牛HSPA6蛋白特性分析及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

胡麗筠，馬旭華，李亞蕾，羅瑞明

（寧夏大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏 銀川 750000）

熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）是分子質(zhì)量為10～110 ku的一種多基因超家族，是細(xì)胞內(nèi)最主要的分子伴侶，它與其他蛋白可逆地相互作用，避免非特異性蛋白的聚集，幫助細(xì)胞蛋白獲得其天然結(jié)構(gòu)以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，并協(xié)助這些蛋白的形成、折疊和跨膜運(yùn)輸[1]。在眾多HSPs中，對HSP60/70/90家族的研究最多。HSP70作為一種保守的分子伴侶蛋白，在原核生物和真核生物中普遍表達(dá)，具有保守的結(jié)構(gòu)特征，在蛋白質(zhì)質(zhì)量控制和蛋白質(zhì)折疊中充當(dāng)管家，以防止蛋白質(zhì)積累和修復(fù)錯誤折疊的蛋白質(zhì)[2]。多年來，有關(guān)HSP70的研究多集中在人和鼠的疾病方面，而在家畜中的研究尚不充分。楊莉等[3]采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和酶聯(lián)免疫吸附測定方法檢測發(fā)現(xiàn)冷應(yīng)激后湖羊肝臟、肺臟、脾臟、淋巴結(jié)組織中HSP70mRNA表達(dá)量顯著增加。最近研究發(fā)現(xiàn)HSP70家族的蛋白質(zhì)與肉嫩度有關(guān)。Sugimoto等[4]在荷斯坦-弗里西亞牛的膈肌中發(fā)現(xiàn)，HSP70的缺乏導(dǎo)致能量相關(guān)的蛋白質(zhì)發(fā)生錯誤折疊，可能引起蛋白質(zhì)聚集和肌肉纖維變性。此外，Crawford等[5]的研究表明，熱休克伴侶蛋白HSP90和HSP70是肌原纖維各個組裝步驟中所必需的。Thakur等[6]的研究表明HSP70等熱休克蛋白通過幫助維持蛋白質(zhì)正常的結(jié)構(gòu)和功能對肌肉蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)起重要作用。這些研究表明HSP70有利于維持骨骼肌的結(jié)構(gòu)、超微結(jié)構(gòu)和功能特性。

牛HSPA6作為HSP70家族中一個特征不佳的成員，是哺乳動物中部分保守的可誘導(dǎo)蛋白，在嚴(yán)重的細(xì)胞應(yīng)激后被誘導(dǎo)，其中熱應(yīng)激不僅不利于動物的生產(chǎn)和繁殖，而且嚴(yán)重?fù)p害畜種的健康。HSPA6作為一種不同于其他基因的新型HSP70基因，在許多生物體中都有表達(dá)[7]。HSPA6的同源基因已在棉頭狨猴、豬、牛和人類中發(fā)現(xiàn)[8-10]，并且已經(jīng)確定牛和山羊的HSPA6在熱應(yīng)激條件下具有更高的表達(dá)[7-8]，這可能是因?yàn)閲?yán)重的壓力條件導(dǎo)致HSPA6進(jìn)化為維持生物基本功能的基因[11]。因此，研究HSPs相關(guān)基因、提高熱應(yīng)激穩(wěn)定性是畜產(chǎn)品發(fā)展亟待解決的問題。

牛作為我國畜牧業(yè)重要的家畜，其肉營養(yǎng)豐富，蛋白含量高。嫩度和顏色作為兩個重要的牛肉品質(zhì)特征，與消費(fèi)者滿意度直接相關(guān)。HSPs具有抗凋亡的功能，影響宰后肉的品質(zhì)，其表達(dá)量的差異與肉的質(zhì)量特征如嫩度、顏色和持水能力有重要關(guān)系[12]。HSPA6作為HSP70家族成員之一，與宰后貯藏期間肉品質(zhì)的具體作用機(jī)制尚不明確，且其與牛肉品質(zhì)相關(guān)性的研究較少。本研究利用多重生物信息學(xué)方法，研究牛HSPA6蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性對宰后肉品質(zhì)的影響，旨在進(jìn)一步為其功能機(jī)制提供思路和依據(jù)。

