黃曲霉毒素B1誘導大鼠肝細胞凋亡率劑量效應模型的構建

黃奧迪，嚴佳惠，張昭寰,2，劉海泉,2,3，趙 勇,2,3，歐 杰,2,3,*

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306；3.農業農村部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（上海），上海 201306）

黃曲霉毒素是一類由黃曲霉和寄生曲霉等菌株產生的高毒性次級代謝物的總稱[1]，廣泛存在于谷物、蔬菜、肉類等食物中，嚴重危害食品安全[2]。其中，黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）是黃曲霉毒素中出現頻率最高且毒性和致癌性最強的[3]，AFB1主要毒性作用的靶器官是肝臟[4]。Mughal等[5]研究已經證實AFB1通過引起肝細胞凋亡和干擾細胞酶活性引起肝功能障礙，作用機制涉及腫瘤抑制基因形成DNA加合物，從而導致基因突變，對人類造成致癌性，影響人體健康。

劑量效應模型（dose-response model，DRM）是食品風險評估框架中危害特征描述的重要組成部分，其本質在于定量描述暴露于危害物的劑量與發生不良反應概率之間的關系[6]。目前國內外已開展的DRM研究包括沙門氏菌[7]、副溶血性弧菌[8]、蠟樣芽孢桿菌[9]等，但是國內關于真菌毒素構建DRM的研究較少，且聚焦于AFB1構建DRM也缺乏系統性的研究[10]。AFB1生物性危害主要通過產生相應的毒素或者宿主進食具有感染性的病原體從而影響人體健康，在我國肝癌的高發地區廣西由于人們經常食用含有AFB1的食物，導致肝臟負擔增加，從而引發肝臟疾病。產生黃曲霉毒素的真菌大多存在于氣候炎熱潮濕的地區，由于收獲前和收獲后的真菌污染，在食物中發現了黃曲霉毒素，黃曲霉毒素對食物的污染速度和程度取決于溫度、濕度、土壤和儲存條件[11]。AFB1慢性毒性不僅會使體質量減輕、肝臟相關指標上升，還會增加腎臟的壓力，造成尿酸濃度升高；而AFB1急性毒性會誘發肝臟損傷、腎衰竭、肝細胞壞死，甚至引起死亡[12]。歐洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）前期已經按照國家和年齡分組開展了黃曲霉毒素的暴露評估，并進行了定性的風險評估分析[13]，在此基礎上進行AFB1的DRM研究可為其風險評估提供定量依據。

接觸0.36 mg/kgmb及以上的AFB1會導致動物和人類急性肝損傷和死亡。已有研究報道有關AFB1導致肝細胞凋亡的定性研究，但關于AFB1急性暴露于肝臟的定量數據和有關劑量效應模型的研究很少。因此，本研究以大鼠為研究對象，通過設計實驗研究不同劑量AFB1對大鼠肝細胞凋亡率的影響，并基于實驗數據應用指數模型、對數模型、Weibull模型、Hill模型等常用模型擬合可能的劑量效應關系，通過數學檢驗進行參數比較，選擇最優的DRM為黃曲霉毒素風險評估提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

48 只SPF級雄性Wister大鼠，體質量180～200 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。飼養于環境控制的動物實驗室內，自由飲水飲食，飼養溫度22～24 ℃，相對濕度50%～55%，光照條件：亮暗周期各12 h。本研究進行的動物實驗程序均按照上海中醫藥大學《實驗動物護理與使用指南》進行，并經中國動物中心動物倫理委員會和上海中醫藥大學批準，審查批準編號：PZSHUTCM210115014。

AFB1上海吉至科技有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）生工生物工程（上海）股份有限公司；水合氯醛 阿達瑪斯試劑有限公司；多聚甲醛、無水乙醇 國藥集團化學試劑有限公司；TUNEL染色試劑盒 武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

DW-88L338超低溫保存箱 青島海爾特種電器有限公司；恒溫培養箱 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；HH-S11-2-S恒溫水浴鍋 上海新苗醫療器械制造有限公司；ZH5102A電子天平 珠恒電子有限公司；JB-L5凍臺 武漢俊杰電子有限公司；RM2016病理切片機 上海徠卡儀器有限公司；KD-P組織攤片機浙江省金華市科迪儀器設備有限公司；GFL-230烤箱天津市萊玻瑞儀器設備有限公司；G6004防脫載玻片、TSY-B脫色搖床、WG1066-1組化筆 武漢塞維爾生物科技有限公司；Giotto染色機 意大利DIAPATH公司；Eclipse E100正置光學顯微鏡 日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 造模及分組

