宮內發育遲緩仔豬斷奶后腸道菌群特征及其與生長的潛在聯系

劉洋，孔祥峰，余祖功

(1. 南京農業大學動物醫學院，江蘇 南京 210095；2. 中國科學院亞熱帶農業生態研究所/動物營養生理與代謝過程湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410125)

近年來，隨著集約化生豬養殖業的快速發展，人們對高產母豬的需求日漸增加。然而，隨著母豬產仔數的增加，新生仔豬宮內發育遲緩(IUGR)的發生率高達15%～20%[1]。新生IUGR仔豬營養獲取不足，體重輕、免疫力弱，造成生長發育緩慢、腹瀉率高和死亡率高等問題[2]。經常在斷奶前死亡或者被淘汰，造成了極大的浪費[3]。腸道是抵抗病原入侵的重要屏障，對維持動物機體健康具有重要意義[4]。腸道菌群的早期定植與動物腸道免疫和屏障功能的成熟以及生長發育密切相關[5]。IUGR新生仔豬的腸道發育和屏障功能受損嚴重，是導致IUGR仔豬腸道疾病發生和生長性能降低的重要原因[6]。有研究表明，新生IUGR仔豬腸道微生物的早期定植、結構組成、代謝特征與正常體重(NBW)仔豬明顯不同[7]。然而，斷奶IUGR仔豬腸道微生物的定植特征尚不清楚，因此，本文旨在研究斷奶后NBW仔豬與IUGR仔豬的腸道微生物定植特征及其與器官生長發育的潛在聯系，為改善IUGR仔豬的生長性能和腸道健康提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物、分組與飼養管理

動物飼養試驗在中科院亞熱帶農業生態研究所試驗場開展。試驗選用胎次和體況相近的健康長白×大白妊娠母豬24頭(湖南益陽新五豐豬場)，分娩后根據每窩的產仔數(10～14頭)選出12窩新生仔豬。本試驗中，將新生仔豬體重低于窩平均體重10%的仔豬稱為IUGR仔豬，將大于平均體重的仔豬稱為NBW仔豬[8]，根據每窩平均體重，從每窩中挑出NBW仔豬和IUGR仔豬各1頭，總計24頭，分為NBW組和IUGR組，每組12頭。所選仔豬由母豬自然哺乳喂養，21日齡斷奶后單欄飼養適應1周后，(7.50±0.29)kgNBW仔豬和(5.68±0.43)kgIUGR仔豬開始飼喂28 d的保育料[9]，日糧的組成及營養水平見表1。母豬和仔豬飼養管理、消毒和免疫等按正常養殖標準規范操作。

表1 日糧組成與營養水平(風干基礎)

1.2 測定指標與方法

1.2.1 器官系數測定

斷奶仔豬飼喂28 d時，禁食12 h后空腹稱重，采用麻醉后放血處死，屠宰后分離肝臟、脾臟和胰腺稱重并記錄，計算器官系數。計算公式為：器官系數=器官重(g)/末體重(kg)。

1.2.2 腸道微生物測序

取中段部位的空腸、回腸和結腸內容物，裝入離心管中，液氮速凍后-80 ℃保存。取0.2 g左右腸道內容物，采用OMEGA Soil DNA Kit(D5625-01，Omega Bio-Tek，Norcross，GA，USA)試劑盒提取微生物總DNA。采用16S rRNA V3-V4區特異性引物擴增，上游引物為5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′，下游引物為5′-TCGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。擴增程序為：98 ℃ 2 min預變性；98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個循環；最后72 ℃延伸5 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗擴增產物，采用DNA回收試劑盒(Axygen Biosciences，Union City，CA，USA)回收DNA產物，并用QuantiFluorTM-ST微型熒光儀(Promega，Madison，WI，USA)進行核酸質量檢驗，之后在Illumina平臺上進行測序。