1 方法

1.1 牛HSPA6蛋白序列的獲得與系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

使用牛HSPA6蛋白登錄號信息（F1MWU9）是通過使用關(guān)鍵詞“HSPA6+Bos taurus”搜索UniProt（https://www.uniprot.org/）蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫獲得的。以該蛋白序列搜索不同生物的同源蛋白序列。山羊（A0A452G2N5）、長江江豚（A0A341C0G7）、馬（A0A3Q2HF81）、羊駝（A0A6I9IS04）、人（P17066）、北方白頰長臂猿（G1SBW1）、棉頂羅望子（Q9N1U2）、豚鼠（A0A286XYQ5）、豬（Q04967）、三行地松鼠（I3ND33）、黑鱈魚（A0A6I9N6M6）、犬蛔蟲（A0A0B2VDJ4）的基因組庫，并獲得不同物種中HSPA6的同源蛋白質(zhì)序列。使用Mega 11.0軟件中的Meighbor-Joining（NJ）方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并將Bootstrap分析重復(fù)數(shù)設(shè)置為1000。

1.2 牛HSPA6理化性質(zhì)分析方法

利用ExPASy數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)的ProtParam工具（http://www.expasy.org/tools/protparam）對HSPA6的分子式、分子質(zhì)量、酸堿性、理論等電點(diǎn)、帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)（Asp+Glu）、帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg+Lys）、親水性總平均值（grand average of hydropathicity，GRAVY）、不穩(wěn)定性指數(shù)（II）及脂肪族指數(shù)等理化性質(zhì)進(jìn)行分析。牛HSPA6蛋白氨基酸序列從NCBI中獲得。

1.3 牛HSPA6蛋白親疏水區(qū)域、蛋白質(zhì)跨膜域及信號肽分析方法

通過ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）分析牛HSPA6親疏水性；通過TMHMM Server 2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? TMHMM-2.0）分析H S PA 6 是否存在跨膜現(xiàn)象及其區(qū)域；通過SignalP 5.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0）分析HSPA6信號肽及切割位點(diǎn)。

1.4 牛HSPA6結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點(diǎn)及糖基化位點(diǎn)分析方法

通過NCBI網(wǎng)站中的Consered Domains工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析預(yù)測牛HSPA6蛋白保守域；通過NetPhos3.1 Server（http://www.geneinfinity.org/sp/sp_proteinptmodifs.html）分析牛HSPA6表達(dá)時是否可能發(fā)生磷酸化修飾；通過NetNGlyc（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0）預(yù)測牛HSPA6蛋白的N-糖基化位點(diǎn)。

1.5 牛HSPA6亞細(xì)胞定位預(yù)測

使用PSORTII軟件（https://wolfpsort.hgc.jp/）預(yù)測牛HSPA6的亞細(xì)胞定位。

1.6 牛HSPA6蛋白高級結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過SOPMA（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預(yù)測牛HSPA6蛋白的二級結(jié)構(gòu)。通過SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org）預(yù)測牛HSPA6蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

1.7 牛HSPA6蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測

通過STRING數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org/），最低要求互動分?jǐn)?shù)設(shè)置為高置信度值，即0.700，要顯示的最大交互蛋白數(shù)量控制在10 個以內(nèi)，構(gòu)建牛HSPA6的互作蛋白網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛HSPA6蛋白進(jìn)化關(guān)系分析

構(gòu)建牛、山羊、長江江豚、馬、羊駝、人、北方白頰長臂猿、豚鼠、豬等多種生物的HSPA6蛋白的同源序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖1所示。由圖1可知，牛與羊、長江江豚等哺乳動物處于同一分支，它們的HSPA6蛋白的氨基酸序列有很大的相似性。

