真菌發酵銀杏葉產纖維素酶效果的比較

劉秋晨 單春喬 劉恩 劉星 雷梓倫 劉艷 莊國宏

摘要 為獲得銀杏葉飼料纖維素酶高產菌株，對從古銀杏土壤中分離出的40株真菌進行發酵試驗，結果表明：在供試各類真菌中，曲霉菌產生的纖維素酶分解銀杏葉中的纖維素能力最強，其次是青霉，再其次是毛霉和木霉。若用于真菌發酵產纖維素酶的生產中，曲霉和青霉是比較優良的菌種，其中編號為YX201040C的黑曲霉和編號為YX2010216的焦曲霉最為合適。

關鍵詞 真菌；纖維素酶； 酶活力；葡萄糖

中圖分類號 S816.7? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2024）03-0187-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.03.045

Comparation of Cellulase Activity from Fungus Fermenting Gingko Leaves

Abstract To obtain fungus that can generate cellulase productively，the fermentation experiment of 40 strains of fungi isolated from ancient ginkgo soil was carried out.According to the experiment，we found that cellulose generated by Aspergillus can degradate the cellulose in ginkgo leaf fastest，Penicillium is in the next place，mucoraceae and trichoderma are in the third place. If we want to apply fungus to generate cellulose， Aspergillus and Penicillium are good selection， among them， Aspergillus niger named YX201040C and Aspergillus ustus named YX2010216 are the best choice.

Key words Fungus;Cellulase;Enzymatic activity;Glucose

銀杏又稱白果、公孫樹，國家二級保護植物，為銀杏科銀杏屬銀杏種，屬于裸子植物門，為我國獨有的樹種。在我國，銀杏分布范圍廣，20多個省市（區）都有銀杏的自然分布，銀杏資源非常豐富［1］。銀杏營養豐富，含有淀粉、糖類、蛋白質、脂肪、維生素C、核黃素、胡蘿卜素和鈣、磷、鐵、鉀、鎂等礦質元素，以及銀杏酸、白果酚［2］。銀杏葉多皺折，完整者呈扇形，上緣呈不規則的波狀彎曲，具二叉狀平行葉脈，細而密，光滑無毛，易縱向撕裂，多呈黃綠色或淺棕色［3］。作為藥材多用于治療肺虛咳喘、冠心病、心絞痛等［4］。銀杏葉中的主要活性成分有黃酮、萜內酯、花青素和多糖等，且以黃酮為主。

銀杏黃酮不僅對機體的免疫細胞、體液及非特異性免疫功能有影響，而且還能增強機體的免疫器官功能［5］。黃酮類化合物中抗菌成分較多，對多種細菌有廣泛的抗菌譜。研究表明，黃酮對雞白痢沙門氏菌、豬霍亂沙門氏桿菌、大腸桿菌等均有抑制效果，并且其對金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌的效果好于紅霉素［6］。黃酮通過影響體內促性腺激素釋放激素（GnRH）、黃體生成素（LH）、阿片肽受體等與生殖相關的激素，提高動物的生殖能力。禽類產蛋高峰期及其后期添加適量黃酮可提高產蛋率，可能與血液中T3、T4水平增高有關［7］。大量研究表明，黃酮還可通過作用于動物的下丘腦—垂體—靶器官生長調節軸，發揮促進動物生長的作用［8］。銀杏葉提取物可明顯抑制丙二醛（MDA）生成和紅細胞溶血作用，并且在清除自由基方面，銀杏葉提取物效率比維生素E還要高，能防止高脂肪的細胞膜被氧化［9］。研究表明，在肉仔雞中添加0.06%～0.12%的銀杏葉提取物，能顯著或極顯著降低血清甘油三酯，并有提高高密度脂蛋白含量，降低血清膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇含量的趨勢［10］。說明銀杏葉提取物在提高機體對脂肪代謝能力方面有較明顯的效果。

銀杏葉具有多種保健功能，但銀杏葉的主要組分是木質纖維素，這部分物質的存在，大大降低了動物對功能物質的吸收利用［11］。 對木質纖維素有較強降解能力的多為絲狀真菌，如瑞氏木霉（Trichoderma reesei） 的纖維素酶能有效地將纖維素轉化為葡萄糖； 康氏木霉 （T.koningii）、擬康氏木霉 （T.pseudokoningii） 和綠色木霉 （T.viride） 等也都具有很強的纖維素降解能力。

