畜禽動物油甘油二酯的酶法制備及應用研究進展

祝超智，郭 旗，趙澤鑫，王衛飛，崔文明，許 龍,*，趙改名,*，李 航

（1.河南農業大學食品科學技術學院，河南 鄭州 450002；2.湖北工業大學 發酵工程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430068；3.廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所，廣東 廣州 510610；4.河南恒都食品有限公司，河南 泌陽 463700）

與植物油相比，動物油有著特殊的香味，有助于增進消費者的食欲、促進脂溶性維生素的吸收，特別是牛油，因其口感良好、香味宜人，已經成為了川渝麻辣火鍋的核心主料。自改革開放以來，我國肉類工業飛速發展，肉制品市場規模顯著擴大，取得了舉世矚目的成就。如今，我國已成為世界上肉類年產量最大的國家[1]，2021年我國畜禽肉合計總量為9645萬 t，在新冠疫情階段，我國的肉制品產業仍然保持著強有力的發展勢頭[2]。作為畜禽肉制品加工的副產物，畜禽動物油脂的年產量巨大，2021年全國牛油的年產量約135～180萬 t，豬油約240萬 t。

畜禽動物油脂中的飽和脂肪酸質量分數（牛脂約含54%，豬脂約含42%，羊脂約含54%，精煉鵝油約含33%，雞油約含34.4%）和膽固醇含量（牛脂約含1.53 mg/g，豬脂約含1.10 mg/g，羊脂約含1.10 mg/g）較高，大量研究發現，人體攝入含飽和脂肪酸以及膽固醇高的動物油后，高血脂、高血壓及其他慢性心血管疾病的患病率顯著上升[3]。這些關于動物油的營養健康問題被報道后，動物油脂在食品工業的應用受到了極大限制，大量高品質的畜禽動物油脂只能用做飼料原料，甚至被當作廢料遺棄。如何實現畜禽動物油脂的高值化、合理化利用，成為食品工業中亟待解決的關鍵問題之一。

功能性結構脂質的合成一直以來被視為油脂行業發展重要方向，1,3-甘油二酯（diacylglycerol，DAG）[4]、LML型結構酯[5]、二十碳五烯酸/二十二碳六烯酸富集型甘油三酯（triacylglycerol，TAG）[6]和OPO型結構脂[7]等結構脂產品已經實現工業化生產。與化學催化工藝相比，酶法制備具有反應條件溫和、專一性強、無毒副產物生成等優勢，更能迎合綠色工業的需求[8]。結構脂DAG具有減少內臟脂肪、抑制體質量增加和降低血脂[9]等顯著的營養保健功能，已經被美國食品藥品監督管理局、日本醫師協會和我國國家衛生健康委員會批準為安全食品。近年來關于酶法改性制備DAG的研究大量涌現[10]，其中華南理工大學酶法制備甘油二酯項目率先完成工業化，甘油二酯系列產品已上市流通。借鑒植物油的酶法改性途徑，生產功能性的動物油DAG，是實現動物油高值化利用的一種有效有段。本文綜述了畜禽動物油DAG的酶法制備及應用研究進展，旨在為動物油脂的合理化利用提供一定的理論支撐和技術參考。

1 畜禽動物油的理化特性、營養功能及加工利用現狀

1.1 畜禽動物油的理化特性

可食用畜禽動物油，指的是健康的可食用畜禽經屠宰后，從其衛生安全的脂肪組織經一系列較為成熟的現代化工藝精煉制得的油脂，如牛脂、羊脂、豬脂和雞油等。精煉動物油色澤潔白或黃白，質地均勻細膩，香味濃郁醇厚。與植物油的甘油酯組成類似，畜禽動物油的主要成分也是TAG，脂肪酸組成主要為飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）（例如棕櫚酸、硬脂酸）、單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）（例如油酸）及少量多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）（例如亞油酸、亞麻酸）（表1）[11-13]。因動物油含有大量的SFA，導致其熔點較高（20～50 ℃）（表2），常溫下為固體，有著良好的穩定性。動物油還含有大量植物油所不具備的香味成分，如羥類、醇類、醚類、醛類、酮類、羧酸類、胺類、呋喃類等風味物質，這種特殊的香味可以有效增進食欲。此外，相較于植物油的精煉或加工而言，動物油的氫化及精煉脫臭過程不易產生反式脂肪和3-氯-1,2-丙二醇脂肪酸酯等有害因子[14]。