圖1 牛HSPA6蛋白與其他物種同源蛋白質(zhì)序列比對系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of Bos taurus and other species based on sequence homology of HSPA6 protein

2.2 牛HSPA6蛋白理化性質(zhì)分析

通過EXPASY在線軟件對HSPA6的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測分析。牛HSPA6蛋白理化性質(zhì)如表1所示。該蛋白分子質(zhì)量為70570.64 u，理論等電點(diǎn)為5.66，表明該蛋白質(zhì)是酸性蛋白。

表1 HSPA6蛋白理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of HSPA6 protein

2.3 牛HSPA6蛋白親疏水區(qū)域、蛋白質(zhì)跨膜域及信號肽分析

分析牛HSPA6蛋白氨基酸序列的親水、疏水區(qū)域，其中正值表示該蛋白為疏水性蛋白，值越大疏水性越強(qiáng)；負(fù)值表示鈣蛋白為親水性蛋白，數(shù)字越大親水性越強(qiáng)，雙性氨基酸范圍為0.5～-0.5。由圖2可得，牛HSPA6蛋白的親水性最強(qiáng)位點(diǎn)位于第591位谷氨酸（Glu）、疏水性最強(qiáng)位點(diǎn)位于第393位天冬氨酸（Asp），分值分別為-3.422、2.211；同時HSPA6蛋白質(zhì)序列中大多數(shù)氨基酸的分值為負(fù)，則可知親水性區(qū)域多于疏水性區(qū)域，親水性預(yù)測分析進(jìn)一步證實(shí)GRAVY值分析。

圖2 牛HSPA6親水性分析Fig.2 Hydrophilicity analysis of bovine HSPA6 protein

馬旭華等[13]研究發(fā)現(xiàn)秦川牛背最長肌在宰后成熟初期，HSPA6蛋白僅發(fā)生少量降解，致使系水力增強(qiáng)。且有研究發(fā)現(xiàn)在更嫩的肉樣中，HSP70含量較高[14]。HSPA6蛋白作為HSP70的一種，由于其為親水性蛋白，自身含量的增加會導(dǎo)致水分含量增加，從而對牛肉嫩度產(chǎn)生影響。已有發(fā)現(xiàn)指出肉的品質(zhì)特征如嫩度、顏色和持水能力與HSPs表達(dá)量的差異有關(guān)[12]。這些研究都進(jìn)一步說明了牛HSPA6蛋白作為親水性蛋白，對牛肉嫩度產(chǎn)生影響。

通過TMHMM Server 2.0針對牛HSPA6進(jìn)行跨膜域預(yù)測，如圖3所示。預(yù)測結(jié)果顯示，HSPA6未含有跨膜信號，不存在由胞外向胞內(nèi)的跨膜段，皆呈膜外螺旋狀，故不屬于跨膜蛋白。通過SignalP 5.0對牛HSPA6蛋白進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如圖4所示。預(yù)測結(jié)果顯示，Sec/SPI（SP）概率＜0.003，數(shù)值較低，未觀察到信號肽區(qū)域。由于信號肽是一種蛋白質(zhì)分泌的標(biāo)記，這與Pockley等[15]報道的HSP60和HSP70在細(xì)胞外環(huán)境中存在這一結(jié)果不一致，推測是牛HSPA6蛋白可能主要在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，在細(xì)胞外環(huán)境分泌較少，信號肽含量過低，故未觀察到信號肽區(qū)域。

圖3 牛HSPA6跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Transmembrane structure prediction of bovine HSPA6 protein

圖4 牛HSPA6信號肽預(yù)測Fig.4 Signal peptide prediction of bovine HSPA6 protein

2.4 牛HSPA6蛋白結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點(diǎn)及糖基化位點(diǎn)分析