48 只大鼠經過1 周的適應性飼養后，隨機分為4 組（每組12 只）。空白組（CK組）：腹腔注射與AFB1劑量組相同量的4% DMSO溶液；AFB1低劑量組（LD組）：腹腔注射劑量為1 mg/kgmb的AFB1工作液一次；中劑量組（MD組）：腹腔注射劑量為2 mg/kgmb的AFB1工作液一次；高劑量組（HD組）：腹腔注射劑量為3 mg/kgmb的AFB1工作液一次，AFB1溶于4% DMSO溶液。AFB1的劑量根據參考文獻[14]和預實驗結果初步確定。

1.3.2 實驗動物處理

造模后的48 h對大鼠使用10%水合氯醛（350 mg/kgmb）進行麻醉處理，待麻醉之后對大鼠進行解剖，分離大鼠的肝臟組織并使用4%多聚甲醛溶液浸泡固定。

1.3.3 肝細胞凋亡率的測定（TUNEL染色）

在4%多聚甲醛中固定24 h后，取出肝臟組織進行石蠟包埋和切片（4 μm），然后對石蠟切片脫蠟復水，將蛋白酶K工作液滴加到組織切片處理，PBS漂洗，之后進行破膜處理和室溫平衡，加入TUNEL反應混合液（TdT酶∶dUTP∶Buffer＝1∶5∶50（體積比））在37 ℃恒溫箱中孵育2 h，PBS洗滌后滴加3%牛血清白蛋白覆蓋組織，加入雙抗，之后滴加DAPI染液，室溫避光放置10 min，滴加抗熒光猝滅封片液后使用熒光顯微鏡觀察拍照并進行細胞數量計算。肝細胞凋亡率按式（1）計算：

1.3.4 劑量效應模型構建

常見的DRM包括指數模型、對數模型、Weibull模型、Hill模型等。以下模型中d為大鼠的注射劑量（mg/kgmb），P為大鼠肝細胞凋亡率，A、B、C均表示常數（表1），應用Origin Pro for Windows 8.0軟件中的Levenberg-Marquardt法（非線性最小二乘法）進行擬合。

表1 常見劑量效應模型及其相關參數Table 1 Common dose-response models and related parameters

1.3.5 數學檢驗與評價

參照Kasuya等[15]建模數學檢驗參數決定系數R2和Lin等[16]赤池信息量準則（Akaike information criterion，AIC）、貝葉斯信息準則（Bayesian information criterion，BIC）進行模型擬合度評價和最佳模型選擇，相關表達式如下：

式中：SSE為方差分析的殘差平方和；SST為總離差平方和。

式中：k為模型中未知參數個數；n為樣本數量；L為模型中極大似然函數值。

其中AIC代表實際值與預測值之間的符合程度，理論上AIC越小越好，然而當模型的復雜度提高（參數個數k增大）時，似然函數值也會增大，從而導致AIC變小。當k過大時，似然函數值增速減緩，模型過于復雜造成過度擬合現象。針對該問題，BIC引入了與參數個數相關，與AIC相比更大的懲罰項，考慮了當參數個數變大時，模型精度提高所造成的模型復雜度過高的現象。

2 結果與分析

2.1 AFB1對大鼠肝細胞凋亡的影響

圖1為TUNEL染色結果部分切片，藍色部分代表正常肝細胞，其核膜結構完整；綠色部分代表凋亡肝細胞，其核膜結構呈現簇狀或碎片狀。由圖1A～D可知，與CK組相比，LD組、MD組和HD組的凋亡率顯著上升，且隨著劑量的提高細胞凋亡率也有所上升（P＜0.05）。

圖1 AFB1對大鼠肝細胞凋亡的影響Fig.1 Effect of AFB1 on apoptosis in rat hepatocytes

2.2 大鼠肝細胞凋亡率劑量效應關系的擬合

根據大鼠腹腔注射AFB1誘導肝細胞凋亡的定量數據（圖1），應用不同DRM擬合非線性關系如圖2所示。由圖2可知，除了在迭代次數范圍內未收斂的Weibull模型1以外，其余DRM都達到了收斂的統計要求，并且相同的模型出現了幾乎重合的現象。其中DRM所預測的半數有效量（median effective dose，ED50），即能引發50%細胞凋亡的劑量均為1.91 mg/kgmb左右，與實際實驗所用劑量大致相當，也與EFSA[17]所預測的隨著AFB1濃度提高，肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）發生概率顯著升高的趨勢相同。對于AFB1造成肝細胞凋亡率的ED50可通過動物模型毒理學實驗進行進一步確認，本實驗結果僅作為預測劑量效應關系使用。

圖2 AFB1誘導大鼠肝細胞凋亡率不同劑量效應模型的擬合曲線Fig.2 Fitting curves of different dose-response models for AFB1-induced apoptosis rate in rat hepatocytes

從擬合結果來看，Weibull模型、Gamma模型和劑量效應曲線分別對應圖2中的曲線G、H、K、L，其決定系數R2＞0.9960（表2），在擬合效果上優于其他模型。相同的模型在外延至高劑量和最小有效量時幾乎重合，預測細胞凋亡率結果與Ruggeberg等[18]實驗測得大鼠靜脈注射AFB1肝細胞凋亡率結果相似，證明本實驗DRM的可信性，但食品等殘留AFB1導致肝細胞凋亡的相關數據需要深入實驗。

