豬源和犬源ELF4蛋白的亞細胞定位比較研究

高翠翠，喻嬌，唐青海*，侯鑫軍，劉婷，全飛楊，劉建行，趙婷芳，趙鋮，朱鈺英，危艷武*

(1. 衡陽師范學院生命科學學院/南岳山區生物資源保護與利用湖南省重點實驗室，湖南 衡陽 421008；2. 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所/獸醫生物技術國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069)

E26轉錄因子(E26 transformation specific，ETS)家族分子是多細胞生物的一類轉錄因子，參與發育和分化等多個關鍵生物學過程[1]。E74 樣因子4(E74-like factor 4，ELF4)是ETS家族的重要一員，該蛋白由N端激活區域、與DNA共識序列結合的ETS區域和富含絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸的區域組成。人ELF4(hELF4)參與細胞多種生理或病理的過程，如腫瘤發生[2]、DNA損傷修復[3]、天然免疫[4]、細胞周期調控[5]和成骨分化[6]等。研究表明，hELF4高表達可促進人胰島素瘤細胞增殖[7]，然而在急性髓性白血病中，hELF4則是作為一個抑癌基因起作用[8]。hELF4對胃癌細胞的增殖和侵襲有正向調節作用[9]，腫瘤來源的外泌體通過傳遞LINC01091調控microRNA-128-3p/ELF4/CDX2軸促進胃癌的生長和轉移[10]。此外，hELF4在免疫調節中起著重要作用。You等[11]首次發現hELF4是一種Ⅰ型干擾素(IFNs)轉錄因子，并通過直接調節Ⅰ型IFNs反應來抑制病毒的復制。hELF4功能突變缺失導致人類自身炎癥和免疫缺陷疾病[12]。腸道hELF4是維持腸道內穩態、減輕酒精誘導的肝臟脂肪變性和損傷的重要宿主保護因子[13]。hELF4蛋白功能區研究比較透徹，定位在細胞核中，與其作為轉錄因子的功能關聯密切[14]。

A. cELF4基因截短示意圖；B. sELF4基因截短示意圖。圖中數字表示片段長度，單位為bp。

目前尚無豬E74樣因子4(sELF4)和犬E74樣因子4(cELF4)的亞細胞定位比較研究的報道。本課題組成員前期成功克隆了sELF4基因，并制備了免疫活性和特異性良好的雞抗sELF4多克隆抗體[15]，克隆cELF4基因，體外表達重組cELF4蛋白并制備了相應的抗體[16]。為揭示sELF4和cELF4蛋白的亞細胞定位特征，闡明二者亞細胞定位的異同，本研究采用PCR截短擴增基因片段、以綠色熒光蛋白(GFP)為報告基因，構建真核表達載體，轉染細胞，觀察細胞定位，研究結果將為進一步探究sELF4 和cELF4功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

感受態細胞Top 10購自天根生化科技(北京)有限公司；KOD FX Neo高保真酶購自東洋紡(上海)生物科技有限公司；Ligation Mix、內切酶以及XfectTM轉染試劑均購自寶日醫生物技術(北京)有限公司；Hoechst 33342購于Abbkine Scientific公司；DMEM和胎牛血清培養基購自Gibico公司；含sELF4基因全長質粒pMD19T-sELF4、含cELF4基因全長質粒pMD19T-cELF4 以及宮頸癌細胞HeLa由南岳山區生物資源保護與利用湖南省重點實驗室構建或保存。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計

根據本課題組前期已經測定的cELF4基因序列(GenBank No. MZ198105)、sELF4基因序列(GenBank No. KU097322)，用Primer Premier 5.0軟件分別設計cELF4和sELF4基因全長PCR擴增引物和截短擴增引物，各片段相對位置如圖1所示，引物由深圳華大基因股份有限公司合成，引物序列信息見表1和表2。

表1 cELF4引物信息

表2 sELF4引物信息

1.2.2 sELF4和cELF4基因的PCR擴增與重組真核表達載體的構建

以pMD19T-cELF4 或pMD19T-sELF4載體為模板，利用KOD FX Neo高保真酶進行cELF4和sELF4截短序列的PCR擴增。PCR反應體系為：DNA模板2 μL、KOD FX Neo 1 μL、2× PCR Buffer for KOD FX Neo 25 μL，2 mmol/L dNTPs 10 μL，上下游引物各1 μL，滅菌去離子水10 μL。PCR反應程序為：95 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min，35個循環；69 ℃ 7 min；4 ℃保存。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，進行雙酶切，與熒光蛋白報告載體pEGFP-C1連接、轉化Top 10感受態細胞，陽性克隆采用雙酶切和序列測定進行鑒定。

