穿心蓮內酯對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌關鍵耐藥蛋白PBP2a的抑制作用

李彩霞，劉盼盼，陳曉慧，羅小鳳，王桂琴

(寧夏大學動物科技學院，寧夏 銀川 750021)

耐藥菌株引起的高發病率和病死率已經嚴重威脅到人和動物的生命安全，并已成為全球關注的公共衛生問題[1]。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是引起奶牛乳房炎主要的致病菌之一，抗菌藥物的使用仍為奶牛乳房炎主要治療手段。我國奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌分離株耐藥性嚴重，80%～90%菌株對β-內酰胺類藥物耐藥，遠遠高于其他國家，部分省區90%以上金黃色葡萄球菌分離株耐藥[2]。地區不同，耐藥也有很大區別。從新疆地區分離出的菌株對青霉素耐藥率高達93.0%，浙江地區分離出的菌株對青霉素耐藥率為77.35%[3]。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantS.aureus，MRSA)的耐藥機制包括靶位改變、鈍化酶產生、主動外排等，其中抗生素作用靶位的改變是最主要的耐藥機制。細菌細胞壁的肽聚糖合成是由青霉素結合蛋白(penicillin binding proteins，PBPs)催化完成，金黃色葡萄球菌通常可產生4種PBPs，即PBP1、PBP2、PBP3和PBP4，它們參與細胞壁的合成并在細菌細胞周期中發揮至關重要的作用。PBPs具有轉肽酶(transpeptidase，TPase)活性和轉糖基酶(glycosyltransferase，TGase)活性，而β-內酰胺類藥物能與PBPs轉肽酶功能域選擇性結合，使TPase失活[4]。MRSA菌株中存在可移動遺傳元件葡萄球菌盒式染色體mec(SCCmec)，該元件攜帶mecA基因，編碼具有轉肽酶活性的青霉素結合蛋白2a(penicillin binding protein 2a，PBP2a)蛋白[5]。PBP2a蛋白包含3個功能區，其中N末端跨膜區(1～23 aa)將PBP2a固定在細胞膜表面，非青霉素結合區(24～326 aa)主要負責蛋白質的延伸和固定，轉肽酶區(327～668 aa)發揮轉肽酶活性。PBP2a的轉肽酶區含有β-內酰胺類抗生素作用的低親和力位點，與β-內酰胺類藥物難以結合，當其他PBPs被抑制時，PBP2a可代替其功能，完成肽聚糖合成，維持細菌正常生長。

穿心蓮內酯(andrographolide，AP)是一類多靶點的萜類小分子化合物，具有多種生物活性，如抗炎和抗菌等作用[6-7]。AP與β-內酰胺類抗生素聯合使用可以增強MRSA對β-內酰胺類抗生素的敏感性[8]。而PBP2a為MRSA關鍵耐藥蛋白，那么是否AP通過影響PBP2a表達及功能進而使金黃色葡萄球菌對β-內酰胺類藥物增敏？為探究這一科學問題，本研究首先通過生物信息學及分子模擬等手段分析PBP2a的蛋白分子特性及AP與PBP2a蛋白的作用及其結合模式，探究AP對PBP2a蛋白功能的影響；隨后，測定了AP作用下PBP2a轉錄水平變化；通過原核表達純化PBP2a蛋白，制備多克隆抗體，檢測AP對PBP2a表達量的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株

金黃色葡萄球菌參考菌株ATCC33591購自中國藥品與生物制品檢定所，試驗菌株為本實驗室從寧夏不同地區奶牛場乳房炎乳樣中分離出的MRSA(WLD10、WLD1、XF2)。

1.2 實驗動物

8周齡成年新西蘭大白兔，購自四川里來思諾生物科技有限公司。

1.3 藥品與試劑

穿心蓮內酯，純度99.89%，購自美國Med Chem Express公司；TRIzol試劑購自日本TaKaRa公司；二甲基亞砜(DMSO)和0.2 μm PVDF膜均購自德國Merck公司；熒光定量試劑購自美國ABclonal公司；內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ購自紐英倫生物技術(北京)有限公司；ECL化學發光顯色液試劑購自上海雅酶生物醫藥科技有限公司；辣根過氧化物(HRP)標記山羊抗兔IgG購自亞科因(武漢)生物技術有限公司；異丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購自北京索萊寶科技有限公司；Ni2+親和層析柱購于上海生工生物工程有限公司；BCA蛋白含量檢測試劑購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；脫脂奶粉購自美國BD公司。