表1 一般市售動物油脂肪酸組成及質量分數Table 1 Composition and content of fatty acids in common commercial livestock and poultry fats %

表2 常見畜禽動物油脂的理化指標及主要用途Table 2 Physicochemical indices and applications of common livestock and poultry fats

1.2 畜禽動物油的營養功能

自20世紀50年代起，相繼有研究指出，食用飽和脂肪和膽固醇含量高的動物油脂具有誘發心腦血管疾病和癌癥等疾病的潛在風險[50-51]，因此，不飽和脂肪酸含量高的植物油成為了消費者烹調用油的首選。然而，近些年來的最新研究表明，適量地攝入動物油脂并不會給人體健康產生威脅[52]，搭配食用植物油和動物油比僅食用植物油有著更好的營養效果。通常，脂肪的攝入應占總能量攝入的30%，其中10%的脂肪應來源于飽和脂肪[53]。其次，控制促炎因子n-6 PUFA與抗炎因子n-3 PUFA的比例對于促進健康具有重要意義，高比例的n-6/n-3 PUFA被認為是癌癥和冠心病的潛在風險因素[54]。關于n-6/n-3 PUFA的最佳推薦值，國際上尚無統一標準，但基本都控制在4∶1左右。通常情況下，動物油的n-6/n-3 PUFA比值顯著低于植物油，基于此，動物油可能在促進人體健康方面發揮著重要作用。第三，畜禽動物油最大的益處在于其可以為機體提供必需的脂溶性維生素（例如VA、VD、VE、VK），而這些脂溶性維生素的缺乏是夜盲癥和佝僂病等疾病的重要誘因。第四，一些畜禽油脂還具有特殊的生理功效，特別是在調控脂代謝與抵抗氧化損傷等方面；張佰帥等[55]證實，鵝油具有調節小鼠血脂代謝的功能，還能夠有效抵抗脂質過氧化對細胞的損傷，并起到一定的抗動脈粥樣硬化功能；張玉龍[56]發現，鴨油能夠有效緩解油酸誘導的HepG2細胞脂堆積、胰島素抵抗和氧化應激損傷；龍霞等[57]發現，鴨油可能通過激活小鼠肝臟的KELCH樣ECH關聯蛋白1/核因子E2相關因子2信號通路改善D-半乳糖誘導的氧化應激損傷。

1.3 畜禽動物油的加工利用現狀

與植物油的精煉工藝類似，畜禽動物油脂的精煉同樣需要進行脫膠、脫酸、脫色和脫臭等處理，以去除其中的殘留的蛋白質、磷脂、游離脂肪酸、色素和醛類酮類與低級酸類氣味物質，從而得到精煉畜禽動物油。精煉的工藝和標準不同，精煉動物油的成分及其含量也不盡相同，如脂肪酸的含量會在精煉后發生顯著變化[58]。