牛HSPA6蛋白包含N-端核苷酸結(jié)合域（nucleotide binding domain，NBD）和C-端底物結(jié)合域（substratebinding domain，SBD）兩個重要且獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域。NBD又稱為ATP酶結(jié)構(gòu)域，約44 kDa，可以結(jié)合并水解ATP；SBD稱為肽結(jié)合域，約28 kDa，具有蛋白酶敏感位點(diǎn)的中間域和結(jié)合延伸的多肽。牛HSPA6蛋白的兩個結(jié)構(gòu)域可以進(jìn)行變構(gòu)耦合，NBD和SBD之間有一個靈活的含結(jié)構(gòu)域的蛋白酶敏感位點(diǎn)，在變構(gòu)通訊中發(fā)揮著重要作用[16-17]。HSPA6經(jīng)歷ATP水解和核苷酸交換循環(huán)，使底物結(jié)合和釋放，與此同時HSPA6保持并發(fā)揮其一系列生理功能[18]。SBD與其伴侶蛋白的結(jié)合能力比NBD結(jié)合ATP的能力薄弱；但當(dāng)二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）與NBD相結(jié)合時，其構(gòu)象的變化可以提高SBD與其伴侶蛋白的親和力[19]。通過NCBI中Consered Domains對預(yù)測的HSPA6蛋白質(zhì)保守域進(jìn)行分析，由圖5可知，其氨基酸序列具有HSP70家族特有的結(jié)構(gòu)，即NBD與SBD。

圖5 牛HSPA6蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.5 Domain prediction of bovine HSPA6 protein

馬旭華等[13]研究發(fā)現(xiàn)宰后成熟期間秦川牛背最長肌中HSPA6表達(dá)量呈顯著下降趨勢，并與ATP、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）含量呈顯著正相關(guān)，結(jié)果表明HSPA6可能通過利用自身結(jié)構(gòu)域具有ATP-ADP轉(zhuǎn)換活性機(jī)制，執(zhí)行了宰后成熟期間秦川牛肉蛋白的翻譯后修飾，蛋白質(zhì)翻譯后修飾促使組織中各種生化反應(yīng)利用能量導(dǎo)致ATP的降解，且降解產(chǎn)物ADP、一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）含量均隨成熟時間延長呈顯著下降趨勢，同時，反映組織細(xì)胞中氧化還原和能量變化狀態(tài)的NADH含量呈下降趨勢，發(fā)生了與活體不同的變化。這一研究說明HSPA6蛋白的NBD和SBD結(jié)構(gòu)域通過影響宰后肉品中能量物質(zhì)，進(jìn)而影響宰后肉品品質(zhì)。

為了對牛HSPA6的作用機(jī)制作進(jìn)一步分析，通過NetPhos3.1 Server分析HSPA6磷酸化位點(diǎn)，如圖6所示，可以看出蛋白質(zhì)序列中存在多個可能發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)。從預(yù)測位點(diǎn)中篩選出11 個得分＞0.900的位點(diǎn)，且主要分布在NBD及SBD結(jié)構(gòu)域，如表2所示（預(yù)測得分在0.000～1.000，＞0.500表示可能發(fā)生磷酸化，越接近1，就越可能發(fā)生磷酸化）。根據(jù)NetPhos3.1預(yù)測結(jié)果結(jié)果可知，牛HSPA6蛋白發(fā)生磷酸化最多的氨基酸為絲氨酸（Ser）。Ser通過蛋白質(zhì)的異構(gòu)途徑進(jìn)行磷酸化，激活蛋白質(zhì)的酶活性；除了激活蛋白質(zhì)的酶活性外，酪氨酸還有一個重要的作用，就是通過形成多個蛋白的復(fù)合體，構(gòu)成細(xì)胞信號傳遞和轉(zhuǎn)導(dǎo)的根源性機(jī)制[20]。