1.4 熒光定量PCR檢測AP對mecA基因轉錄水平的影響

選擇4株MRSA菌株ATCC33591、WLD10、WLD1、XF2劃線培養，挑取單菌落過夜培養至對數生長期，按1∶100的比例稀釋，然后分別加至終濃度為0、64、128、256 μg/mL的AP，繼續培養12 h。使用TRIzol法提取總mRNA，使用逆轉錄試劑盒將mRNA轉錄為cDNA。以gyrB為內參基因，使用SYBR Green Real-time熒光PCR預混液在20 μL反應體系進行qPCR反應。利用2-ΔΔCt法對結果進行處理[9]，引物序列信息見表1。

表1 引物序列信息

1.5 蛋白分子結構分析

利用在線軟件NPS@:SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)對PBP2a蛋白二級結構進行預測和分析。采用在線服務器Consurf Web Serve(http://consurf.tau.ac.il/)進行同源性建模和保守性分析[10]。利用PyMOL軟件將保守性氨基酸映射到PBP2a蛋白的三維結構上，并分析氨基酸保守性與蛋白結構和功能的聯系。

1.6 分子對接

采用SWISS-MODEL進行同源建模，獲得PBP2a蛋白的三級結構。將能量最小化的優勢構象作為PBP2a蛋白對接的初始構象。AP小分子結構文件來源于PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，隨后利用PyMOL軟件將結構文件轉化為PDB格式。使用AutoDock對蛋白去水、加氫、計算電荷以及設置小分子的旋轉鍵等預處理后進行半柔性分子對接。最終選取兼顧打分和構象契合的最優結果，使用BIOVIR Discovery Studio 2020進行可視化[11]。

1.7 動力學模擬

進一步驗證AP與PBP2a蛋白的結合穩定性。分子對接后，以PBP2a-AP復合物作為初始構象，使用Gromacs 2020版本對復合物進行分子動力學模擬(molecular dynamics simulation，MD)[12]。此處，MD模擬的分子力場選擇為OPLS3e，并使用TIP3水模型對系統進行溶劑化，通過添加離子對系統電荷進行中和，整個系統的能量最小化是使用全原子型OPLS3e力場來實現[13]。水分子的幾何結構、重原子的鍵長和鍵角都是通過SHAKE算法來約束[14]。通過應用周期性邊界條件對連續系統進行模擬，并通過粒子網格Ewald方法維持長程靜電[15]。在進行動力學模擬之前先對模型進行優化：(1)限制溶劑，進行能量最小化；(2)沒有限制，能量最小化；(3)溫度10 K，Berendsen熱力學方法，運行12 ps，每1 ps重新采樣1次；(4)NPT系綜，溫度300 K，壓力1.01×105Pa，正常壓力釋放系數，運行24 ps[16]；(5)MD成品：前期準備結束后，以1.2 fs的時間進行100 ns的運行，每25 ps進行一次軌跡記錄，總計記錄4 000幀。計算PBP2a蛋白及復合物主鏈原子的均方根偏差(RMSD)，衡量復合物體系的穩定性；以均方根波動(RMSF)反映蛋白氨基酸殘基的結構柔性；通過回旋半徑(Rg)考量AP對PBP2a蛋白結構折疊緊密度的影響，捕捉PBP2a與AP間氫鍵數目及持續時間主鏈原子的RMSD，以了解蛋白質-配體相互作用的性質。

1.8 PBP2a蛋白的原核表達

1.8.1mecA基因的PCR擴增

從NCBI基因數據庫中下載mecA基因序列，根據基因序列設計引物，并送至生工生物工程股份有限公司合成。在引物兩端加入限制性酶切位點保護堿基，目的基因上游引物序列為：5′-CGGGATCCACTATTGATGCTAAAGTTCA-3′，下游引物序列為：5′-GGAATTCGCAACCCACGTTACCGGATTG-3′，Prime STAR Max DNA Polymerase 進行PCR擴增，并膠回收目的片段。引物序列下劃線處分別為BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點。

1.8.2 重組質粒pET28a-mecA的構建

將回收目的片段及質粒pET28a經BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，酶切產物回收后使用T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接。轉化至DH5α感受態，經卡那霉素篩選及PCR鑒定獲得陽性菌落，提取質粒進行酶切鑒定，鑒定正確的質粒送至生工生物工程股份有限公司進行測序驗證。

1.8.3 重組質粒轉化

將測序正確的重組質粒pET28a-mecA轉化至BL21(DE3)感受態細胞，經卡那霉素抗性篩選，PCR鑒定獲得陽性菌落，于-80 ℃保存備用。

1.8.4 重組蛋白PBP2a的誘導表達

將新鮮的單菌落挑取至5 mL含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB過夜培養，1∶100轉接至100 mL卡那霉素抗性LB。37 ℃ 200 r/min震蕩培養3 h，當菌液OD600值為0.6～0.8時，加入IPTG(1 mmoL，1∶1 000)誘導劑，160 r/min，25 ℃誘導24 h后進行SDS-PAGE分析。