目前，商品化的烹調用畜禽動物油很少，其應用主要體現在以下幾個方面。首先，牛脂、豬脂和羊脂等畜禽動物油具有良好的可塑性和起酥性以及特殊的香味，多用于烘焙食品、糕點起酥、人造奶油以及火鍋底料等方面。其次，畜禽動物油脂是制備肉味香精的常用原料，常用的制備方法包括可控氧化、氧化-酶解、氧化-美拉德反應和脂肪氧化酶氧化4 種，基于畜禽動物油脂制備的肉味香精香氣飽滿濃郁，同時可以達到減鹽增咸的效果[59]。第三，畜禽動物油被廣泛用于結構脂的加工，如MAG[60]、DAG[61]、人乳脂替代品[62]，這些結構脂通常具有特定的理化性質、特殊的生理活性和功能。第四，畜禽動物油可以通過結晶法、乳化法和酯化法制備液化動物油，進而有效促進畜禽動物油脂在食品工業中的應用范圍[63]。第五，畜禽動物油可以用于制備粉末化動物油，常用的制備方法包括固化粉碎法、噴霧冷卻法、分子微膠囊法、吸附法、噴霧干燥法，這些粉末動物油脂具有受溫度影響小、分散性和水溶性好等特點，有助于改善食品的品質，延長保質期[64]。第六，畜禽動物油脂還可以用于開發低膽固醇保健油脂，常用的方法包括β-環糊精包埋法[65-66]和中草藥精煉法[67]等，這些低膽固醇動物油可用于曲奇餅干等酥皮類點心的制作，其安全性顯著高于植物黃油曲奇餅干[68]。第七，畜禽動物油被廣泛應用于制備生物柴油，制備方法包括化學法和生物酶法兩種途徑[69]，常用的底物包括牛脂[70]、豬脂[71]、雞油[72]、鴨油[73]和羊脂[74]等，與化石燃料相比，此種方法制備的生物柴油具有可再生、無毒、生物可降解以及潤滑特性好等優勢。第八，畜禽動物油在日化行業如肥皂、甘油、潤滑油和皮革的加工中也應用廣泛[75]。用于制備生物柴油和日化行業的畜禽動物油通常來源于一些衛生指標相對較低或煉制工藝比較粗糙的動物油。

2 畜禽動物油DAG

2.1 畜禽動物油DAG的結構特征

DAG的甘油骨架上僅有兩個羥基與脂肪酸結合的結構脂。DAG是天然的油脂成分，大多為動植物甘油酯在體內轉化的中間體，其在不同動植物中的比例也不盡相同，而且質量分數都很低，一般不超過10%，不易于分離提純。禽畜動物油DAG具備DAG類油脂的共性特征，可分為sn-1,2-DAG、sn-2,3-DAG和sn-1,3-DAG 3 種立體異構體（圖1）。sn-1,3-DAG呈V形構象，而sn-1,2-DAG呈發夾狀構象。sn-1,3-DAG在熱力學上比sn-1,2(2,3)-DAG更加穩定，所以天然的DAG中sn-1,3 DAG比sn-1,2 DAG的含量高，二者的比例接近2∶1[76]。由于DAG分子結構上有一個裸露的羥基（可作為氫鍵供體，而TAG無氫鍵供體），其熔點比相同脂肪酸組成的TAG高（分子間形成氫鍵所致）。

圖1 DAG的分子結構Fig.1 Molecular structure of DAG

據報道，動物油DAG的熔點比其對應的TAG高約5 ℃，且其熔點會隨著DAG純度的升高而升高[77]。此外，動物油DAG的氧化穩定性與DAG的含量呈負相關[78-79]，其黏度低于其對應的TAG[35]。與動物油TAG相比，其對應的DAG晶體顆粒小且分布均勻，晶體網絡更加致密，晶型分析顯示，動物油TAG主要為β型，因此，口感上表現為粗糙易碎，其對應的DAG表現為β和β’兩種晶型共存，且以β’晶型為主，因此口感上較為光滑細膩[77]。

DAG結構的特異性還使其具備了特殊的生理活性。與TAG不同，1,3-DAG經過胰脂肪酶水解后的產物為sn-1(3) MAG、甘油和游離脂肪酸，缺少了TAG在體內再合成的關鍵底物sn-2 MAG（圖2）。因此，攝入1,3-DAG可以增加人體的脂肪代謝，減少TAG的再合成，進而降低血脂水平[80]。除了可以有效預防肥胖外，1,3-DAG還具有促進心血管健康、調節葡萄糖代謝和增加骨密度等功效[81]。

圖2 TAG（A）和DAG（B）的代謝途徑Fig.2 Metabolic pathways of triacylglycerol (A) and DAG (B)

