結合外周血微RNA-181b表達水平探討急性腦梗死病人側支循環形成的影響因素

劉相城，付宏，劉春柏，張爽，胡姣月，鮑金，趙增霞，羅翰，符鵬程，劉淑云

作者單位：深圳市龍華區中心醫院神經內科，廣東 深圳 518110

急性腦梗死（acute cerebral infarction，ACI）是神經功能損傷臨床綜合征，主要由腦部血液供應障礙導致大腦缺血缺氧引起［1］，具有較高的發病率和致殘率［2］。研究表明，ACI 的發生、發展及預后與腦動脈側支循環的形成和開放密切相關［3］，腦動脈側支循環的形成能夠促使缺血區域恢復血供，從而降低梗死面積，起到保護腦組織的作用［4］。因此，預測腦動脈側支循環形成情況，在指導ACI 病人臨床治療過程中扮演著極其重要角色。微RNA（miRNA，miR）屬于短鏈非編碼RNA，在真核生物中具有調控功能，包含21～23 個核苷酸序列，可與目標基因mRNA 的3’非翻譯區（UTR）堿基配對結合［5］，參與調控機體多種生物學功能。miR-181b 隸屬于miR-181 家族成員，可調控心血管組織細胞中細胞因子、蛋白酶及相關受體的基因表達，參與心血管疾病的病理過程［6］。因此本研究主要探討miR-181b在早期ACI病人外周血中的表達情況及其表達與病人腦側支循環形成的相關性，分析ACI 病人側支循環形成的影響因素，以期為ACI 的臨床治療提供理論指導。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2015 年6 月至2019 年5 月在深圳市龍華區中心醫院神經內科住院治療的行數字減影血管造影（DSA）檢查符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》［7］診斷標準的ACI 病人175例作為研究對象，男性129 例，女性46 例，病人年齡（58.17±17.96）歲，范圍為29～85 歲。納入標準：（1）納入病人初次發病，且在24 h 內入院治療；（2）納入病人均經核磁共振成像或CT 檢查證實存在責任病灶；（3）就診前2個月病人未服用過他汀類以及促紅細胞生存素藥物。排除標準：（1）出血性腦疾病、腦血管畸形或合并動脈炎者；（2）伴隨有嚴重臟器功能障礙的病人；（3）伴隨有惡性腫瘤、感染及凝血障礙病人；（4）已接受溶栓或取栓治療者；（5）進展性腦梗死、心源性腦梗死或腦梗死后出血轉化者。納入研究對象均簽署知情同意書，獲深圳市龍華區中心醫院倫理委員會批準（批號2015-283-06）。

1.2 臨床資料收集病人臨床資料通過查閱電子病歷獲得，包括病人的性別、年齡、吸煙史、冠心病史、糖尿病史、高血壓史、飲酒史等。入院后，等病人平穩狀態測量血壓記錄收縮壓和舒張壓。入院后次日清晨，空腹（空腹時間在8 h 以上）采集肘靜脈血5 mL，離心獲得血清（離心條件：3 000 r/min，半徑10 cm，15 min），檢測總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、空腹血糖、血同型半胱氨酸（Hcy）、血尿酸、血漿纖維蛋白原（FIB）及C 反應蛋白（CRP）及白細胞計數。其中高血壓定義：既往高血壓病且正在服用降壓藥或者血壓≥140/90 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）；吸煙者定義：目前吸煙或者戒煙不足1個月。

1.3 方法

1.3.1 腦血管造影檢查病人入院第5天行DSA檢查。局麻后行股動脈穿刺，選擇改良Seldinger 穿刺術，穿刺成功后將5F 或8F 動脈鞘置入，靜脈推注肝素2 500 U，然后在主動脈弓中將導絲和5F pigtail導管置入，注射造影劑（碘普羅胺），行主動脈弓造影，觀察主動脈弓及弓上大血管結構，確認無斑塊或狹窄，進行后續操作。pigtail導管從中拔出，然后將5F椎動脈導管分別置于雙側頸總動脈、頸內動脈、外動脈及椎基底動脈，注射碘普羅胺，分別行上述動脈正位、側位及顱內DSA檢查。

