電化學發光在真菌毒素檢測中的研究進展

王 丹，楊武英，王文君

（江西農業大學食品科學與工程學院，江西省天然產物與功能食品重點實驗室，江西 南昌 330045）

真菌毒素是由真菌產生的有毒次級代謝產物，目前已發現400余種，常見的有黃曲霉毒素（aflatoxins，AF）、赭曲霉毒素（ochratoxins，OT）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）和玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）等[1]。真菌毒素對動物和人體有強烈的急、慢性毒性，例如，痕量的AFB1即有明顯的肝毒性和致癌性，屬于I類致癌物[2]。真菌毒素的檢測方法主要有色譜、質譜及二者聯用，酶聯免疫吸附法，免疫層析，熒光分析和電化學傳感等[3-5]，較為多元化，每種方法有各自的優勢和劣勢，互為補充。例如，色譜-質譜聯用技術檢測準確度高，但是在設備普及度、檢測速度和樣品前處理等方面不具備優勢[3]，一般作為確證方法；免疫分析類方法檢測準確度不及色譜-質譜法，但在設備普及度、檢測速度和樣品前處理等方面展現出巨大優勢[3-5]，適合于大量樣本的快速篩查。

電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）現象在20世紀20年代被發現，受限于科研條件，直到20世紀60年代，才由Bard團隊建立了初步的理論體系[6]。自此，ECL的理論基礎和應用研究快速展開，特別是進入21世紀后，研究勢頭迅猛。截至2023年1月，在Web of Science上以“electrogenerated chemiluminescence”聯合（或者）“electrochemiluminescence”為主題搜索，共檢索到10639 條文獻條目，從2002年開始，相關研究報道數量逐年遞增（圖1）。ECL已在體外診斷領域商業化應用20余年[7]，在食品安全領域的研究尚處于起步階段。

圖1 與ECL有關的出版物數量與年份之間的關系Fig.1 Number of literature related to ECL between 1967 and 2022

ECL是一種由電化學反應驅動的化學發光，與傳統化學發光（chemiluminescence，CL）和光致發光（photoluminescence，PL）的區別在于發光體發光所吸收的能量來源不同[8]。CL是發光體吸收化學反應（通常為氧化還原）釋放的能量，完成從基態到激發態的躍遷后發光，缺點在于隨著化學反應的持續，發光體被快速消耗，因此發光不穩定，表現為間斷的閃爍型發光[9]；PL是發光體從外加光源中吸收能量，實現從基態到激發態的躍遷后發光，包括磷光和熒光，缺點在于有些發光體存在光致漂白效應，且激發光對測試信號有干擾[8]。ECL是通過在工作電極表面施加一定電位，發光體在電極表面經氧化還原生成高反應活性物種，進而躍遷至激發態，在返回基態過程中發光。當停止施加電位后，發光即停止，因此，ECL過程易于控制[8,10]。與CL相比，ECL中發光體基本不被消耗，光信號強而穩定，且發光時間較長，便于測定。與PL相比，ECL信號的采集不受外加光源干擾。

隨著現代食品安全的發展，各國對真菌毒素的檢測標準越發嚴格，常規檢測方法在靈敏度、檢測速度等方面的不足逐漸顯現。鑒于ECL的技術優勢，深入開展其在食品安全檢測中的理論及應用研究具有非常重要的意義。本文重點圍繞ECL在真菌毒素檢測中的應用研究展開綜述，并總結ECL在食品安全檢測中存在的主要問題和對策。

1 ECL機制

1.1 湮滅型ECL

湮滅途徑是指在電極表面施加一定的氧化還原電位，發光體被分別氧化和還原為自由基陽離子和自由基陰離子，這些自由基在電極表面相遇后發生電荷轉移，生成激發態后發光（圖2）[7,11-12]。該途徑產生的自由基陽離子和陰離子需要維持一定的時間，才能在電極表面相遇并完成電荷轉移過程[11]，因此，湮滅型ECL主要在無氧的非質子溶劑中進行，對需要在水相中完成的檢測體系而言，效率較低[7]。

圖2 ECL自由基湮滅途徑原理示意圖[11]Fig.2 Schematic illustration of ECL annihilation pathways of free radicals[11]

1.2 共反應劑型ECL

陽極ECL

陰極ECL

共反應劑途徑的優勢在于，發光體和共反應劑的氧化或還原同步進行，兩者的氧化或還原產物可即時發生反應生成激發態，克服了湮滅型ECL在水相中效率低下的問題，為ECL在生物分析中的應用提供了必要條件[14-15]。