為獲得銀杏葉飼料纖維素酶高產菌株，對從古銀杏土壤中分離出的40株真菌進行發酵試驗，旨在為銀杏葉的深加工利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌種：從湖北古銀杏森林公園古銀杏土壤中分離出真菌，共40株，主要為曲霉菌、青霉菌、木霉、毛霉和少數其他種屬菌種。

銀杏葉：由邳州銀杏研究所提供，為2011年秋季收獲，經晾干后粉碎成40目左右的粉末。

1.2 銀杏葉固體培養基的制作、接種和培養

稱取30 g銀杏葉粉末，放入250 mL錐形瓶中，加入一定量的蒸餾水，調節蒸餾水到需要的pH，用玻璃棒攪拌均勻。用無菌培養封口膜封口，放入立式壓力蒸汽滅菌鍋中，121 ℃滅菌30 min后冷卻至室溫。采用相同的方法按需要制作培養基若干。在無菌條件下，用接種針挑取培養2 d的菌種菌體，接種到已滅菌的銀杏葉培養基中，并盡量混合均勻。將各接種后的培養基置于25 ℃隔水式恒溫培養箱中進行培養。

1.3 總纖維素酶活性的測定 參照文獻［12］的方法測定。

2 結果與分析

2.1 曲霉菌發酵銀杏葉產纖維素酶的效果

曲霉菌是食品和飼料中廣泛使用的真菌菌種，尤其是黑曲霉應用最為廣泛，安全性好。目前我國允許使用黑曲霉生產飼料酶制劑，世界上一些國家，如美國已把黑曲霉列為動物安全飼料微生物，允許應用于生產飼用微生物飼料。筆者將從銀杏土壤中分離獲得的真菌用于銀杏葉的發酵，以期具有更好的適應性，獲得更好的生長和產酶能力。使用從土壤中分離得到的曲霉菌對銀杏葉進行發酵，曲霉的產酶能力見表1。

由表1可知， 參與試驗的曲霉產生的纖維素酶活力在0.469～1.881 U/g，其中大部分集中在1.000～1.881 U/g，僅有個別品種產生的纖維素酶的活性低于對照組。

對照組中纖維素酶的活力為0.599 U/g左右，根據這個對照值可以看到，在曲霉屬中，編號為YX201040C的黑曲霉產生的纖維素酶的活性最強，達到了1.881 U/g；其次是編號為YX2010236的黑曲霉，它產生的纖維素酶活力是1.802 U/g；這2個品種曲霉產生的纖維素酶的活性較強，均為對照組中酶活性的3倍以上。

花斑曲霉產生的纖維素酶活力為1.404 U/g左右，焦曲霉產生的纖維素酶活力為1.517 U/g左右，僅次于編號為YX2010236的黑曲霉。

綜上所述，曲霉屬中，除了編號為YX2010027的黑曲霉、棒曲霉以及采色曲霉產生的纖維素酶活力低于對照組外，其余曲霉產生的纖維素酶活性均高于對照組，而且都在1.000～1.881 U/g。

雖然該試驗中曲霉產生的纖維素酶活力最高也達到了1.881 U/g左右，但相對于現有文獻所測得的曲霉產生的酶類450 U/g 左右的活力［13］還是較低的，這可能是由于測定和計算方法不同所致。

2.2 青霉菌發酵銀杏葉產纖維素酶的效果 用從土壤中分離出的14株青霉屬菌種對銀杏葉進行發酵，考察青霉菌株產生的纖維素酶活力，結果如表2所示。

由表2可知，在青霉中，各品種產生的纖維素酶活性在0.300～1.458 U/g。小刺青霉和編號為YX2010324的青霉產生的纖維素酶活力遠低于對照組，均在0.300 U/g左右，其余的青霉品種產生的纖維素酶活力均高于對照組。編號為YX2010201的青霉和編號為YX2010310的爪哇正青霉產生的纖維素酶活力是青霉屬中最高的，均在1.400～1.500 U/g；僅次于這2種青霉的是編號為YX2010227的紫青霉，其產生的纖維素酶活力為1.336 U/g；剩下的青霉品種產生的纖維素酶活力主要在0.600～1.200 U/g。總體而言，青霉產生的纖維素酶的活力比曲霉產生的纖維素酶活力要低，而且各品種間的差異也比曲霉大。因此，曲霉比青霉更適合發酵生產纖維素酶，其產生的纖維素酶活性也相對較大。