1.3.2 腦梗死體積測定病人行DSA 后，進行頭部CT 檢查，測量低密度灶的長寬厚3 徑，然后計算腦梗死灶體積（cm3）=長×寬+CT掃描陽性層數×π/6，若有多個病灶，累加總體積即為腦梗死體積。

1.3.3 定量逆轉錄PCR（quantitative reverse transcription PCR， RT-qPCR）采用RT-qPCR 法檢測血清miR-181b 表達水平，采用Trizol 試劑盒（美國Invitrogen 公司）和miRNeasy Mini Kit 試劑（德國Qiagen 公司）盒提取血清總miRNA，NanoDrop 2000超微量核酸測定儀檢測miRNA 濃度，取2 μg檢驗合格的血清miRNA 采用逆轉錄試劑盒將miRNA 逆轉錄為互補DNA（cDNA），以cDNA 為模板采用SYBR Gene RealtimePCRMaster Mix 進行實時熒光定量PCR 反應。miR-181b 正向引物：5'-AACATTCATTGCTGTCGGTGGG-3'，反向引物：5'-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCAC-3'；U6 正向引物：5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，反向引物：5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。RT-qPCR 在7500實時熒光定量PCR 系統中進行，反應設置如下：95 ℃預變性30 s，95 ℃ 30 s，60 ℃ 34 s，74 ℃ 30 s，38個循環，反應均以U6 為內參，采用2-ΔΔCt算法計算miR-181b的相對表達量。

1.4 評估標準

1.4.1 神經功能缺損評分神經功能采用美國國立衛生研究院卒中量表（NIHSS）評估：NIHSS 評分≤6 分為輕度神經功能損傷；7～14 分為中度神經功能損傷；≥15分為重度神經功能損傷。

1.4.2 血管狹窄程度判定標準頸動脈狹窄程度計算：采用北美癥狀性頸動脈內膜切除試驗［8］，即：狹窄率（%）=（1-最狹窄動脈管徑/正常動脈管徑）×100%。狹窄程度分級：0＜狹窄程度≤29%為輕度狹窄；29%＜狹窄程度≤69%為中度狹窄；69%＜狹窄程度＜100%為重度狹窄；狹窄程度=100%為閉塞。

1.4.3 側支循環形成及血流分級標準［8］前交通動脈開放標準：一側頸內動脈造影見對比劑經前交通動脈顯影對側大腦前、中動脈主干及分支；后交通動脈開放標準：椎動脈造影顯示造影劑通過后交通動脈顯影了頸內動脈主干和分支；吻合側支循環開放標準：包括軟腦膜動脈和眼動脈，經一支動脈的分支或主干通過另一支動脈的尖端逆行形成。

側支循環的開放途徑分為3 個等級［9］。一級：依靠Willis 環的血流代償實現側支循環，包括前、后交通動脈；二級：依靠眼動脈、軟腦膜吻合支及其他相對較小的側支與側支吻合支之間的血流代償實現側支循環；三級：新生血管形成。側支循環血流灌注分級，采用美國放射介入學會（ASITN/SIR）的側支循環評估系統：0 級，完全無側支血流供應；l級，非梗死區域血流緩慢灌注；2 級，非梗死區域血流快速灌注；3 級，梗死區域血流緩慢灌注；4 級，梗死區域血流快速灌注。側支血流0～2級納入側支循環不良組，側支血流3～4級納入側支循環良好組。

1.5 訓練集與測試集分組將175例ACI病人按照3∶1 的比例，采用計算機產生隨機數分為訓練集（129 例）和測試集（46 例），分別用于構建側支循環形成不良預測模型和驗證模型預測效能。兩組病人性別、年齡、身體質量指數和側支循環形成不良比例比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 訓練集與測試集ACI病人一般臨床資料比較