表2 HSPA6多肽鏈中可能的磷酸化位點(diǎn)Table 2 Potential phosphorylation sites in HSPA6 peptide chains

圖6 牛HSPA6蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測Fig.6 Phosphorylation site prediction of bovine HSPA6 protein

越來越多的證據(jù)表明，HSP70受大量翻譯后修飾調(diào)節(jié)，也稱為伴侶代碼，包括乙?；?、磷酸化和ADP-核糖基化等[21-22]。通過磷酸化位點(diǎn)預(yù)測，表明HSPA6蛋白也進(jìn)行磷酸化修飾，這有助于更加深入了解HSPA6的磷酸化水平及其在機(jī)體中的作用機(jī)理。Beltrao等[23]已經(jīng)鑒定出11 個物種的HSP70亞型上的磷酸位點(diǎn)共313 個，富集發(fā)現(xiàn)這些位點(diǎn)大多數(shù)位于NBD和SBD結(jié)構(gòu)域附近，這與本研究結(jié)果一致。通過磷酸化位點(diǎn)預(yù)測發(fā)現(xiàn)HSPA6能夠催化磷酸基團(tuán)從磷酸供體向磷酸供體遷移，進(jìn)而調(diào)整和控制蛋白質(zhì)的活力與功能等各個環(huán)節(jié)。因此，HSPA6可能通過宰后牛肉中所發(fā)生的蛋白質(zhì)翻譯后修飾進(jìn)一步調(diào)控蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能活性及蛋白質(zhì)間的相互作用，這些變化又進(jìn)一步影響并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和蛋白水解等變化，最終影響嫩度、持水性等肉品質(zhì)[24]。已有研究發(fā)現(xiàn)HSPA6可以通過抑制相關(guān)信號通路的磷酸化和絲裂原活化蛋白激酶途徑發(fā)揮作用[25]。

牛HSPA6蛋白的N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果如圖7所示。結(jié)果顯示，該蛋白存在4 個可能的N-糖基化位點(diǎn)，最有可能發(fā)生N-糖基化的位點(diǎn)位于第33位殘基上，概率為0.6172。蛋白質(zhì)N-糖基化修飾在蛋白質(zhì)翻譯后修飾中具有關(guān)鍵作用[26]?；趯ΡＪ亟Y(jié)構(gòu)域、可能磷酸化位點(diǎn)及N-糖基化預(yù)測的綜合分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)揮生物學(xué)作用的結(jié)構(gòu)域位于4～379位堿基中，而磷酸化位點(diǎn)及N-糖基化激活位點(diǎn)分布的后端堿基可能是蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾的主要部分。

圖7 牛HSPA6蛋白N-糖基化修飾位點(diǎn)預(yù)測Fig.7 Prediction of N-glycosylation sites of bovine HSPA6 protein

2.5 牛HSPA6蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測分析

通過PSORT II Prediction分析牛HSPA6亞細(xì)胞定位。結(jié)果顯示，HSPA 6 蛋白最有可能為細(xì)胞質(zhì)蛋白（14.5%），其次可能為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白（12.5%）。說明HSPA6在細(xì)胞質(zhì)中具有重要生理功能。同時通過其序列發(fā)現(xiàn)，HSPA6的C-末端具有特征構(gòu)象EEVD，該特征構(gòu)象用于進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)定位。兩者預(yù)測結(jié)果可以說明HSPA6最有可能是胞質(zhì)蛋白，且主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮生物作用。且已有數(shù)據(jù)表明HSPA6蛋白的細(xì)胞定位主要在胞質(zhì)溶膠和胞外外泌體中[19]。此外，也有報道指出其他位置如中心粒，以及COP9信號體和血液微粒共定位的含核蛋白復(fù)合物中都有HSPA6[27]。馬旭華等[13]利用4D-非標(biāo)定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對篩選出的秦川牛HSPA6蛋白及其相關(guān)蛋白作基因本體論（Gene Ontology，GO）分析研究發(fā)現(xiàn)，此類相關(guān)蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮生物作用。以上發(fā)現(xiàn)都說明牛HSPA6蛋白最有可能在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用。