2 ECL體系組成

2.1 發光體

發光體是ECL的核心元件，按照物質形態不同，主要包括有機物分子、金屬配合物和納米材料[12,16]。有機分子發光體主要有酰肼類和多環芳烴類化合物。酰肼類發光體以魯米諾（luminol，Lum）及其衍生物為代表，其ECL過程與活性氧相關[16]。多環芳烴類，如9,10-二苯基蒽（9,10-diphenylanthracene，DPA）、紅熒烯（rubrene，RUB）和3,4,9,10-苝四甲酸二酐（3,4,9,10-perylenetetracarboxylic acid，PTCA），是常用的有機分子發光體[7,11,16]。金屬配合物類研究較多的是鉑族金屬配合物，如釕（Ru）、銥（Ir）、鉑（Pt）和鋨（Os）配合物[16]，其中Ru配合物應用最為廣泛，如商業化應用20余年的。此外，Ir配合物具有較好的光譜可調性，也受到廣泛關注[16]。

2002年，Bard團隊首次觀察到硅基量子點（quantum dots，QDs）的ECL現象[17]，隨著發光機制的研究深入，越來越多的具有ECL性能的納米材料被發現。II-VI族半導體納米晶（如CdSe QDs、CdTe@CdS QDs）、類石墨氮化碳（g-C3N4）、金屬納米團簇和聚合物點等[16,18]，是近年來研究較多的發光體。目前，納米材料的ECL現象主要歸因于表面缺陷效應和帶隙效應。由表面缺陷效應產生的ECL光譜相比PL光譜有明顯紅移，且半峰寬明顯大于PL光譜[14]，采用元素或分子摻雜改變納米材料表面態可對其光譜特征進行調控[14]；將納米材料表面鈍化，如核殼結構的ZnS@CdSe QDs，可實現帶隙效應ECL，其光譜特征與PL光譜基本一致，主要受納米材料尺寸影響[14,16,18]。

2.2 共反應劑

共反應劑是指易被電化學氧化還原生成具有較高氧化還原能態自由基，從而促進發光體激發態形成的物種[11,14]。與湮滅型ECL相比，共反應劑型ECL中共反應劑和發光體的氧化或還原幾乎同時發生，有利于發光體激發態在水相中生成[11]。根據氧化還原性質不同，有陽極共反應劑和陰極共反應劑。陽極共反應劑有、亞硫酸鹽和有機胺類化合物。有機胺化合物TPrA、TEA和2-N-二丁氨基乙醇（2-(butylamino)ethanol，DBAE）[7,19-21]，是目前較為常用的陽極共反應劑。陰極共反應劑主要有、H2O2和溶解氧[14,22-24]。上述共反應劑均為小分子化合物，主要通過擴散、吸附行為參與ECL過程，對濃度依賴性較高。高濃度的共反應劑對基于生物反應的ECL體系有不利影響，同時有些共反應劑自身存在微弱發光，易產生背景干擾[14]。針對這些問題，目前主要有如下改進策略：1）將共反應劑和發光體鍵合，縮短發光體與共反應劑之間的電子傳輸距離，減少共反應劑自由基在向發光體擴散過程中因弛豫效應導致的能量損失，從而降低共反應劑的用量[25]。2）開發納米材料型共反應劑，如碳點、氮化硼QDs、g-C3N4和氮摻雜石墨烯QDs（NGQDs）等被報道可作為陽極共反應劑[26-30]。You Tianyan團隊將NGQDs與@SiO2共價偶聯，構建了一種自增強型發光體NGQDs-Ru@SiO2[30-33]，其中NGQDs充當內源性共反應劑。3）開發免共反應劑ECL體系。Lum和Ru(bpy)2(mcpbpy)2+之間存在能量共振轉移（resonance energy transfer，RET）效應，Yuan Ruo團隊將兩者共價偶聯，形成分子內能量轉移路徑，極大提高了RET效率和ECL信號強度，避免了共反應劑的使用[34]。Zou Guizheng團隊通過電化學氧化納米粒子注入價帶空穴，利用該價帶空穴與納米粒子的內源性導帶電子之間的復合反應，產生陽極ECL信號，實現了免共反應劑ECL[35]。