1.2.3 重組質粒的轉染、染色與亞細胞定位的觀察

將長滿單層的HeLa細胞經胰蛋白酶消化、以適當密度接種96 孔板內，采用含10%胎牛血清的DMEM培養基在37 ℃、5% CO2條件下培養24 h；采用XfectTM轉染試劑將重組真核表達質粒轉染HeLa細胞。轉染后48 h，棄培養基，0.85%的生理鹽水洗滌1次，加入Hoechst 33342染液、室溫孵育15 min，棄染液、用0.85%的生理鹽水洗滌3次，熒光倒置顯微鏡下觀察熒光蛋白細胞定位，綠色熒光顯示為目的蛋白，藍色熒光為細胞核。

1.2.4 sELF4和cELF4基因的序列比較分析

利用DNAStar 7.0 對cELF4和sELF4蛋白的氨基酸序列進行對比分析。

2 結果

2.1 sELF4和cELF4基因截短片段的真核表達載體的構建

經PCR擴增，得到cELF4基因的13個分子量分別為1 992、1 734、1 476、1 443、1 386、1 119、441、258、516、549、606、873和1 551 bp的核酸片段(圖2)；克隆至pEGFP-C1載體中構建13個重組真核表達質粒，雙酶切鑒定結果顯示，13個真核質粒均為陽性(圖3)。經PCR擴增得到sELF4基因的17個片段，分子量分別為1 989、1 731、1 473、1 440、1 404、1 383、1 116、948、438、258、516、549、585、606、873、1 041和1 551 bp(圖4)；克隆至pEGFP-C1載體中構建17個重組真核表達質粒，經雙酶切鑒定均為陽性(圖5)。

M. DL2000 Marker；1～13. 分別為cELF4-1-1992、cELF4-259-1992、cELF4-517-1992、cELF4-550-1992、cELF4-607-1992、cELF4-874-1992、cELF4-1552-1992、cELF4-1-258、cELF4-1-516、cELF4-1-549、cELF4-1-606、cELF4-1-873和cELF4-1-1551的PCR產物。

M. DL5000 Marker；1. 重組質粒pEGFP-C1-cELF4-1-1992的雙酶切產物；2. 重組質粒pEGFP-C1-cELF4-1-1992；3. 重組質粒pEGFP-C1-cELF4-259-1992的雙酶切產物；4. 重組質粒pEGFP-C1-cELF4-259-1992；5. 重組質粒pEGFP-C1-cELF4-517-1992的雙酶切產物；6. 重組質粒pEGFP-C1-cELF4-517-1992；7. 重組質粒pEGFP-C1-cELF4-550-1992的雙酶切產物；8. 重組質粒pEGFP-C1-cELF4-550-1992；9. 重組質粒pEGFP-C1-cELF4-607-1992的雙酶切產物；10. 重組質粒pEGFP-C1-cELF4-607-1992；11. 重組質粒pEGFP-C1-cELF4-874-1992的雙酶切產物；12. 重組質粒pEGFP-C1-cELF4-874-1992；13. 重組質粒pEGFP-C1-cELF4-1552-1992的雙酶切產物；14. 重組質粒pEGFP-C1-cELF4-1552-1992；15. 重組質粒pEGFP-C1-cELF4-1-258的雙酶切產物；16. 重組質粒pEGFP-C1-cELF4-1-258；17. 重組質粒pEGFP-C1-cELF4-1-516的雙酶切產物；18. 重組質粒pEGFP-C1-cELF4-1-516；19. 重組質粒pEGFP-C1-cELF4-1-549的雙酶切產物；20. 重組質粒pEGFP-C1-cELF4-1-549；21. 重組質粒pEGFP-C1-cELF4-1-606的雙酶切產物；22. 重組質粒pEGFP-C1-cELF4-1-606；23. 重組質粒pEGFP-C1-cELF4-1-873的雙酶切產物；24. 重組質粒pEGFP-C1-cELF4-1-873；25. 重組質粒pEGFP-C1-cELF4-1-1551的雙酶切產物；26. 重組質粒pEGFP-C1-cELF4-1-1551。