1.6 統計學方法數據分析采用SPSS 23.0 統計軟件。定性資料使用百分數（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。正態分布定量資料以表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；非正態分布定量資料以中位數（第25、75百分位數）［M（P25，P75）］表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。使用Spearman相關性分析檢驗ACI 病人血清miR-181b 表達與側支循環形成的相關性。腦側支循環形成不良因素分析采用logistic 回歸模型。以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ACI 病人臨床資料及側支循環形成情況訓練集中側支循環形成良好病人90例，側支循環形成不良病人39例。單因素分析結果顯示，兩組病人性別、年齡、糖尿病史、飲酒史、病變位置、總膽固醇、收縮壓、舒張壓、三酰甘油、LDL-C、FIB、CRP 和白細胞計數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。側支循環良好組吸煙比例、總膽固醇、高血壓比例、空腹血糖、Hcy、血尿酸、冠心病比例、梗死體積均顯著低于側支循環形成不良組，而腦血管重度狹窄或閉塞病人比例以及miR-181b 相對表達量顯著高于側支循環形成不良組，均差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 訓練集129例ACI病人側支循環形成良好和不良組一般臨床資料比較

2.2 不同側支循環代償ACI病人血清miR-181b表達水平及NIHSS 評分訓練集無側支循環開放病人17 例（13.18%），存在側支循環的病人112 例（86.82%），其中一級側支循環開放病人54 例（41.86%），僅前交通動脈開放者14 例（10.85%），僅后交通動脈開放者17 例（13.18%），前、后交通動脈均開放者23 例（17.83%）；二級側支循環開放病人35 例（27.13%），其中軟膜動脈代償20 例（15.50%），眼動脈代償15 例（11.63%），三級代償病人23 例（17.83%）。和無代償組相比，血清miR-181b水平在一級代償組、二級代償組、三級代償組ACI病人呈現逐步升高趨勢，而NIHSS 評分在三組中呈現逐步下降趨勢，均差異有統計學意義（均P＜0.01），見表3。

表3 訓練集129例不同側支循環開放類型病人血清miR-181b水平及NIHSS評分比較/

表3 訓練集129例不同側支循環開放類型病人血清miR-181b水平及NIHSS評分比較/

注：NIHSS為美國國立衛生研究院卒中量表。

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2.3 ACI 病人腦側支循環形成不良的影響因素將單因素分析中具有顯著性的因素按表4 進行賦值，采用似然比前進法對變量進行篩選，然后納入非條件logistic 多因素分析，結果顯示，高血壓史、Hcy、后循環病變均為腦梗死病人側支循環形成不良的獨立危險因素；miR-181b 相對表達量和腦血管狹窄程度為側支循環形成不良的保護因素，見表5。

表4 ACI病人129例側支循環形成不良影響因素賦值量表

表5 訓練集129例ACI病人側支循環形成不良多因素分析

2.4 血清miR-181b 水平與病人側支循環形成的相關性分析Spearman 相關性分析結果顯示，血清miR-181b 表達水平與ACI 病人腦側支循環形成情況呈顯著正相關（r=0.77，P＜0.001）。

2.5 ACI 病人側支循環形成不良的預測模型建立根據logistic回歸分析結果，側支循環形成不良預測值=EXP［0.491-1.914（高血壓史）-1.409（Hcy）+2.145（miR-181b 相對表達量）-1.286（后循環病變）+0.594（腦血管狹窄程度）］/1+EXP［0.491-1.914（高血壓史）-1.409（Hcy）+2.145（miR-181b 相對表達量）-1.286（后循環病變）-0.594（腦血管狹窄）］。該模型曲線下面積（AUC）為0.88［95%CI：（0.84，0.92）］。測試集ACI病人側支循環形成不良預測模型AUC為0.80［95%CI：（0.76，0.88）］。兩組病人AUC 比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