2.3 共反應促進劑和發光猝滅劑

共反應促進劑是一類能促進共反應劑分解成活性自由基或提升界面電化學行為，進而增強ECL信號的物種，主要是一些對共反應劑有催化活性的有機、無機分子或納米材料[36]。金屬氧化物、金屬納米顆粒和Hemin等是常用的陰極ECL共反應促進劑[24,37-40]。Khoshfetrat[38]和LV Xiaohui等[41]分別構建了發光體Lum-AgNPs，其中AgNPs作為共反應促進劑催化H2O2產生活性自由基；Xia Mengke等[42]構建了發光體Lum-PdNPs，其中PdNPs作為共反應促進劑催化O2還原產生超氧陰離子自由基和羥自由基。陽極ECL共反應促進劑種類較少，目前報道的主要是TiO2基和銅基納米材料，能分別降低TPrA和TEA的氧化電位，促進相應自由基的生成[28,36,39,43]。

光的猝滅是構建ECL分析方法時較為常用的一類模式，這里我們將對ECL有猝滅作用的物質統稱為猝滅劑，常見的猝滅機制有能量轉移、電子轉移和內濾效應[31,44-47]。二茂鐵（ferrocene，Fc）及其衍生物和亞甲基藍（methylene blue，MB）對Ru配合物和g-C3N4等發光體有顯著猝滅效應，目前主要認為是通過電子轉移或/和能量轉移途徑猝滅ECL[31,46]。You Tianyan團隊以雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）為分子標尺，研究了Fc對猝滅的距離效應。該團隊發現，當Fc與的距離小于8 nm時，Fc能高效猝滅ECL；當距離大于12 nm時，Fc+與激發態的能量轉移路徑受阻，此時Fc充當工作電極和對電極之間的氧化還原介體，提高電子傳輸速率，反而增強了的ECL[31]。

3 ECL在真菌毒素檢測中的研究進展

3.1 ECL適配體傳感器在真菌毒素檢測中的研究

適配體（aptamer，Apt）是一類能和細胞、病毒、蛋白質和小分子化合物等靶標特異性結合的寡核苷酸序列[48]，一般來說，凡涉及抗體的領域，幾乎都可用Apt替代。因此，Apt又被稱為“化學抗體”。在分析化學中，Apt的優勢主要有：1）相對于抗體，Apt的制備成本低、合成簡單，應用普及性更高[48]；2）Apt易兼容各種基于核酸雜交的信號放大系統[49]，如滾環擴增（rolling circle amplification，RCA）、雜交鏈式反應（hybridization chain reaction，HCR）、DNA步行器和自組裝納米結構體[22,50-53]，這些信號放大系統，或通過負載發光體或共反應促進劑增強ECL信號[37,50]，或用于錨定猝滅劑從而控制檢測前的信號關閉狀態[44]；3）相對于抗體，Apt的化學穩定性更高[48]。目前，能特異性結合OTA、AFB1、AFM1、ZEN和DON的Apt均有報道[54]。然而，相比抗體，Apt距商業化應用還有一定距離，主要原因有：1）特異性Apt的篩選難度大[48]；2）相對抗體，Apt與小分子靶標的親和力較低，且對環境因素（如樣品基質）較為敏感[55]。盡管如此，在科學研究中，ECL-Apt傳感器近年來仍發展迅猛。根據構建原理，本文將ECL-Apt傳感器歸納為“Turn on”“Turn down”和比率型（表1）。

表1 ECL Apt傳感器在真菌毒素檢測中的研究Table 1 Published studies on ECL Apt sensors in detection of mycotoxins

“Turn on”型ECL傳感器，是指在未加檢測物時，ECL信號處于關閉或半關閉狀態，在檢測物引發下，ECL信號產生或恢復。是一種性質和相似的發光體，在水溶液中帶正電，可作為ECL指示劑插入至dsDNA溝槽中[50,56]。Lin Zhenyu團隊將互補鏈DNA（cDNA）和Apt固定于電極，加入待測物OTA后，Apt從電極上釋放，隨后cDNA與后加入的鎖式探針結合，啟動RCA反應；反應結束后，向電極表面滴加，帶正電的發光體插入至dsDNA溝槽，隨后在共反應劑TPrA存在下，產生強烈的ECL信號[19,50]。該團隊又利用的電荷性質，建立了一種均相、非標記的檢測方法。簡言之，在均相體系下，插入至Apt/cDNA復合體中，加入待測物OTA后，Apt與OTA結合致使cDNA解離，隨后在核酸外切酶RecJf作用下，單鏈DNA被水解，OTA和脫落，脫落的OTA又參與到下一個循環反應中；將反應后的均相體系加入到表面負電的ITO電極上，游離的與電極通過靜電作用結合，其余物質被清洗去除，從而獲得較強的ECL信號[56]。