1.8.5 重組蛋白的鑒定

同1.8.4方法制備樣品經SDS-PAGE分離后，120 V轉印PVDF膜，用5%脫脂奶4 ℃封閉過夜，一抗為抗His標簽抗體(1∶2 000稀釋)，孵育1 h后TBST緩沖液洗4次，每次10 min；二抗為HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶2 000稀釋)，孵育1 h，TBST洗滌4次，ECL顯色。

1.9 PBP2a多克隆抗體的制備

1.9.1 重組蛋白純化

同1.8.4方法小量誘導表達目的蛋白，離心取上清液和沉淀進行SDS-PAGE鑒定，以相同條件大量誘導表達重組蛋白，使用Ni2+親和層析柱進行純化。然后進行最適洗滌濃度確定，20、50、75、100、150、250 mmol/L咪唑緩沖液洗滌，確定目的蛋白不被洗脫的最大咪唑濃度為最佳洗滌濃度。

1.9.2 免疫程序

第一次免疫使用弗氏完全佐劑與0.2 mg的重組蛋白進行等體積乳化，背部皮下多點注射，在一免后14 d進行二免，28 d進行三免，二免、三免使用弗氏不完全佐劑。

1.9.3 蛋白質免疫印跡檢測抗體特異性

含有pET28a-mecA的質粒并誘導后的大腸桿菌作為對照，同時使用MRSA菌株制備樣品，以制備的抗重組蛋白PBP2a的多克隆抗體作為一抗，HRP標記的山羊抗兔IgG作為二抗，鑒定多克隆抗體對重組PBP2a蛋白和MRSA源PBP2a的特異性。

1.10 蛋白質免疫印跡檢測AP作用下PBP2a蛋白含量的變化

過夜培養MRSA菌株WLD10，1∶100接種至TSB培養基，培養至對數生長期，加入AP使各管濃度分別為0、64、128、256 μg/mL，37 ℃、200 r/min過夜培養。次日將菌液濁度調整至OD600=1.0，用超聲儀破碎。使用BCA法測定蛋白含量，將蛋白總含量稀釋一致后使用5×loading Buffer進行金屬浴加熱10 min，樣品制備完成進行SDS-PAGE，轉膜，封閉，孵育一抗(PBP2a蛋白多克隆抗體)，孵育二抗(HRP標記的山羊抗兔IgG)，ECL顯影檢測蛋白表達量。

2 結果與分析

2.1 熒光定量PCR分析mecA基因轉錄水平

經64、128、256 μg/mL濃度的AP處理，MRSA菌株ATCC33591、WLD10、WLD1、XF2中mecA基因的轉錄水平均顯著下調(P<0.01)，且隨著AP濃度的升高，4株菌mecA的轉錄水平均逐漸降低(圖1)。

**表示與對照組(0 μg/mL AP)比較P<0.01。下同。

2.2 PBP2a蛋白分子特征分析

二級結構預測分析顯示，PBP2a蛋白為單體及二聚體結構，含有33.98% α螺旋、18.11% 延伸鏈、7.93% β轉角、39.97% 無規則卷曲。利用Consurf服務器進行保守性分析，通過PyMOL軟件將保守性和溶劑可及性賦值投影至三維結構上，從而關聯保守性氨基酸與結構和功能的關系。結果顯示，Met1-Lys3、Asp156-Asn158、Ser261-Lys265、Thr354-Leu360、Val361-Tyr369、Ser462-Arg469、Leu514-Gly520、Ile595-Lys604、Gln613-Ile618區域和GLU 284、ASP288殘基高度保守。氨基酸溶劑可及性通過卷積神經網絡算法預測，其中包含多個埋藏于蛋白內部用于維持結構特異性的高度保守性殘基，它們分別是Val45、Tyr46、Trp127、Ile154、Leu264、Tyr373、Phe395、Ala471等氨基酸殘基；Met1、Arg65、Thr103、Gly106、Ile132、Arg150、Gly151、ASP288、Gln333、Ser437等保守殘基位于PBP2a蛋白表面，可能在生物學功能發揮中起到至關重要的作用。