2.2 畜禽動物油DAG的主要用途

DAG在食品中的應用主要包含以下4 個方面：第一，可以在蛋黃醬和冰淇淋制作中用作乳化劑；第二，可以在人造黃油和起酥油中用作結晶改良劑；第三，可以在肉制品加工過程中作為脂肪替代品；第四，可以代替TAG用作烹調用油。對于畜禽動物油DAG在食品工業中的應用，豬脂DAG和鴨油DAG最為廣泛。作為良好的乳化劑，豬脂DAG常被用于乳化肉制品的加工[82]，采用豬脂DAG作為脂肪替代品制備的肉糜具有更好的保水性和彈性，質地更加緊實，不易出現脂肪分離現象[61]。豬脂DAG與肌原纖維蛋白形成的復合膠體比豬脂TAG與其形成的復合膠體具有更高的滲透力和持水性，結構也更加致密有序[83-85]。采用鴨油DAG煎炸的牛肉餅可以顯著降低失水率，增加肉質嫩度[35]，鴨油DAG還具有一定的抑菌防腐作用，其與殼聚糖的混合物可以有效延緩肉糜的pH值升高、抑制微生物繁殖和脂質氧化，進而延長肉糜的保鮮期[86-87]，鴨油DAG可以顯著提高脫脂奶粉的穩定性，增加香味[88]。

此外，鴨油DAG和鵝油DAG還具有顯著的生理活性，特別是1,3-DAG。第一，同植物油DAG一樣，畜禽動物油DAG同樣具有顯著的減肥效果。Wang Baowei[89]和孫宇[90]等發現，鴨油DAG（DAG質量分數分別為94%、86%）可以顯著刺激高脂飲食大鼠的脂質代謝，減少脂堆積，從而起到抑制肥胖的效果。第二，畜禽動物油DAG還可以作為具有潛在價值的腸道炎癥健康修復劑。劉亞楠等[91]發現，鴨油DAG（質量分數＞85%）與VD3聯合使用對結腸炎大鼠的結腸腸道發育具有顯著的促進作用；王茜等[92]發現，鴨油DAG（質量分數＞85%）與殼聚糖聯合使用可以有效促進潰瘍性結腸炎小鼠的結腸組織發育；叢紅霞等[93]發現，鴨油DAG（質量分數＞85%）與VK1聯合使用可以有效促進潰瘍性結腸炎小鼠腸道組織的修復發育；徐慧心等[94]證實，鵝油DAG（質量分數＞92.57%）和天蠶素抗菌肽聯合使用同樣可以有效治療小鼠潰瘍性結腸炎；謝玉娥等[95]發現，鵝油DAG（質量分數＞90%）有助于優化盲腸微生物的菌群結構，進而調整腸道微生態失調。第三，畜禽動物油DAG在促進骨骼發育方面也表現出一定的效果。劉亞楠等[96]發現，鴨油DAG（質量分數＞90%）與VD3聯合使用能夠顯著提高脛骨的骨密度和骨強度，降低骨源性堿性磷酸酶活性，從而促進脛骨發育。

3 畜禽動物油DAG的酶法制備

3.1 用于DAG制備的酶制劑

DAG的制備方法主要有化學法和生物酶法兩種。其中，化學法大多需要高溫、強酸強堿、高壓等條件，會產生較多有害物質，反應可控性差。相較之下，生物酶法反應條件溫和、專一性強、副產物少[97]。作為制備DAG的高效生物催化劑，脂肪酶來源廣泛，在動植物和微生物體內均普遍存在。動植物來源的脂肪酶大多存在催化活性單一、產量低、穩定性差、提取成本高等缺點[98]，因此，目前國內外常采用微生物來源的脂肪酶制備DAG[85]。常見的脂肪酶生產菌株包括產堿假單胞菌（Pseudomonas alcaligenes）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、莓實假單胞菌（Pseudomonas fragi）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、尼氏芽孢桿菌（Bacillus nealsonii）、球形馬拉色菌（Malassezia globosa）、擴展青霉（Penicillium expansum）、木霉（Trichoderma）、產黃青霉（Penicillium chrysogenum）、黑曲霉（Aspergillus niger）、米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）、疏棉狀嗜熱霉（Thermomyces lanuginosus）和南極假絲酵母（Candida antarctic）等[99-104]。因游離酶存在難回收、易失活等缺點，所以工業生產中常需要對脂肪酶進行固定化處理，這些固定化的載體大多為樹脂或硅膠等材料。固定化的脂肪酶具有良好的穩定性和環境耐受性，并且易于回收，適用于連續化的工業生產[98]。目前，廣泛應用于DAG制備的3 種商品化固定化脂肪酶是由丹麥諾維信公司生產的Novozym 435（來源于南極假絲酵母）、Lipozyme TL IM（來源于疏棉狀嗜熱霉）和Lipozyme RM IM（來源于米黑根毛霉）。