另一種是發光恢復型，先將發光體和猝滅劑共同錨定在電極表面，利用待測物與Apt的特異性結合，引發猝滅劑標記的核酸探針從電極表面釋放，發光得以恢復。Yuan Ruo團隊基于靶標OTA對Apt/DNAzyme納米結構的自動解組裝作用，提出了一種靈敏的ECL傳感策略[22]。負載hemin的自組裝Apt/DNAzyme納米結構對O2/S2-發光體系有顯著的猝滅效應，在OTA和核酸外切酶RecJf作用下，該納米結構解組裝，同時OTA被重復利用，導致更多的納米結構解組裝，ECL得以恢復，從而實現對OTA的檢測。Wei Min等[44]以CdS QDs為能量供體，花菁染料Cy5為能量受體，基于RET原理構建了一種檢測OTA的傳感器。如圖3所示，先將Cy5標記的DNA、OTA-Apt和DNA步行器混合液與CdS QDs修飾電極孵育，Cy5和CdS QDs之間存在RET效應，此時信號關閉；Apt與OTA結合后從DNA步行器上解離，隨后暴露的DNA步行器3’端與Cy5-DNA雜交，在切刻內切酶Nb.BbvCI的幫助下，Cy5-DNA被切割，導致Cy5從電極表面脫落，ECL信號恢復。Zhong Xia[24]、Zeng Weijia[57]和Li Zongbing[60]等分別利用Fc對ECL的猝滅效應，將發光體與Fc分別標記的DNA探針通過雜交作用形成復合體，在待測物和酶助力的DNA步行器共同作用下，Fc從復合體中釋放，ECL信號恢復。

圖3 基于酶助力DNA步行器的ECL Apt傳感器原理示意圖[44]Fig.3 Schematic illustration of the working principle of ECL Apt sensor based on nicking endonuclease-powered DNA walking machine[44]

“Turn down”型傳感器，通常是先將發光體修飾在電極表面，加入待測物后，引發ECL猝滅。發光猝滅的原因可以是待測物結合產生的位阻效應[63-64]，可以是待測物與Apt結合后使發光體[23,38,52]或能量受體從傳感界面脫落[61]，也可以是引入更多的猝滅劑或提高猝滅劑的猝滅效率[34,46]。將發光體和Apt修飾在電極上，待測物與Apt結合后能阻礙發光體和共反應劑接觸、降低傳感界面的電子傳輸速率從而猝滅ECL是一種簡便可行的策略。Luo Lijun[30]、Jia Mingxuan[64]和Tian Chunyuan[63]等分別將Apt標記在發光體NGQDs-Ru@SiO2、CdSe@CdS QDs和Gd(OH)3納米晶修飾的電極上，實現了對真菌毒素的直接檢測。Lu Yan等[62]為提高傳感界面對待測物的敏感性，在修飾發光體和Apt之前，先通過電沉積手段在電極表面制備聚(6-羧基吲哚)和納米金花復合物（PICA/F-Au），用于提高電極的比表面積和導電性，從而構造對待測物較為敏感的傳感界面。該策略的特點是檢測快速和成本低，然而，真菌毒素是小分子，通過位阻效應猝滅ECL的效率較低，檢測方法的分辨率和檢測范圍通常不理想。

另一種策略是利用cDNA和發光體標記的Apt修飾電極，加入待測物后，發光體標記的Apt解離，ECL信號降低。Wang Zhouping等[23]采用cDNA與N-(4-氨丁基)-N-乙基異魯米諾（N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol，ABEI）標記的Apt形成dsDNA，加入OTA后，ABEI標記的Apt從電極上釋放，ECL信號降低。該方法中，ABEI是單分子標記，ECL信號較弱。Khoshfetrat等[38]構建了Lum功能化AgNPs修飾的氧化石墨烯（Lum-AgNPs-GO）發光體，其中GO提高了Lum和AgNPs的負載量，AgNPs為共反應促進劑，極大提高了Lum的發光強度。Ge Junjun等[52]采用自組裝DNA納米管負載，加入待測物AFB1后，AFB1與Apt結合導致DNA納米管解體，發光體從電極表面釋放，ECL信號顯著降低。