使用QIIME2對下機數據進行質控，使用DADA2軟件對序列進行過濾、去噪、合并和去除嵌合體。用Greengenes數據庫對擴增子序列變體進行分類和物種注釋。序列數據分析主要采用QIIME2平臺進行，利用其多樣性分析插件進行微生物α多樣性分析，檢測指標包括Shannon、Simpson、Observed_species和Chao1。微生物β多樣性分析，采用主坐標分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)和非度量多維尺度分析(nonmetric multidimensional scaling，NMDS)對腸道微生物組學數據進行降維處理，并進行可視化以觀察菌群的結構差異。采用Mann-WhitneyUtest分析門和屬分類水平上不同組仔豬腸道微生物群的豐度差異。

1.3 相關性分析

采用基于R包的Spearman相關性檢驗方法，檢測仔豬腸道差異菌群與器官發育指標的相關性。

1.4 統計分析

采用Excel進行數據的整理，并用SPSS 20.0軟件進行獨立樣本t檢驗來分析顯著性，結果以“平均值±標準誤”表示，P<0.05表示組間數據有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 NBW與IUGR仔豬器官生長發育的比較

如表2所示，與NBW仔豬相比，IUGR仔豬的末重、肝臟重、胰腺重、空腸重和空腸長度均顯著降低(P<0.05)，而IUGR仔豬的肝臟系數，回腸重、長度和系數以及結腸重、長度與系數均顯著升高(P<0.05)。

表2 NBW仔豬與IUGR仔豬器官發育指標的比較

2.2 NBW與IUGR仔豬腸道菌群多樣性的比較

如圖1和2所示，NBW和IUGR仔豬的空腸、回腸和結腸菌群α多樣性沒有明顯差異，并且β多樣性結果也顯示兩組仔豬的腸道菌群沒有明顯的聚類特征。

JN和JI分別表示NBW仔豬和IUGR仔豬空腸；IN和II分別表示NBW仔豬和IUGR仔豬回腸；CN和CI分別表示NBW仔豬和IUGR仔豬結腸，下同。

A～C.仔豬空腸、回腸和結腸菌群的主坐標分析(PCoA)結果；D～F.仔豬空腸、回腸和結腸菌群非度量多維尺度分析(NMDS)結果。

2.3 NBW與IUGR仔豬腸道菌群在門水平上比較

如圖3所示，在空腸內容物中，NBW仔豬優勢菌門為厚壁菌門(Firmicutes，77.87%)，擬桿菌門(Bacteroidetes，4.27%)，變形菌門(Proteobacteria，6.66%)和放線菌門(Actinobacteria，6.74%)，IUGR仔豬優勢菌門為Firmicutes(74.47%)，Bacteroidetes(3.51%)，Proteobacteria(12.46)和Actinobacteria(4.69%)；在回腸內容物中，NBW仔豬優勢菌門為Firmicutes(92.06%)，Bacteroidetes(1.44%)，Proteobacteria(3.13%)和Actinobacteria(2.41%)，IUGR仔豬優勢菌門為Firmicutes(85.37%)，Bacteroidetes(1.5%)，Proteobacteria(6.13%)和Actinobacteria(6.04%)；在結腸內容物中，NBW仔豬優勢菌門為Firmicutes(59.62%)，Bacteroidetes(37.44%)，Proteobacteria(0.35%)和螺旋體門(Spirochaetes，1.31%)，而IUGR仔豬優勢菌門為Firmicutes(58.19%)，Bacteroidetes(39.28%)，Spirochaetes(0.79%)和Actinobacteria(0.49%)。與NBW仔豬相比，IUGR仔豬空腸Proteobacteria豐度呈升高趨勢(P=0.08)，回腸Proteobacteria和Actinobacteria豐度顯著升高、Firmicutes豐度顯著降低(P<0.05)。