2.6 牛HSPA6蛋白的高級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

通過在線軟件SOPMA分析牛HSPA6蛋白的二級結(jié)構(gòu)，如圖8所示，該蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由40.38%的α-螺旋、7.20%的β-轉(zhuǎn)角、33.65%的無規(guī)卷曲和18.78%延伸鏈構(gòu)成。該蛋白質(zhì)中α-螺旋及β-轉(zhuǎn)角總比例為47.58%，說明蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，其中α-螺旋及無規(guī)卷曲占比最大。模型構(gòu)建的結(jié)果用Ramachandran plot表示，如圖9所示。結(jié)果顯示，通過模型構(gòu)建所得蛋白的三維結(jié)構(gòu)中，92.77%的Φ角和Ψ角均處于Ramachandran plot中的合理區(qū)域，確保了其三維結(jié)構(gòu)的正確性。圖10為通過SWISS-MODEL采用同源建模法預(yù)測的蛋白牛HSPA6的三級結(jié)構(gòu)及相關(guān)參數(shù)。該蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)符合HSP70家族特征，NBD及SBD均被折疊為球狀結(jié)構(gòu)，其間由任意的卷曲鏈進(jìn)行連接。并且預(yù)測的結(jié)果表明GMQE為0.73，QMEAN為-1.07，覆蓋率82.92%，序列相似性55.0%，顯示該模型預(yù)測結(jié)果合理。

圖8 牛HSPA6蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.8 Secondary structure analysis of bovine HSPA6 protein

圖9 牛HSPA6蛋白三級結(jié)構(gòu)Ramachandran plots圖Fig.9 Ramachandran plots of tertiary structure of bovine HSPA6 protein

圖10 牛HSPA6蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.10 Tertiary structure analysis of bovine HSPA6 protein

通過高級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明牛HSPA6蛋白是一種結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。結(jié)合理化特性預(yù)測結(jié)果，都說明HSPA6為穩(wěn)定性蛋白質(zhì)。Hageman等[28]發(fā)現(xiàn)HSPA6可能已經(jīng)進(jìn)化出在極端壓力條件下維持穩(wěn)定的關(guān)鍵功能。Picard等[29]表明HSP70是在正常細(xì)胞生長期間以及在病理生理?xiàng)l件下維持細(xì)胞完整性的最重要的HSPs之一。馬旭華等[13]研究發(fā)現(xiàn)宰后成熟初期HSPA6僅發(fā)生少量降解，這可能與其自身結(jié)構(gòu)和功能具有穩(wěn)定性有關(guān)，因而能夠在宰后初期較好地執(zhí)行其生理功能，抑制細(xì)胞凋亡，對肌肉結(jié)構(gòu)蛋白降解程度起反向調(diào)控作用。這些研究中HSPA6蛋白在非正常環(huán)境條件下仍保持其生理功能，這與其自身結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性密不可分。

2.7 牛HSPA6蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析

通過STRING對牛HSPA6蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，以獲取其潛在蛋白質(zhì)的交互作用，如圖11所示。表3為牛HSPA6蛋白相互作用的蛋白質(zhì)及可能性預(yù)測得分。結(jié)果顯示，聚類系數(shù)：0.814；PPI富集P值：1.29×10-11；HSPA6蛋白可能與BAG1、DNAJA4、DNAJB1、DNAJC2等蛋白相互作用。GO富集分析表明，牛HSPA6互作基因主要參與腺苷酸交換因子活性、ATP酶調(diào)節(jié)活性、伴侶綁定等分子功能；京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析可以看出，HSPA6主要參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工。參與的反應(yīng)組途徑有HSF1介導(dǎo)的熱休克反應(yīng)的調(diào)節(jié)、類固醇激素受體的HSP90伴侶循環(huán)及細(xì)胞對壓力的反應(yīng)等。