此外，通過Apt與靶標結合從而向ECL體系中引入或去除能量轉移或電子轉移受體，也是一種常見策略。Yuan Ruo團隊[34]以Lum-Ru為發光體，在DNA聚合酶和切刻內切酶輔助下，同時基于靶標引發的循環放大策略向發光體修飾的電極表面引入大量Fc標記的核酸探針，從而高效猝滅Lum-Ru的發光，實現了對AFM1的靈敏檢測。該方法無需共反應劑，避免了其對分析體系的不利影響。Tian Dongyan等[46]基于Fc對發光體g-C3N4的猝滅效應設計了一種頗為簡便的傳感器，首先利用NH2-Apt與羧基化的g-C3N4共價偶聯，隨后將其修飾在電極表面，因Apt的3’端標記了Fc，且Apt為線性構型，此時，Fc與g-C3N4的距離較遠（＞10 nm），Fc的猝滅效率較低；加入待測物與Apt結合后，Apt折疊，拉進了Fc與g-C3N4的距離，猝滅效率提升。Gao Jingwen等[61]以CdTe QDs為能量供體（標記cDNA）、Cy5為能量受體（標記Apt），基于能量轉移構建了發光強度較高的傳感界面（此時CdTe QDs與Cy5的距離約4 nm），Cy5-Apt與待測物結合后從電極表面釋放，ECL信號降低。

雙信號響應型傳感器，是指在檢測某一靶標時，傳感器有兩種信號輸出，這兩種信號反映的是同一生物反應過程，其中一種信號可作為另一種信號響應的參考，用于研判檢測方法的測試準確度[31,33]。如果兩種信號響應與待測物含量具有較好的相關性，建立兩種信號的比值與待測物含量的化學計量關系，即為比率型傳感器[66]。雙信號/比率型傳感器能在一定程度上減少復雜環境對分析方法的干擾，提高定量的準確性[66-67]。目前，該類型的ECL傳感器在真菌毒素檢測研究中尚處于起步階段。You Tianyan團隊[33]以發光體NGQDs@SiO2標記cDNA、Au NPs修飾磁珠（Au@MB）標記Apt，構建了一個均相檢測體系，該體系中，用磁性電極回收磁珠，測試ECL信號，同時采用熒光儀測試上清液中剩余發光體的熒光信號，分別建立ECL信號和PL信號與待測物濃度的響應關系，但研究者未對兩種方法的相關性做進一步討論。隨后，該團隊基于Fc與發光體NGQDs-Ru@SiO2的距離效應，建立了ECL/EC雙信號響應傳感器[31]。研究發現，當AFB1質量濃度在1 pg/mL～300 ng/mL時，ECL/EC信號比值較為恒定（變異系數小于5.9%），兩種信號有較好的相關性。該團隊又基于該發光體構建了雙猝滅-比率型ECL傳感器[32]。如圖4所示，將cDNA吸附于發光體修飾的電極上，加入結合ZEN的Apt（ZEN binding aptamer，ZBA）與之雜交，隨后加入MB，MB插入至dsDNA中；加入待測物ZEN后，ZEN與ZBA結合致使MB釋放。該研究中，MB被證實對發光體（Ru@SiO2）和共反應劑（NCQDs）存在雙重猝滅效應，MB的釋放使ECL信號顯著恢復，因此ZEN含量與ECL信號存在正相關性；此外，MB的電化學（EC）信號與ZEN濃度有負相關性。由此建立的比率型傳感器具有較高的定量準確性。Lin Yue等[21]將MB標記的DNA作為內參比探針結合于電極表面，測試中MB的EC信號反映了其在工作電極表面的狀態，作為內參比信號保持恒定，由此建立的ECL/EC比率傳感器可一定程度上消除工作電極帶來的誤差。ECL/EC比率型傳感器需對同一傳感界面重復施加電位，測試中有諸多不便。Wu Long等[65]采用CdTe/CdS/ZnS QDs和Lum同時修飾電極，利用兩種發光體的激發電位不同，構建了一種電位分辨型ECL傳感器，該傳感器中，QDs為陰極電位激發，Lum為陽極電位激發，因電位激發存在時間差，兩個發光體的ECL信號在圖譜上是獨立呈現的，可實現一次激發同時收集兩種檢測信號。此外，還有波長分辨型、雙電極內參比型ECL傳感器[66]，但在真菌毒素檢測中尚未普及。

圖4 基于MB對自增強發光體NGQDs-Ru@SiO2的雙重猝滅效應構建的ECL比率傳感器示意圖[32]Fig.4 Schematic illustration of ECL ratiometric Apt sensor based on the dual-quenching effect of MB on NGQDs-Ru@SiO2[32]