2.3 毛霉菌和木霉菌發酵銀杏葉產纖維素酶的效果

用從土壤中分離出的毛霉屬和木霉屬菌株對銀杏葉進行發酵，考察毛霉和木霉屬菌株產生的纖維素酶活力，結果如表3所示。

由表3可知，毛霉菌產生的纖維素酶的活性均高于對照組，編號為YX2010050的多分枝毛霉菌產生的纖維素酶活性為0.995 U/g，編號為YX2010305的多分枝毛霉菌產生的纖維素酶活性為0.638 U/g。可見，編號為YX2010050的多分枝毛霉菌產生的纖維素酶活性比編號為YX2010305的多分枝毛霉菌要高出0.300 U/g。木霉菌產生的纖維素酶活性也都高于對照組，均在0.600～1.700 U/g，品種之間的差距偏大。其中，木霉產生的纖維素酶活性最大，達到了1.620 U/g；其次是康氏木霉和哈茨木霉，它們產生的纖維素酶活性分別為1.308和1.238 U/g 。李氏木霉和綠色木霉產生的纖維素酶活性均高于對照組，但是都低于1.000 U/g。其中，李氏木霉產生的纖維素酶活性為0.906 U/g ，綠色木霉產生的纖維素酶活性為0.744 U/g。

綜上所述，木霉產生的纖維素酶活性最高，甚至比所有青霉都高，在進行相關試驗和生產時，木霉可以作為除一些曲霉以外的選擇。

根據相關文獻，金屬離子是許多菌種生長和繁殖過程中必不可少的物質，尤其對毛霉而言［14］，在該試驗中，毛霉產生的纖維素酶活性雖然都高于對照組，但都未超過1.000 U/g，應該是存在一些因素影響了毛霉產纖維素酶活性。

2.4 其他真菌發酵銀杏葉產纖維素酶的效果

用從土壤中分離出的少量其他種屬菌株對銀杏葉進行發酵，考察它們產生的纖維素酶活性，結果如表4所示。

由表4可知，供試菌種產生的纖維素酶活性均高于對照組，主要集中在0.700～1.600 U/g。其中，編號為YX2010048的鐮刀霉產纖維酶的活性最高，達到了1.561 U/g ，高于大部分菌種；其次是弗基克羅（氏）赤霉，其產生的纖維素酶活性達到了1.411 U/g；鏈格孢菌產生的纖維素酶活性相對較低，只有0.728 U/g；其余菌種產生的纖維素酶活性大多集中在0.900～1.200 U/g，這與大部分菌種都很相似。

3 結論

供試菌種中，曲霉屬中除了編號YX2010027的黑曲霉外，其他黑曲霉產生的纖維素酶的活性相對較高，均在1.000 U/g以上，有些甚至在1.800 U/g以上；其余曲霉中，花斑曲霉和焦曲霉產生的纖維素酶活性與大部分黑曲霉產生的纖維素酶活性相當，而泡盛曲霉、棒曲霉、采色曲霉產生的纖維素酶活性均較低，都與對照組相差不多。

在青霉屬中，編號為YX2010310的爪哇正青霉、編號為YX2010227的紫青霉以及編號YX2010201的青霉產生的纖維素酶活性較高，其余的青霉品種產生的纖維素酶活性大多低于曲霉產生的纖維素酶活性，其中以小刺青霉產生的纖維素酶活性最低，只有0.300 U/g左右，甚至低于對照組。

在毛霉屬和木霉屬中，編號為YX2010050的多分枝毛霉菌和李氏木霉產生的纖維素酶的活性均在0.900～1.000 U/g，差距很??；編號為YX2010305的多分枝毛霉菌和綠色木霉產生的纖維素酶的活性則相對較低，均在0.650 U/g左右，只比對照組稍高一些。

綜上所述，供試各類真菌中，曲霉菌產生的纖維素酶分解銀杏葉中的纖維素能力最強，其次是青霉，再其次是毛霉和木霉。若用于真菌發酵產纖維素酶的生產中，曲霉和青霉是比較優良的菌種，其中編號為YX201040C的黑曲霉和編號為YX2010216的焦曲霉最為合適。

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