ACI 是臨床常見的腦卒中類型，是一種常見的腦部血液循環障礙類疾病，其發病原因主要是腦供血血管的狹窄或閉塞，而側支循環形成可以在一定程度上改善缺血部位供血，從而發揮保護腦組織的功能［10］。伴隨著我國老齡化加劇以及飲食結構的改變，ACI 發病率呈現逐年遞增趨勢。miRNA 可調控蛋白表達并具有較高的穩定性，在血管內皮細胞增殖、凋亡等生物學過程中扮演重要角色發揮作用［11］。miR-181b 為內源性短小RNA，參與動脈粥樣硬化、心肌纖維化、主動脈瓣膜病等疾病的病理過程。祁緣、荊黎［6］的研究表明認為miR-181b 在心血管疾病的調控過程中扮演著極其重要角色。劉振等［12］的研究發現，沉默LncRNA SNHG7 通過調控可通過調控miR-181b表達參與到心肌損傷修復過程。以上結果提示miR-181b 參與調控心血管疾病的病理過程，但miR-181b 在ACI 病人外周血中的表達及其表達水平與腦側支循環形成的關系還鮮有報道。

本研究排除性別、年齡等一般臨床資料的影響后發現，側支循環形成不良組血清miR-181b相對表達量顯著低于側支循環形成良好組。通常將腦側支循環分為三級：當腦動脈發生狹窄或閉塞時，Willis 環即前、后交通動脈開放，此時新建立的側支循環可以幫助腦動脈系統向患側供應血液，然而如果一級代償無法提供足夠代償時，軟膜動脈、眼動脈及其他較小的側支代償成為二級代償，三級代償指腦缺血或梗死區域周圍形成新生血管［13］。本研究結果表明，一級側支循環開放率（41.86%）顯著高于二級代償（21.73%）和三級代償（17.83%），提示一級側支循環開放為ACI病人腦動脈狹窄或閉塞時的主要代償方式。和無代償組相比，血清miR-181b水平在一級代償組、二級代償組、三級代償組當中呈現逐步增加的趨勢，而NIHSS 評分則在三組當中呈現逐步下降趨勢。Spearman 相關性分析結果顯示，血清miR-181b 表達水平與腦側支循環形成情況呈顯著正相關，上述結果表明血清miR-181b水平高低與ACI病人側支循環形成良好程度關系密切。

眾所周知，腦側支循環的形成過程當中會受到多種因素影響，本研究單因素分析結果顯示，吸煙、總膽固醇、空腹血糖、高血壓史、Hcy、血尿酸、梗死體積、冠心病史、血清miR-181b 表達水平及腦血管重度狹窄程度均為ACI病人側支循環形成不良的影響因素，隨后將單因素分析P＜0.05 的指標納入到多因素logistic 模型當中分析，結果發現miR-181b相對表達量、腦血管狹窄程度為ACI 病人側支循環形成不良的保護因素，高血壓史、Hcy、后循環病變為ACI病人側支循環形成不良的獨立危險因素，因此在臨床實際工作當中，應該時刻關注病人的miR-181b水平、腦血管狹窄程度、高血壓史、Hcy、后循環病變情況，提前干預，做好預防。研究表明，高血壓對軟腦膜側支重塑具有抑制作用，不利于側支循環形成［14］。Hcy 為敏感的炎性因子，可釋放大量氧自由基及過氧化物，對人體抗氧化機制產生抑制作用，高Hcy 水平是心腦血管病的危險因素［15-16］。與前循環病變比較，后循環病變時側支循環開放的途徑較少，因此后循環病變ACI 病人更容易側支循環形成不良［17］。腦血管狹窄是腦側支循環形成的重要影響因素［18］，腦血管輕度或中度狹窄時，腦組織依靠自身彈性及神經調節恢復缺血區血流，側支循環代償較少，重度狹窄或閉塞時，低灌注的加重導致壓力差出現，腦側支循環代償開放較多［19］。根據訓練集中logistic回歸分析結果構建ACI病人側支循環形成不良預測模型，該模型AUC 為0.88［95%CI：（0.84，0.92）］，對ACI病人側支循環形成不良具有較好的預測價值。

綜上所述，側支循環良好病人外周血血清miR-181b 表達水平較高，腦血管狹窄程度輕和高水平miR-181b 為側支循環形成不良的保護因素，而高血壓史、Hcy、后循環病變均為腦梗死病人側支循環形成不良的獨立危險因素，當然本研究也存在一定的不足之處，本研究屬于單中心研究，納入研究對象可能不足，導致部分結果存在偏倚，因此下一步我們將開展多中心大樣本研究，從而對本研究成果進一步地驗證。