M. DL2000 Marker；1～16. 分別為sELF4-259-1989、sELF4-517-1989、sELF4-550-1989、sELF4-586-1989、sELF4-607-1989、sELF4-874-1989、sELF4-1042-1989、sELF4-1552-1989、sELF4-1-258、sELF4-1-516、sELF4-1-549、sELF4-1-585、sELF4-1-606、sELF4-1-873、sELF4-1-1041和sELF4-1-1551的PCR產物；17. pEGFP-C1-sELE4-1-1989質粒。

M. DL5000 Marker；1. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-259-1989；2. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-259-1989的雙酶切產物；3. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-517-1989；4. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-517-1989的雙酶切產物；5. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-550-1989；6. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-550-1989的雙酶切產物；7. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-586-1989；8. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-586-1989的雙酶切產物；9. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-607-1989；10. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-607-1989的雙酶切產物；11. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-874-1989；12. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-874-1989的雙酶切產物；13. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-1042-1989；14. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-1042-1989的雙酶切產物；15. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-1552-1989；16. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-1552-1989的雙酶切產物；17. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-1-258；18. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-1-258的雙酶切產物；19. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-1-516；20. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-1-516的雙酶切產物；21. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-1-549；22. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-1-549的雙酶切產物；23. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-1-585；24. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-1-585的雙酶切產物；25. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-1-606；26. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-1-606的雙酶切產物；27. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-1-873；28. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-1-873的雙酶切產物；29. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-1-1041；30. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-1-1041的雙酶切產物；31. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-1-1551；32. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-1-1551的雙酶切產物；33. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-1-1989；34. 重組質粒pEGFP-C1-sELF4-1-1989的雙酶切產物。

2.2 sELF4和cELF4的亞細胞定位

亞細胞定位結果顯示，cELF4的1～86 aa(1～258 bp)、292～663 aa(874～1 992 bp)、518～663 aa(1 552～1 992 bp)熒光分布在整個細胞；1～172 aa(1～516 bp)、1～183 aa(1～549 bp)、1～202 aa(1～606 bp)熒光分布在細胞質中；1～291 aa(1～873 bp)、1～517 aa(1～1 551 bp)、1～663 aa(1～1 992 bp)、87～663 aa(259～1 992 bp)、173～663 aa(517～1 992 bp)、184～663 aa(550～1 992 bp)、203～663 aa(607～1 992 bp)熒光分布在細胞核中，1～291 aa(1～873 bp)、203～663 aa(607～1 992 bp)均定位在細胞核，cELF4的核定位信號肽分布在203～291 aa，292～663 aa (874～1 992 bp)定位在細胞質和細胞核中均有分布，且熒光蛋白發生凝聚現象(如圖6)。

圖6 cELF4不同截短片段與EGFP融合表達的亞細胞定位觀察(標尺=100 μm)

sELF4的1～86 aa(1～258 bp)、1～202 aa(1～606 bp)、292～662 aa(874～1 989 bp)、348～662 aa(1 042～1 989 bp)、518～662 aa(1 552～1 989 bp)熒光分布在整個細胞，1～172 aa(1～516 bp)、1～183 aa(1～549 bp)、1～195 aa(1～585 bp)熒光分布在細胞質中，1～291 aa(1～873 bp)、1～347 aa(1～1 041 bp)、1～517 aa(1～1 551 bp)、1～662 aa(1～1 989 bp)、87～662 aa(259～1 989 bp)、173～662 aa(517～1 989 bp)、184～662 aa(550～1 989 bp)、196～662 aa(586～1 989 bp)、203～662 aa(607～1 989 bp)熒光分布在細胞核中，1～291 aa(1～873 bp)、203～662 aa(607～1 989 bp)均定位在細胞核，sELF4的核定位信號肽分布也在203～291 aa(607～873 bp)(如圖7)。

圖7 sELF4不同截短片段與EGFP融合表達的亞細胞定位觀察(標尺=100 μm)

通過對比發現，sELF4的1～202 aa(1～606 bp)分布在整個細胞中，在sELF4-585-606之間還存在一段不完全的定位信號肽，在sELF4 196～291 aa(586～873 bp)之間有可能存在兩個核定位信號肽。cELF4 1～202 aa(1～606 bp)僅僅分布在細胞質中，在cELF4 516～606 aa之間還存在一段細胞質信號肽。 sELF4 292～662 aa和cELF4 292～663 aa在細胞質和細胞核中均有分布，且部分熒光蛋白發生凝聚現象。