2.3 AP和PBP2a蛋白的結合模式分析

對接結果的3D、2D結合構象可視化見圖2，AP與蛋白PBP2a的GLU170、GLU239和THR238殘基形成4個氫鍵，并通過烷基間分子作用力與殘基VAL277、PRO258結合、與殘基TYR373形成π-烷基堆積作用力，結合能顯示PBP2a蛋白與AP小分子具有較強結合能力。

圖2 分子對接結果3D(A)、2D(B)展示

A.PBP2a-AP復合物的RMSD；B.表示復合物的RMSF；C.PBP2a-AP配合物的Rg；D.表示PBP2a和AP的氫鍵數。

2.4 分子動力學模擬

為進一步研究AP分子與PBP2a蛋白的相互作用，本研究對PBP2a-AP復合物進行了100 ns的分子動力學模擬。如圖3A所示，復合物的RMSD小于4.5?，而且復合物在較短的(18 ns)時間內達到了動態平衡，這表明AP與靶蛋白PBP2a能夠形成穩定的復合物。根據圖3B可知，大部分的氨基酸構象變化較小，AP分子可通過結合降低PBP2a蛋白中殘基的結構柔性。這也是復合物RMSD變化較小的主要原因。氫鍵在復合物形成中的作用也很關鍵，形成的氫鍵越多，兩者將具有更強的結合活性，再結合Rg，Rg越小，表明AP對蛋白結構折疊的影響越輕微。從圖3C和圖3D可知，小分子與蛋白結合良好，能夠形成穩定的復合物從而實現小分子其活性功能。在整個分子動力學模擬過程，活性位點殘基的結合情況可反映PBP2a蛋白與配體AP間更詳盡的能量細節。根據結合能(表2)可以看到，蛋白的GLU145，GLU170，ASN164，ASP275，VAL277，GLU284，ASP288，ASP295，TYR373等氨基酸貢獻的結合自由能最為突出，特別是與VAL277結合能達到 -6.78 kJ/mol，位于PBP2a蛋白的功能區氨基酸TYR373結合自由能達到-5.199 4 kJ/mol(圖4)，對穩定蛋白口袋中的小分子有著重要作用，另一方面也表明了分子與蛋白位點存在的這些作用可有效促使小分子牢牢地錨定在蛋白活性位點，從而形成穩定的復合物。

圖4 與配體相互作用的每個蛋白質殘基的結合自由能的分解

表2 結合能及其所選生物活性分子的組成能

2.5 PCR擴增mecA片段

mecA基因PCR擴增所得產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖5所示，在1 000 bp附近存在條帶，與預期1 026 bp符合。

M. DL2000 Marker；1.PCR擴增產物。

2.6 重組質粒pET28a-mecA的酶切鑒定

提取的重組質粒經BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鑒定結果如圖6所示。重組質粒的mecA基因序列未出現突變和移碼，表明原核表達載體pET28a-mecA成功構建。

M. DL10000 Marker；1.重組質粒雙酶切；2.重組質粒。

2.7 重組蛋白PBP2a的表達

通過不斷優化誘導表達條件，發現在1 mmol/L的IPTG濃度下，低溫25 ℃誘導24 h可獲得目的蛋白。經蛋白質免疫印跡檢測PBP2a蛋白的N端His標簽，特異性反應條帶約為38 kDa，見圖7，與預期結果相符。

M. 蛋白Marker；1.PBP2a重組蛋白。

2.8 重組蛋白PBP2a的純化

重組蛋白經IPTG誘導，用超聲破碎儀破碎后，離心分別取上清液和沉淀進行SDS-PAGE鑒定，發現沉淀和上清液都存在目的蛋白，取上清液經Ni2+純化柱進行純化，最佳洗滌的咪唑濃度為75 mmol/L，用150 mmol/L的咪唑對目的蛋白進行洗脫，獲得大小約38 kDa的目的蛋白(圖8)。

M. 蛋白Marker；1～6.75 mmol/L咪唑洗滌蛋白；7～9.150 mmol/L咪唑洗脫蛋白。

2.9 蛋白質免疫印跡分析PBP2a蛋白多克隆抗體的特異性

使用制備的抗重組蛋白PBP2a的多克隆抗體對PBP2a重組蛋白及MRSA菌株中的PBP2a蛋白進行免疫反應性分析。如圖9所示，在38 kDa左右出現特異性目的條帶，表明該多克隆抗體可與原核表達的PBP2a蛋白及MRSA菌株中的PBP2a蛋白發生特異性反應，進而實現對PBP2a蛋白表達量的檢測。