A. NBW和IUGR仔豬空腸、回腸和結腸菌群在門水平上的組成；B. NBW和IUGR仔豬空腸、回腸和結腸在門水平上的差異。

A. NBW和IUGR仔豬空腸、回腸和結腸菌群在屬水平上的組成；B～E. NBW和IUGR仔豬空腸的差異菌；F～I. NBW和IUGR仔豬回腸的差異菌；J～M. NBW和IUGR仔豬回腸的差異菌。

2.4 NBW與IUGR仔豬腸道菌群在屬水平上比較

如圖示4所示，在空腸內容物中，NBW仔豬優勢菌屬為乳桿菌屬(Lactobacillus，18.34%)，鏈球菌屬(Streptococcus,14.71%),魏斯氏菌屬(Weissella,4.79%)和SMB53(1.68%),而IUGR仔豬優勢菌群為Lactobacillus(18.65%)，Streptococcus(14.10%)，假單胞菌屬(Pseudomonas，5.40%)和Weissella(4.28%)；在回腸內容物中，NBW仔豬優勢菌屬為Lactobacillus(24.65%)，Streptococcus(16.13%),Weissella(4.81%)和梭菌屬(Clostridium,1.99%),IUGR仔豬優勢菌屬為Lactobacillus(15.74%)，Streptococcus(15.11%)，Weissella(3.25%)和棒狀桿菌屬(Corynebacterium，2.83%)；在結腸內容物中，NBW仔豬優勢菌屬為普氏菌屬(Prevotella，23.05%)，Lactobacillus(5.09%)，顫螺旋菌屬(Oscillospira，4.87%)和羅斯氏菌屬(Roseburia，3.07%)，IUGR仔豬優勢菌屬為Prevotella(18.44%)，Oscillospira(3.61%)，糞桿菌屬(Faecalibacterium，2.85%)和Roseburia(2.72%)。

此外，與NBW仔豬相比，IUGR仔豬空腸葡萄球菌屬(Staphylococcus)和布雷德菌屬(Bulleidia)豐度顯著升高(P<0.05)，雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和Allobaculum豐度顯著降低(P<0.05)；IUGR仔豬回腸Corynebacterium、放線菌屬(Actinomyces)、芽殖菌屬(Gemmiger)和Bulleidia豐度均顯著升高(P<0.05)；IUGR仔豬結腸Clostridium和Bulleidia豐度顯著升高(P<0.05)，Dorea和布勞特氏菌屬(Blautia)豐度顯著降低(P<0.05)。

2.5 NBW與IUGR仔豬腸道菌群豐度與器官生長發育的相關性分析

如圖5所示，仔豬空腸Firmicutes與肝系數呈顯著負相關(P<0.05)，Bulleidia與末重、肝臟重和空腸重呈顯著負相關、與脾系數呈顯著正相關(P<0.05)，Staphylococcus與末重、肝臟重和胰腺重呈顯著負相關(P<0.05)；仔豬回腸Firmicutes與回腸重、回腸長度和回腸系數呈顯著負相關(P<0.05)，Proteobacter與回腸重、回腸系數和肝系數呈顯著正相關(P<0.05)，Actinomyces與肝系數呈顯著正相關(P<0.05)，Gemmiger與回腸系數和肝系數呈顯著正相關(P<0.05)，Bulleidia與回腸系數呈顯著正相關(P<0.05)；仔豬結腸Actinobacteria與結腸重和結腸系數呈顯著正相關(P<0.05)，Proteobacteria與胰腺重呈顯著負相關(P<0.05)。

A. NBW和IUGR仔豬空腸差異菌與器官發育的相關性熱圖；B. NBW和IUGR仔豬回腸差異菌與器官發育的相關性熱圖；C. NBW和IUGR仔豬結腸差異菌與器官發育的相關性熱圖。

3 討論

哺乳動物腸道微生物深刻影響著宿主的健康和疾病進程[1]。越來越多的研究表明，腸道菌群改變了宿主腸道營養物質的代謝過程[2]，并且還對宿主代謝和生長發育有著深遠影響[10]。本文研究了NBW仔豬和IUGR仔豬腸道菌群定植特征的差異，并探討了其與仔豬器官發育的潛在聯系。研究結果表明，IUGR嚴重阻礙了仔豬器官的生長發育，還顯著改變了斷奶仔豬腸道菌的組成和豐度，并且二者之間存在一定的聯系。