3.2 ECL免疫分析在真菌毒素檢測中的研究

ECL免疫分析技術是繼免疫放射、酶聯免疫吸附和化學發光免疫技術后的新一代分析技術，其集成了免疫分析和ECL各自特點，在近20 a的臨床檢驗中展示出了高度的敏感性、特異性、穩定性和可控性，且有測定范圍寬、檢測速度快并易于自動化等特點[68]。ECL免疫分析技術在食品安全中的研究可追溯到1996年，Yu等[69]將該技術首次用于食品中大腸桿菌O157:H7和沙門氏菌的檢測。隨后的十數年間，ECL免疫分析在食品安全領域的研究主要是圍繞及其衍生物展開。隨著納米技術的興起和ECL機理的研究深入，ECL免疫分析技術在食品安全檢測領域取得了一定進展（表2）。

表2 ECL免疫傳感器在真菌毒素檢測中的研究Table 2 Published studies on ECL immunosensors in the detection of mycotoxins

真菌毒素的ECL免疫分析主要有直接檢測（非標記）和競爭檢測（標記）法。非標記ECL免疫分析，一般是在電極表面依次固定發光體、特異性抗體和封閉蛋白，然后將電極與待測樣品接觸，電極表面的抗體即可結合樣品中的真菌毒素。真菌毒素結合在電極表面后，通過位阻效應導致ECL信號下降[40-41,70-71]。該法的特點是傳感器制備簡單、測試速度快、能實現在線監測，但缺點也很明顯。第一，真菌毒素為小分子化合物，空間位阻小，與抗體結合后很難顯著降低ECL信號，因此該法的靈敏度和分辨率較低。為了解決這個問題，主要從電極修飾材料入手，提高傳感界面的導電性和發光體的發光效率，從而提高對真菌毒素的敏感度。例如，Wei Qin團隊[72]以介孔碳（mesoporous carbon，MC）負載的Lum功能化AgNPs（Lum-AgNPs）修飾電極，MC具有大的比表面積和較好的導電性，不但增加Lum的負載量，也是良好的電子傳輸媒介，顯著提高了傳感界面對AFB1的敏感性。該團隊又將SiO2NPs負載的（RuSi@與Au NPs修飾的納米多孔鈷和四氧化三鈷（Co/Co3O4-Au）復合，作為電極修飾材料，Co/Co3O4-Au是優良的復合催化劑，充當共反應促進劑提高ECL效率，增強了傳感界面對待測物的敏感度[40]。此外，Lv Xiaoyi等[39]以TPETTZ（一種多環芳烴化合物）聚集體為發光體，與PANI包裹的TiO2NPs（PANI/TiO2NPs）復合后作為電極修飾材料，其中PANI具有較高的導電性，TiO2NPs一方面可作為共反應促進劑，另一方面，可作為TPETTZ的能量轉移供體，提高傳感界面的發光效率。雖然上述策略可在一定程度上提高方法的靈敏度，但是方法的分辨率仍然不夠理想[41]。第二，方法的特異性和檢測的準確度難以保證。不同的樣品基質成分，對抗原抗體反應有多種可能的影響，某些基質成分可能吸附在電極表面，實際應用中無法判斷ECL信號的改變是因為特異性結合還是非特異性吸附，導致測試結果的可信度不高。

競爭型ECL免疫分析法，需要引入人工抗原或多肽模擬表位等作為競爭者[43,74]，建立其與待測物競爭結合抗體的反應體系。該法需要對抗原或抗體進行標記，標記物可以是發光體，也可以是猝滅劑。如圖5所示，在電極表面固定真菌毒素抗體（或人工抗原）后，加入人工抗原（或抗體）標記的發光體與待測真菌毒素形成三位一體的競爭反應體系，電位激發下，發光體的發光強度與待測真菌毒素濃度呈負相關性，可以實現真菌毒素的定量。此外，也可將發光體和抗體（或人工抗原）固定在電極表面，加入人工抗原（或抗體）標記的猝滅劑與待測真菌毒素形成競爭反應體系，發光體的ECL信號與待測真菌毒素濃度呈正相關性。Wei Qin團隊[74]以草酸為配體與Cu2+、Ni2+合成3D配合物，進而負載構建發光體{[Ru(bpy)3][Cu2xNi2(1-x)(ox)3]}n（Cu/Ni/Ru），并借助Au NPs固定抗體，隨后加入AuNPs-PEI@SiO2標記的AFB1-BSA（作為免疫探針）與測待物AFB1競爭結合抗體。當免疫探針與電極上的抗體結合后，PEI會與草酸競爭絡合發光體中的Cu2+和Ni2+，使3D配合物解體，從而釋放，造成ECL信號降低。Xia Mengke等[42]將Lum和PdNPs-GO復合，構建了自增強型發光體，其中，GO提高了Lum和PdNPs的負載量，是優良的電子傳輸媒介，此外，PtNPs能夠催化溶解氧還原，提高Lum的發光效率。Lv Xiaoyi等[75]以共價有機聚合物（covalent organic polymer，COP）T4VTP6為發光體，二茂鐵甲醛與苯丙氨酸偶聯物（FcCHO/Phe）標記的人工抗原為免疫探針，構建了競爭型ECL免疫傳感器，該研究中T4VTP6同時作為納米反應器，原位還原Pt4+得到PtNPs，充當共反應促進劑和抗體固定介質。