表2 AFB1誘導大鼠肝細胞凋亡率劑量效應模型的參數估計及數學檢驗Table 2 Parameter estimation and mathematical testing of doseresponse models for AFB1-induced apoptosis rate in rat hepatocytes

2.3 劑量效應模型的數學檢驗

對構建的DRM進行數學檢驗（表2），對比參數決定系數R2和AIC可知，劑量效應曲線（R2＝0.9970）和指數模型2、3（AIC＝33.91）優于其他模型。

將BIC納入考慮的范疇內，Gamma模型的BIC值（BIC＝17.19）僅比劑量效應曲線的BIC值（BIC＝15.88）大，且AIC值優于大多數模型，參數決定系數也處于上述考慮范圍內。Gamma模型（R2＝0.9964，AIC＝37.40，BIC＝17.19）優于其他模型綜上所述，Gamma模型可作為AFB1誘導大鼠肝細胞凋亡率最優的DRM用于劑量效應模型擬合的理論參考。

3 討論

急性暴露于AFB1不僅會影響肝臟和腎臟等器官[19]，還會抑制人類的免疫系統，使其受到傳染病的危害[20]。據報告，嚙齒動物口服AFB1的半數致死量在1～18 mg/kgmb之間[21]，而其他物種的研究表明AFB1的劑量小于1 mg/kgmb也可能導致死亡[22]，證明AFB1不僅會對器官造成不可逆的影響，還會威脅生命健康。EFSA食品鏈污染物小組根據各項動物研究數據推斷認為AFB1每日攝入量不得超過0.4 μg/kgmb，由于使用人類志愿者代替動物模型研究獲得劑量效應數據的方法存在許多困難，關于AFB1的人類數據遠不如動物數據那樣豐富，因此一般采用換算系數的方法外推有關人類的數據[23]。

本研究選用大鼠Wister腹腔注射肝細胞凋亡率的實驗數據建立DRM，由于AFB1檢測報告大多屬于定性檢測，關于大鼠的定量數據較少，缺少一定的參考，因此可能存在些許誤差。Williams[24]對虹鱒魚進行的劑量效應研究為AFB1風險評估模型提供了支持，未來定量風險評估必然是風險評估的新趨勢所在[25]。

指數模型是食品中有害物建立DRM的首要選擇，如沙門氏菌[26]、諾如病毒[27]等微生物均對指數模型表現出了良好的擬合性。然而有關霉菌毒素的DRM很少有研究，Gilbert-Sandoval等[28]基于生理動力學建模的反向劑量法預測AFB1在大鼠和人中的急性肝毒性劑量反應數據，通過定量體外劑量評估AFB1急性肝毒性并預測體內毒性評估，為本實驗預測AFB1對于肝細胞凋亡率趨勢變化提供了參考。通過擬合模型推導低劑量效應存在不準確的可能性，會出現低劑量外推數據溢出問題[29]，因此在將本研究結果外推至人體或實際應用時應謹慎。

建立劑量效應模型后有必要采用志愿者實驗進行驗證，但是文獻中關于人類吸收AFB1的數據僅有Jubert等[30]召集3 位男性志愿者口服低劑量（30 ng）數據，在暴露1 h后觀測到血漿中的最大放射性尚未達到肝細胞凋亡的最低有效劑量，對于本研究不具備參考性。同時AFB1的感染劑量也會因為受體、環境因素、毒素作用等因素導致數據不同[31]，因此本研究采用常用的數學檢驗系數R2和AIC以及BIC評價和選擇。通過比較，建議選用Gamma模型作為黃曲霉毒素導致肝細胞凋亡率最優劑量效應模型。

隨著風險評估模型的發展，在建立劑量效應模型的時候可以引入其他信息，例如引入新的參數TPI（time post inoculation），用于預測時間和劑量同時作為自變量引起的反應變化，從而建立時間劑量效應模型評估反映隨時間和劑量的發展趨勢，同時也能結合宿主因素(如年齡、性別）或病原體因素(如微生物氣溶膠直徑、感染性）等[32]。本研究結論僅針對于模型方法論時證明其可行性較好，在外推應用時應謹慎使用[33]。

4 結論

本研究基于AFB1誘導大鼠肝細胞凋亡的定量分析結果，分別應用指數模型、對數模型、Weibull模型、Hill模型、Gamma模型、劑量效應曲線6 種模型擬合了AFB1誘導大鼠肝細胞凋亡率的劑量效應模型，其中指數模型、Gamma模型、劑量效應曲線表現出良好的擬合性，根據數學檢驗結果，建議選用Gamma模型作為AFB1誘導大鼠肝細胞凋亡率最優的劑量效應模型用于AFB1定量風險評估框架中的危害特征描述。