表3 與牛HSPA6蛋白相互作用的蛋白質(zhì)及可能性預(yù)測得分Table 3 Proteins interacting with bovine HSPA6 protein and predicted likelihood scores

圖11 牛HSPA6蛋白相互作用預(yù)測Fig.11 Putative interaction network of bovine HSPA6 protein

分析牛HSPA6蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)DNAJB1、DNAJC2及DNAJC7都屬于HSP40家族成員。HSP40通過HSP70的NBD和SBD的C端部分與HSP70相互作用，與HSP70/HSP90組織蛋白（HSP70-HSP90 organizing factor，HOP）競爭，且HSP70上的磷酸化位點(diǎn)可以促進(jìn)其與HSP40相互作用，并幫助這種伴侶蛋白達(dá)到適合HOP結(jié)合的構(gòu)象，之后被共同伴侶蛋白取代[30-31]。除此之外，還發(fā)現(xiàn)了HSP110家族成員HSPH1，有報道顯示，HSP110同樣可以和HSP70相互作用[32]。通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)的HSP40及HSP110家族成員，表明HSPA6在參與牛的熱應(yīng)激反應(yīng)過程中，可能會與這些成員以聚合體的形式存在，其上的磷酸化等位點(diǎn)在該過程中發(fā)揮重要作用。通過進(jìn)一步的GO富集發(fā)現(xiàn)，牛HSPA6互作基因主要參與腺苷酸交換因子活性、ATP酶調(diào)節(jié)活性、伴侶綁定等分子功能，通過影響ATP等能量物質(zhì)合成過程，導(dǎo)致肌細(xì)胞中能量物質(zhì)的改變，進(jìn)而改變?nèi)獾钠焚|(zhì)[33]。KEGG通路分析預(yù)測基因主要參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工，這與牛HSPA6亞細(xì)胞定位預(yù)測以及含有EEVD的結(jié)果相吻合，結(jié)果都說明該蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮生物作用。HSPA6互作蛋白網(wǎng)絡(luò)為深入探討宰后應(yīng)激及分子機(jī)制對肉品質(zhì)的影響提供了可靠的線索。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建牛HSPA6蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹以及進(jìn)行多重生物信息學(xué)分析，得到牛HSPA6蛋白的結(jié)構(gòu)特征和功能特性。牛HSPA6蛋白是一種結(jié)構(gòu)和功能特性穩(wěn)定的酸性親水性蛋白，這使得它能夠在應(yīng)激反應(yīng)過程中保持并發(fā)揮其生物學(xué)功能以及對牛肉品質(zhì)（尤其是嫩度）起作用；并且含有NBD和SBD兩個與ATP-ADP活性轉(zhuǎn)化有關(guān)的結(jié)構(gòu)域，GO富集到的互作基因也主要參與腺苷酸交換因子活性、ATP酶調(diào)節(jié)活性等分子功能，說明該蛋白通過調(diào)節(jié)ATP等能量物質(zhì)的合成，影響宰后肉品的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，進(jìn)而影響肉的品質(zhì)。蛋白功能預(yù)測表明該蛋白含有磷酸化位點(diǎn)，大多數(shù)位于NBD和SBD結(jié)構(gòu)域附近，結(jié)合蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，其上的磷酸化位點(diǎn)促進(jìn)HSPA6蛋白的聚合，使其與互作蛋白形成聚合體，可能參與調(diào)節(jié)牛溫度應(yīng)激反應(yīng)過程，并且以上這些反應(yīng)主要在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行。本研究對牛HSPA6蛋白結(jié)構(gòu)特征和功能特性進(jìn)行分析，為深入研究牛應(yīng)激反應(yīng)及牛肉品質(zhì)變化機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。