3.2 酶法制備禽畜動物油DAG的工藝

酶法合成DAG的途徑主要包括甘油解、酯化、部分水解和酯交換4 種制備工藝（圖3），每一種工藝對脂肪酶催化性質的要求都不盡相同。

圖3 DAG的酶法合成途徑Fig.3 Enzymatic synthesis pathway of DAG

3.2.1 酶法甘油解反應

第1種常用的DAG制備方法是甘油解反應，該反應是在相對溫和的反應溫度下通過脂肪酶催化TAG的酰基轉移至甘油而合成DAG的一種途徑。酶法制備DAG反應具有催化效率高、產物純度高、副反應少和環境污染小等優點，還可以有效降低縮水甘油酯的產生[105]。然而，在甘油解反應體系中，底物黏度較大，所需反應溫度較高，因此脂肪酶的活性會受到一定程度的影響，有時還需要加入溶劑改善體系黏度，然而溶劑的引入會導致產物純化繁瑣。

Yamane[106]和Kang[107]等以氫化牛脂為底物，分別以假單胞菌脂肪酶（EC 3.1.1.3）、Psesudomonas脂肪酶（EC 3.1.1.3）為催化劑，利用甘油解反應制備了氫化牛脂DAG，在最優反應條件下，氫化牛脂DAG的得率分別達到90%（其中1,3-DAG的得率達到95%）和71%。Diao Xiaoqin等[82]以豬脂為底物、Lipozyme RM IM為催化劑，利用甘油解反應制備了豬脂DAG，在最優反應條件下，豬脂DAG的得率達到61.76%，產物經分子蒸餾純化后，DAG質量分數高達82.03%。趙欣欣等[108]以豬脂為底物，Lipozyme RM IM為催化劑，利用甘油解反應制備了豬脂DAG，研究發現，超聲波輔助處理可以顯著縮短甘油解反應時間，在最佳超聲波輔助條件下，DAG的得率可達46.91%。Cheong[109]和萬倪彤[110]等以為豬脂底物、Novozym 435為催化劑，利用甘油解反應制備了DAG，在最優反應條件下，DAG的得率分別達到48%和46%。Miklos等[61]同樣以豬脂為底物，Novozym 435為催化劑，利用甘油解反應制備了高純度DAG，產物經分子蒸餾純化后，DAG的質量分數高于94%。綜上，甘油解反應DAG產物得率約為40%～90%，產物進一步經分子蒸餾純化后，1,3-DAG質量分數為52%～86%。

3.2.2 酶法酯化反應

第2種常用的DAG制備方法是酯化反應，該反應是以甘油或MAG與游離脂肪酸為底物，在脂肪酶的催化下合成DAG的一種途徑，具有反應時間短和產物純度高等優點，因此，高純度DAG（質量分數80%）的工業化生產大多通過sn-1,3位選擇性強的脂肪酶Lipozyme RM IM催化酯化來實現。然而，直接酯化法的生產成本要比甘油解法的成本高出許多。王寶維等[111-112]分別以鵝油脂肪酸、鴨油脂肪酸和甘油為底物，以固定化CALB為催化劑，以底物比、酶加量、反應時間和溫度為考察因素，通過響應面法對鵝油DAG和鴨油DAG的制備工藝進行了優化，在最佳工藝條件下，鵝油DAG和鴨油DAG的得率分別達到92.57%和93.92%。韓海娜[113]以鵝油脂肪酸和甘油為底物，以Novozym 435為催化劑，在最佳工藝條件下（溫度46 ℃、時間9.2 h、鵝油脂肪酸∶甘油＝1.12（質量比）、酶添加量3.03%），鵝油DAG的得率達到92.57%。綜上，酯化反應的DAG產物得率達到90%以上。

