呈現緩慢下降趨勢。其中水包油包水佐劑組(E組)、油包水佐劑組(I組)、抗原G1油包水佐劑組(J組)免疫去勢大鼠GnRH抗體滴度顯著高于其他組，但3者內部之間差異不大(P>0.05)；此3組自17周齡至27周齡，抗體維持在較高的水平，說明水包油包水佐劑和油包水佐劑可以作為免疫去勢疫苗佐劑。

圖5 大鼠血清GnRH抗體滴度測定

2.3 免疫大鼠睪酮濃度的測定

通過采用放射免疫法測定大鼠血清中睪酮濃度，以免疫后血清中睪酮濃度<0.1 ng/mL作為疫苗有效與否的判定指標(表1和圖6)。結果發現，在第19～31周齡時，免疫組血清睪酮濃度顯著低于空白對照組(P<0.05)，這說明各免疫組均對免疫去勢疫苗產生了免疫應答；其中，水包油包水佐劑組(E組)、油包水佐劑組(I組)、抗原G1油包水佐劑組(J組)在第17～27周齡時血清睪酮濃度低于0.1 ng/mL，其有效率均可達到100%，維持時間持續10周時間，顯著低于其他組(P<0.05)，但3組之間相比差異不顯著(P>0.05)(圖6)。

表1 免疫后不同時期有效率統計 %

圖6 免疫后不同時期對照組和免疫組血清中睪酮濃度

3 討論

本文通過大腸桿菌表達系統對CRM197-4GnRH抗原進行了表達，采用不同種類佐劑制備疫苗進行大鼠的免疫，研究了其對大鼠的免疫去勢作用。自從Stewar發現GnRH之后，朱杰青[11]和Jung等[12]都曾利用大腸桿菌表達系統進行GnRH及其類似物的研究，其中Jung等[12]分別把犬瘟熱病毒的p35蛋白作為載體蛋白與GnRH六聚體基因相連接，同時將輪狀病毒VP6蛋白作為載體蛋白，將其與6個串聯的GnRH基因連接，表達后的產物對犬的免疫去勢作用顯著，與研究預期一致。本研究中，在預試驗階段嘗試了將CRM197蛋白與抗原G1基因進行連接表達，但表達量較低，分析有可能是該質粒的穩定性差或者新型融合蛋白結構受到了空間影響，難以有效表達[13]。這需要在蛋白的空間結構方面進行進一步的研究。

為了降低免疫去勢疫苗批次間質控難度，獲得生產工藝簡單的疫苗產品，對免疫去勢抗原分子進行了精確設計，采用白喉毒素突變體CRM197與4拷貝GnRH串聯，以基因工程方法進行免疫去勢抗原的制備；將CRM197-4GnRH基因與表達載體連接，酶切鑒定得到了1條1 827 bp的片段，與預期一致；優化了大腸桿菌表達條件，優選表達條件為：誘導時間表達5 h、培養基為LB液體培養基、IPTG誘導濃度為0.5 mmol/L；將純化后的融合蛋白進行SDS-PAGE，發現在65 kDa處有明顯條帶，與預期一致；融合蛋白經過Western blot鑒定，在65 kDa處出現1條較為清晰的目的條帶，表明融合蛋白具有良好的免疫學活性。