圖5 ECL免疫傳感器構建原理Fig.5 Schematic illustration of the construction principle of ECL immunosensors

比率型ECL免疫傳感器在真菌毒素檢測中亦有報道。Lv Xiaoyi等[77]構建了一種ECL/EC比率型傳感器，其中EC信號來源于電極修飾材料Fc-MOF，作為內參比信號保持恒定，ECL信號來源于發光體BPYHBF（一種熒光染料），在競爭免疫分析模式下，ECL/EC信號比值與AFB1濃度之間存在良好的線性關系。隨后，該團隊以有機硼復合微棒（IBPHF）為發光體，構建了一種電位分辨型比率傳感器，IBPHF能在陰極電位（-1.5 V）和陽極電位（1.5 V）下分別產生ECL信號[78]。然而，該研究同時采用了K2S2O8和TPrA做共反應劑，這兩種共反應劑產生的自由基會互相猝滅，導致陰極和陽極的ECL信號不高。Fang Dandan等[76]采用兩個發光體建立了一種電位分辨型ECL傳感器，其中g-C3N4標記ZEN抗體作為電極修飾材料，自增強型發光體ABEI-GSH標記人工抗原作為檢測探針，H2O2為共反應劑，可同時檢測到陰極ECL（g-C3N4）和陽極ECL（ABEI）信號。

3.3 ECL分子印跡傳感器在真菌毒素檢測中的研究

分子印跡技術是一種以目標物分子為模板，合成對其有特異性識別功能聚合物的仿生技術，該技術的核心為分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP）[79]。在模板分子、功能單體和交聯劑存在下，受引發劑、光、電或熱等因素引發，在模板分子-功能單體主客體配合物周圍發生聚合反應，并采用適當方法從上述高度交聯的聚合物中去除模板分子，得到與目標分子結構互補的識別空穴，即為MIP[80-85]。MIP與目標物分子的關系類似抗體與抗原，因此MIP又被稱為“人工抗體”。與抗體和Apt等生物識別元件相比，MIP對酸、堿和有機溶劑有更高的耐受性，穩定性較好[79]。ECL-MIP傳感器將MIP的高度穩定性、特異性和ECL的高靈敏性、可控性集為一體，近年來受到一定關注。

Zhang Xiuhua團隊[80]在真菌毒素的ECL-MIP傳感器研究中做了系列工作，他們先在電極表面修飾發光體，隨后加入模板分子（OTA）、功能單體、交聯劑和引發劑，UV引發啟動聚合反應，在去除模板分子后，得到了MIP，隨后以TPrA為共反應劑，實現了對OTA的檢測，檢出限為0.03 ng/mL，檢測范圍0.1～10 ng/mL。鑒于該傳感器的ECL信號不高，該團隊對其進行了改進，先采用SiO2NPs負載的（Ru@SiO2）修飾電極，再行制備MIP[81]，由于發光體的負載量得以提高，改進后的傳感器對OTA的檢測靈敏度和檢測范圍明顯改善，檢出限達到27 fg/mL。緊接著，他們在第一次改進基礎上進行了再次改進，僅在ECL測試電解液中加入了CdTe QDs[82]，由于CdTe QDs與Ru@SiO2存在能量轉移，傳感界面的ECL信號強度與第一次改進相比提高了約8 倍，但是，CdTe QDs存在于電解液中，與發光體距離較遠，能量轉移效率低。于是，他們在第二次改進基礎上再次改進，將CdTe QDs與共同修飾在SiO2NPs上，以縮短能量受體（CdTe QDs）與能量供體的分子間距離，提高能量轉移效率[83]。上述MIP-ECL傳感器均是先將發光體修飾在電極上，而后在發光體上合成MIP，發光體與共反應劑被MIP阻隔，導致ECL效率不高。于是，該團隊[84]和Wei Jinliu[85]等均采用共聚合策略，將發光體與模板分子、功能單體、交聯劑和引發劑混合后，于電極表面共聚合制備MIP，因增大了發光體和共反應劑的接觸面積，ECL信號得以明顯提升。