腸道的正常發育對動物營養物質消化吸收和生長發育至關重要[11]。有研究結果表明，仔豬小腸長度與其平均日增重、平均日采食量和末重呈顯著正相關，小腸較長的仔豬具有更好的消化和吸收能力[12]。在本試驗中，斷奶仔豬經28 d飼喂后發現，IUGR仔豬的末重和器官系數(包括肝臟和腸道等)仍然顯著低于NBW仔豬，并且IUGR豬的空腸、回腸和結腸重量和長度也明顯降低，這與我們的前期研究結果一致[7]。綜上結果表明，IUGR可降低斷奶仔豬器官的正常生長發育，并且腸道發育受損可能是影響IUGR仔豬生長的重要因素[13]。

腸道菌群在維護宿主正常生理過程方面發揮著重要作用，并且其組成和活性也受到宿主腸道內環境的影響。我們的前期研究表明，哺乳IUGR仔豬腸道菌群的結構和豐度以及與宿主代謝相關的腸道菌群代謝通路發生明顯改變[14]。在本試驗中，NBW仔豬和IUGR仔豬斷奶后28 d內腸道菌群的多樣性和豐富度未發生明顯改變，而斷奶前IUGR仔豬腸道微生物的多樣性低于NBW仔豬[7]，這可能是因為隨著日齡的增加IUGR仔豬腸道發育更加成熟，有助于腸道正常菌群的定植[15]。此外，在本試驗中，仔豬腸道菌群在門和屬水平上的組成與豐度發生明顯改變。與NBW仔豬相比，IUGR仔豬空腸Proteobacteria豐度以及回腸Proteobacteria和Actinobacteria豐度顯著升高，而Proteobacteria中包括埃希菌屬、沙門菌屬和弧菌屬等與腸道炎癥有關的菌群[16]。這表明盡管隨著日齡的增長IUGR仔豬腸道功能有所恢復，但是仔豬仍然面臨著腸道疾病的威脅。此外，Firmicutes與宿主對食物中能量的攝取能力有關，肥胖兒童和成人腸道中含有更高的Firmicutes數量[17]。本試驗中IUGR仔豬腸道Firmicutes豐度顯著降低，提示腸道菌群可能是阻礙IUGR仔豬能量獲得的原因之一。

Spearman分析常用來研究兩個或多個變量之間的潛在聯系。本試驗采用Spearman分析發現了多對仔豬腸道菌豐度與器官發育指標之間的相關關系，其中，負相關關系包括回腸Firmicutes與回腸重、回腸長度和回腸系數等；正相關關系包括Proteobacter與回腸重、回腸系數和肝系數，Actinomyces與肝系數等。有研究表明，腸道中Firmicutes的豐度降低不利于腸道能量的利用，進而影響宿主能量代謝[18]；而Proteobacteria豐度升高可能導致致病菌的增加，引起腸道嚴重的免疫反應，不利于仔豬的腸道健康[19]。此外，有研究表明，無菌小鼠有著更小的肝臟和腸質量、更薄的腸壁和更大的盲腸[20]，這顯示出腸道菌具有促進動物生長和器官發育的重要作用。以上結果表明，腸道菌群可能在IUGR仔豬的生長發育中有負面效應，提示通過改善IUGR仔豬腸道菌群穩態可能是提高其腸道健康和促進其生長發育的有效手段之一。

4 結論

IUGR可降低斷奶仔豬的生長發育和器官系數，而對仔豬空腸、回腸和結腸菌群的α多樣性沒有影響，但是顯著改變仔豬各腸段菌群的組成和豐度，且這種改變與仔豬的器官生長發育存在一定的關系。