3.2.3 部分水解反應

第3種常用的DAG制備方法是部分水解反應，該反應是利用脂肪酶催化TAG生成DAG、MAG和游離脂肪酸的途徑，進而通過分子蒸餾除去水分、MAG、TAG和游離脂肪酸后即可獲得高純度DAG，常用脂肪酶Lipozyme RM IM作為催化劑，該方法操作簡單，且成本較低。孫敏甜[114]以雞油為底物，以脂肪酶Lvk-01為催化劑，通過部分水解反應制備了雞油DAG，當酶加量為20 U/g、蒸餾水添加量為15%時，在40 ℃條件下反應2.5 h后，產物中DAG的質量分數達到41.99%（表3）。

表3 酶法改性制備畜禽動物油DAGTable 3 Recent studies on enzymatic production of DAG from livestock and poultry fats

3.2.4 酶法酯交換反應

第4種常用的DAG制備方法是酯交換反應，該反應是以TAG和MAG為底物，在脂肪酶的催化下合成DAG的一種途徑，常用脂肪酶Lipozyme TL IM作為催化劑。這種方法主要用于植物油DAG的制備，目前鮮有報道采用此途徑合成動物油DAG，由于MAG是一種價格相對比較昂貴的底物，因此，酯交換反應并不具備較好的工業化前景。

3.2.5 其他工藝路徑

第5種常用的DAG制備方法是脂肪酶介導的多步級聯反應，該方法需要先將油脂通過醇解反應制成脂肪酸乙酯，進而再利用脂肪酶催化脂肪酸乙酯和甘油合成DAG，常用脂肪酶Lipozyme RM IM作為催化劑。該方法與直接酯化法類似，操作簡單，產物得率高。曲可心等[115]先利用化學法將牛脂與乙醇經過乙醇解反應制得牛脂乙酯，進而以牛脂乙酯和甘油為底物，在脂肪酶Lipozyme RM IM的催化下制備了牛脂sn-1,3 DAG，在最佳反應條件下，sn-1,3 DAG的得率達到72.5%，產物經弗羅里硅土提純后，sn-1,3 DAG質量分數為90.79%。

部分水解反應制備DAG，該方法是利用脂肪酶催化TAG生成DAG、MAG和游離脂肪酸，通過分子蒸餾除去水分、MAG、TAG和游離脂肪酸后即可獲得高純度DAG，常用脂肪酶Lipozyme RM IM作為催化劑，該方法操作簡單，且成本較低。

3.3 酶法改性制備禽畜動物油DAG與植物油DAG的對比

通常，畜禽動物油的飽和脂肪酸含量（表1）顯著高于植物油的含量，而飽和脂肪酸含量與熔點呈正相關[117]，因此，畜禽動物油的熔點（表2）遠高于植物油，室溫下呈固態。一方面，固態底物傳質效率低；另一方面，脂肪酶為界面酶，固態底物接觸面積小，因此，基于固態動物油為底物、脂肪酶為催化劑的反應體系難以在低溫條件下實現高效的酶法催化，升高反應體系溫度使動物油由固態轉化為液態成為了制備動物油DAG的先決條件。然而，多數脂肪酶的最適反應溫度低于動物油（特別是牛脂、羊脂和豬脂）的熔點，因此，與植物油DAG的酶法制備不同，制備動物油DAG時尤其要選擇溫度耐受性高的脂肪酶，例如Novozyme 435、Lipozyme TL IM等。此外，在溶劑體系中（例如正己烷、叔丁醇等）開展動物油DAG的酶法制備也是切實可行的方案，溶劑的引入有助于固態動物油的溶解，從而降低反應體系的溫度。

4 結語

畜禽動物油脂的高值化利用一直是困擾畜禽產品加工企業的一大難題，借鑒植物油DAG的產業化加工途徑，利用生物酶法制備高附加值的畜禽動物油DAG為實現畜禽動物油脂的高值化利用提供了一個有價值的產業化方向。改性后的畜禽動物油DAG不但可以作為食品工業中優良的乳化劑和脂肪替代品，還可以作為烹調用油使用，此外，一些畜禽動物油DAG還具有特殊的生理功效，如控制肥胖、改善腸道炎癥和促進骨骼發育等，因此，這些畜禽動物油DAG甚至有潛力成為保健品行業的新型高端產品。隨著畜禽動物油DAG生物酶法加工途徑的日漸成熟，其高值化利用必將為畜禽加工企業創收添益。