4 ECL在食品安全檢測中存在的主要問題和挑戰

4.1 生物分子標記

構建生物傳感器時，通常需要對生物分子（Apt、抗原或抗體）進行標記（或固定）。目前常用的標記方法有共價偶聯法、非共價吸附法和自組裝標記技術。共價偶聯法反應較為劇烈，對ECL試劑和生物分子活性存在一定程度的破壞；非共價吸附力較弱，易導致標記物脫落；自組裝標記技術中形成的Au-S或Au-N等化學鍵，在ECL測試中易受高電位氧化破壞[8]。在ECL中，理想的標記方法應滿足：1）標記條件溫和，且ECL試劑和生物分子之間有適當的連接臂；2）對生物分子能夠定點或定向標記，以充分暴露其活性位點，減少與目標物結合的空間位阻；3）盡可能提高ECL試劑與生物分子的標記比，即在保證生物分子活性的前提下，使每一個生物分子標記更多的ECL試劑；4）標記方法簡單易行，成本低。

4.2 基質效應

通常，在較高電位下激發、使用高濃度共反應劑的前提下，才能獲得相對滿意的ECL效率。然而，食品基質成分復雜，其中存在含量較高的如氨基酸、礦物質和維生素等電化學活性物種，可能會非特異性吸附在工作電極表面，對ECL測試產生一定干擾。ECL作為一種快速檢測手段，不宜引入較為復雜的樣品前處理過程，否則將減弱方法學優勢。目前，研究者主要采用提高傳感器的靈敏度進而提高待測樣品稀釋倍數的策略消除基質效應。然而，一些真菌毒素本身也會在高電位下被氧化[58]，改變自身結構，進而影響抗體、Apt或MIP對其準確識別。因此，開發能在低電位下高效激發的新型ECL體系是非常重要的研究方向，如開發帶隙較小的納米材料類發光體、開發低氧化電位的共反應劑或引入高效的共反應促進劑，以及優化它們之間的配伍，是較為可行的思路[86-87]。

4.3 滿足現實需求

ECL傳感器的研究與開發應圍繞靈敏度高、檢測速度快、成本低和方法簡單等核心優勢，將其定位為一種可快速、準確篩查并可在線實時監測的重要手段。在ECL傳感器研究中，常通過引入復雜的信號放大系統（如RCA和DNA納米機器）以提高方法靈敏度。然而，這類信號放大系統依賴于復雜的生物反應和較多的生物試劑（如多種核酸探針和核酸酶），從而引入諸多不確定性因素，同時增加了檢測時間和成本。如何平衡方法的高靈敏度和易操作性，是ECL在現實應用中需要考慮的實際問題。

檢測準確度是檢測方法最為核心的性能評價指標之一。比率型傳感器具有相對高的檢測準確度，如前文所述，目前在真菌毒素檢測中以ECL/EC型傳感器為主，這類傳感器在測試中需對同一傳感界面重復施加電位，不僅增加了測試步驟，也會改變界面電化學性質。電位分辨型ECL傳感器，即一次電位掃描產生兩個獨立的ECL信號，兩個信號反映的是同一生物反應過程和同一傳感界面狀態。這兩個信號可以是同步的，也可以是反向的，具有較好的相關性，能更準確地反映待測物的真實含量。目前，這類模式的比率型傳感器在體外診斷領域發展迅速，有諸多可借鑒的策略。此外，還有波長分辨型傳感器，即一個或兩個發光體在電位激發下，產生兩個獨立發射波長的ECL信號，然而，目前多數設備仍需重復掃描分次采集兩個波長的信號，能單次掃描同時獲得兩個發射波長信號的ECL設備是當下亟需普及的。

5 結語

ECL在體外診斷行業的商業化，激發了食品安全領域研究人員的研究興趣。鑒于真菌毒素的高毒性和污染普遍性，在能快速、靈敏、準確和低成本檢測的前提下，兼顧檢測方法的高通量、自動化和便攜化，是當下ECL研究中較為適合的目標。目前ECL在真菌毒素檢測中的研究尚處于起步階段，理論基礎相對匱乏。今后應圍繞食品基質成分的特殊性，研究適合于食品污染物檢測的新型ECL體系，例如對食品基質有抗干擾作用的ECL發光體。此外，現有的共反應劑本身多是有毒物質，開發綠色環保的共反應劑乃至免共反應劑ECL體系，也是未來應側重的研究方向。最后，研究開發以實際應用為目標的ECL檢測方法和設備，是相關研究人員未來努力的方向。