2.3 sELF4和cELF4基因序列比較分析

氨基酸序列對比分析結果顯示(圖8)，cELF4蛋白和sELF4蛋白的氨基酸序列中第169～303 aa序列完全一致，說明該區段十分保守。第 320～400 aa序列中差異位點相對較多，共有20個變異位點；cELF4在第357 aa缺失H，在第70～160 aa共有13個差異位點，sELF4在第116、117位缺失S和A。

紅色背景區代表氨基酸差異區域；無背景色區表示氨基酸保守區域。

3 討論

hELF4是近年來新發現的一個在腫瘤發生、發展及腫瘤免疫中至關重要的癌基因[2]。研究表明，hELF4參與細胞周期的調節[5]，介導成脂成骨細胞的分化[6]，參與DNA損傷修復[3]。DNA損傷會破壞代謝穩態并引發炎癥反應，Shi等[17]研究發現，hELF4的敲低增加了4細胞胚胎的DNA損傷，這表明hELF4通過控制基因組完整性進而影響豬的早期胚胎發育。Kosti等[18]的研究結果表明hELF4是miRNA-轉錄因子網絡的關鍵組成部分，是膠質母細胞瘤受體信號通路和脂質動態的橋梁調節因子。衛國紅等[19]研究發現，hELF4能促進胰島素瘤細胞增殖并抑制細胞凋亡，將其與其他類型腫瘤相比，發現ELF4的功能具有一定的多樣性，在不同類型腫瘤中，由于hELF4定位在細胞質或細胞核中而發揮功能的差異性，可能激活不同的信號轉導通路，而其原因可能是在細胞內相互結合的關鍵蛋白因子不同。HeLa細胞是一種宮頸癌細胞，具有無限增殖潛能，且繁殖速度快、可連續傳代，被廣泛應用于腫瘤研究、細胞培養以及生物學試驗等。由于其穩定且增殖活性好、外源基因的蛋白表達量高、便于蛋白質的亞細胞定位觀察，常用于各類蛋白質定位研究的模式細胞[19]。

本研究以GFP為報告基因，將重組質粒轉染HeLa細胞，觀察目的蛋白的亞細胞定位，確定了sELF4全長蛋白和cELF4全長蛋白均定位在細胞核中，這與人ELF4蛋白定位一致。cELF4和sELF4的核定位信號分布在203～291 aa(607～873 bp)，而人ELF4包含兩個核定位信號分別位于173～183 aa和196～202 aa[14]，這說明不同種屬來源的ELF4蛋白的核定位信號肽分布有差異。一般來說，信號肽大概為16～26個氨基酸，而本研究發現信號肽分布在203～291 aa，推測cELF4和sELF4可能存在多個核定位信號；cELF4和sELF4的亞細胞定位存在差異，在cELF4-516-606之間還存在1段細胞質信號肽，而sELF4-516-585之間存在1段細胞質信號肽。此外，發現去除了N端核定位信號肽的sELF4 292～662 aa和cELF4 292～663 aa在細胞質和細胞核中均有分布，且部分熒光蛋白發生凝聚現象，而這一現象在全長蛋白的表達中并未觀察到，推測這種現象可能與蛋白質翻譯后折疊、修飾或親水性發生改變有關。Hamdan等[20]研究發現，內質網應激會導致胞質蛋白穩態缺陷和蛋白質聚集體的形成。蛋白質構象異常或折疊錯誤可導致其結合成更大的、不可溶的結構，蛋白質發生聚集[21]，這與應激或衰老條件下的翻譯錯誤、突變或缺乏寡聚組裝伴侶有關[22]。Jamar等[23]研究結果發現，在缺乏無義介導的mRNA降解、翻譯停滯降解和無終止降解的突變體中，mRNA監測途徑的缺失會導致蛋白質聚集增加。喻嬌等[16]研究發現cELF4基因(GenBank No. MZ198105)與sELF4基因(GenBank No.KU097322)的氨基酸相似性為91.8%。本研究利用DNAStar 7.0 軟件對cELF4基因編碼的氨基酸序列與sELF4基因編碼的氨基酸序列進行對比分析，發現二者在某特定區域(169～303 aa)保守性極高，亞細胞定位試驗顯示cELF4和sELF4的核定位信號均分布在203～291 aa，表明來源于豬和犬的ELF4蛋白核定位信號肽高度保守。

綜上所述，本研究明確了cELF4和sELF4基因的信號肽定位序列分布特征，為后續開展基因功能研究提供了依據。