根據報道，血清中睪酮濃度<0.1 ng/mL可能是判定疫苗有效與否的指標[14]。本試驗中，B組所用佐劑為清華大學所供，為針對新型通路的新型親油性疫苗佐劑，試驗中有效率偏低，不能判定為對雄性大鼠去勢免疫增效作用，在該疫苗中其未能達到免疫增效作用，分析其原因可能是該佐劑特異性針對新型特定通路，其免疫機制、激活方式等存在一定的特異性，比如其僅對特定結構或相應受體與之結合，影響抗原產生免疫應答反應。C組為重組疫苗水溶性佐劑組，未能對雄性大鼠去勢有免疫增效作用，分析可能是水包油佐劑一般在注射后緩慢形成油包水乳液，可以提供良好的水溶性，便于制備和穩定抗原，免疫應答反應相對溫和，其一般針對脂溶性好的抗原或需要更溫和的免疫刺激抗原更加適用，這也是常規動物疫苗往往采取油包水佐劑的原因。D組所用佐劑為清華大學所供，是針對于新型通路的新型疫苗佐劑，為親水性佐劑，其未能對雄性大鼠去勢有免疫增效作用，可能是由于新型特定通路的免疫機制、激活方式在不同動物個體中存在差異，或者是其作為水溶性佐劑，在機體內發揮免疫應答反應更加溫和，需要更高濃度抗原參與。E組為重組疫苗水包油包水佐劑，該種佐劑有利于疫苗在體內的吸收，不易造成潰爛、鼓包等副作用，17～27周齡期間免疫有效率達到100%，免疫有效期10周以上，在試驗過程中發現其更易于乳化，制成的疫苗黏度小，且水包油包水更易于吸收，可以作為備選佐劑配比重組疫苗應用于公豬免疫去勢。為了得到更好、更優良的佐劑，通過設計了水包油佐劑、納米水溶性佐劑，并從清華大學、南京農業大學等取得最新實驗室研究的針對于新型通路佐劑，并分別嘗試與BCG、A8佐劑等共用，旨在尋找免疫效果好、安全性好、副作用少的市場化佐劑，F、G和H組分別為重組疫苗水溶性佐劑與A8佐劑共用組、重組疫苗水溶性佐劑與BCG共用組和重組疫苗納米水溶性佐劑與BCG共用組，設計原則旨在既發揮免疫增效功能，又能發揮其親水特性，降低油性物質對動物產生的鼓包、潰爛等問題，在本研究中，3種配比佐劑結果均不理想，未能對雄性大鼠產生免疫去勢增效功能。分析可能是水包油佐劑、油包水佐劑共用在乳化過程中發生相互作用或不相容現象，導致佐劑的結構或功能發生改變，影響其在疫苗中的性能，使得乳化后的疫苗無法提供充分的免疫刺激或抗原的穩定性受損。I組為重組疫苗油包水組，其在17～27周齡期間時對雄性大鼠免疫有效率達100%，有效期可以持續10周以上，可以滿足公豬免疫去勢有效期時長要求，其原因是油包水佐劑作為常規使用最為廣泛的佐劑，在提供強免疫刺激、促進抗原遞呈和處理、誘導免疫記憶以及穩定疫苗等方面具有優勢。J組作為陽性對照組，為G1多肽抗原(GnRH+Th抗原表位)油包水組，17～27周齡期間免疫有效率達到100%，至29周齡時降至90%，是目前針對公豬免疫去勢研究最多的疫苗制備方法，但其往往容易對動物接種區域造成鼓包、潰爛等副作用，甚至引起動物死亡。總體來說，E組、I組作為重組GnRH疫苗，可以有效對雄性大鼠進行去勢，可以作為潛在的公豬用免疫去勢基因工程疫苗。

綜上，本研究在大鼠體內考察了重組去勢疫苗CRM197-4GnRH的免疫去勢效果，將融合蛋白分別與不同佐劑乳化，制備了CRM197-4GnRH+Bis-01疫苗、CRM197-4GnRH+02 VG疫苗、CRM197-4GnRH+Sim-01疫苗、CRM197-4GnRH+206 VG疫苗、CRM197-4GnRH+A8+02 VG疫苗、CRM197-4GnRH+BCG+02 VG疫苗、CRM197-4GnRH+BCG+1313 VG疫苗、CRM197-4GnRH+61 VG疫苗和G1+61 VG疫苗，測定了免疫后大鼠體內GnRH抗體滴度和睪酮水平，發現水包油包水佐劑組CRM197-4GnRH+206 VG、油包水佐劑組CRM197-4GnRH+61 VG疫苗和油包水佐劑組G1+61 VG疫苗可以顯著提升大鼠體內GnRH抗體滴度，并抑制大鼠體內睪酮水平，顯著優于其他組。通過重組去勢疫苗對大鼠免疫作用的研究，為GnRH免疫去勢基因工程疫苗的進一步開發奠定了基礎。