M. 蛋白Marker；1.重組蛋白PBP2a；2.MRSA菌內PBP2a蛋白。

2.10 蛋白質免疫印跡檢測AP作用下PBP2a蛋白含量的變化

將經0、64、128、256 μg/mL的AP處理的MRSA菌株，標定總蛋白含量制樣，蛋白質免疫印跡測定PBP2a的蛋白含量變化。結果如圖10所示，在38 kDa左右處出現目的條帶，與未處理的MRSA菌株內PBP2a蛋白相比，經處理的PBP2a蛋白表達量顯著降低(P<0.01)，且隨著AP濃度的升高，PBP2a的表達量逐漸降低。

圖10 蛋白質免疫印跡檢測PBP2a蛋白表達量

3 討論

細菌耐藥性已成為威脅全球公共衛生健康的重要因素之一，革蘭陽性和陰性菌中的多重耐藥模式導致傳統抗菌劑難以治療甚至無法治療[17]。 MRSA幾乎耐所有的β-內酰胺類藥物，且對多種抗生素耐藥，引起的感染也極難治療。因此，開發有效的抗MRSA感染治療策略或抑制劑對治療至關重要。隨著對植物抗微生物成分的探索，一些候選藥物表現出潛在的抑菌活性，被認為是安全、無毒、不易產生副作用的天然化合物，因此被廣泛應用于研究[18-19]。

PBPs在細菌細胞壁的肽聚糖合成中發揮作用[20]。 PBPs主要參與肽鉸鏈橋的形成，催化鄰近糖鏈，肽側鏈之間的特定交聯來輔助細胞壁的合成。當β-內酰胺類抗生素使PBPs失去活性時，PBP2a卻能代替其功能繼續完成肽聚糖的合成，使細菌可以繼續生長，并呈現高度耐藥性[21]。因此，抑制PBP2a的功能，進而抑制細菌細胞壁肽聚糖的合成是使MRSA對β-內酰胺類增敏的可能途徑。

AP是穿心蓮的主要活性成份，具有多種生物學效應，其抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗菌并治療多種疾病，在體內和體外有廣泛的治療作用，具有大量藥理學靶點[22]。本試驗通過熒光定量PCR測定發現，不同濃度AP處理的MRSA菌株mecA基因的轉錄水平均有下調，且具有濃度依賴；進一步通過原核表達及抗體制備獲得PBP2a重組蛋白及其多克隆抗體，經蛋白質免疫印跡驗證，表明AP可以通過抑制mecA基因的轉錄和表達來抑制PBP2a蛋白。

分子模擬在很多研究中被用于篩選抗金黃色葡萄球菌的有效分子[23-24]。本試驗采用半柔性分子對接及全原子動力學模擬來探究AP與PBP2a蛋白的相互作用及結合模式，其中分子對接結果顯示，AP會與PBP2a形成4個氫鍵，還存在烷基間分子作用力，同時，會在π-烷基堆積作用力下形成復合物，這些氨基酸殘基與AP結合可能會損害其生物學功能，且氫鍵的出現對復合物的形成至關重要，幾乎起到決定性作用[22]。其中TYR373殘基位于PBP2a蛋白的功能區，AP與TYR373殘基的結合會使PBP2a蛋白無法發揮其轉肽酶功能。這些結果都說明AP對PBP2a蛋白有一定抑制潛力。分子動力學模擬被認為是一項分析蛋白質配體相互作用的關鍵技術，為了分析AP和PBP2a蛋白結合的可靠性，將AP-PBP2a復合物進行了分子動力學模擬。分析結果發現復合物的RMSD小于4.5?，復合物RMSD變化較小，Rg也在比較小的范圍內波動，這些都說明AP-PBP2a復合物比較穩定。再結合活性位點殘基的結合情況分析，小分子與蛋白位點的氨基酸存在很好的氫鍵以及疏水相互作用，其中殘基GLU284，ASP288是高度保守的殘基，AP與其結合可能使PBP2a蛋白的生物學功能受到影響；與VAL277殘基的結合能達到 -6.78 kJ/mol，結合能越低對穩定蛋白口袋中的小分子有著重要作用，與功能區氨基酸TYR373結合能達到-5.199 4 kJ/mol。以上分析說明AP對MRSA主要耐藥蛋白PBP2a存在抑制作用，并顯示出巨大的潛力。

綜上，本研究從分子模擬的角度提出了AP與PBP2a蛋白存在結合效應，揭示了AP對PBP2a的抑制潛力。同時發現，AP下調mecA轉錄水平，并抑制MRSA菌株中PBP2a蛋白的表達，且呈劑量依賴性。總之，AP可抑制PBP2a蛋白的轉錄和表達，并有可能會損壞其構象來提高MRSA對β-內酰胺類抗生素的敏感性。