酸棗仁中摻理棗仁的高效液相色譜法鑒別方法研究

張艷慧，付萍萍，汪安，張明童，王楠，李家港

作者單位：1保定市食品藥品檢驗所，河北 保定 071000；2池州市質量監督檢驗研究院，安徽 池州 247100；3甘肅省藥品檢驗研究院（甘肅省中藏藥檢驗檢測技術工程實驗室，國家藥品監督管理局中藥材及飲片質量控制重點實驗室），甘肅 蘭州 730070

酸棗仁收載于《中國藥典》2020 年版一部，來源為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟種子［1］，具有養心補肝，寧心安神，斂汗，生津的功效［2］。近年來酸棗仁藥材資源緊缺，價格昂貴，質量參差不齊，摻偽現象頻發。比較常見的有同科植物滇刺棗Ziziphus.mauritianaLam.的成熟種子，以滇棗仁、緬棗仁或理棗仁之名混充酸棗仁［3］。目前關于二者的摻偽研究很少，中國食品藥品檢定研究院劉薇等［4］在中藥酸棗仁的真偽鑒別方法研究中報道過，酸棗仁與理棗仁在化學成分上有明顯的差異，但未指出具體的化學成分。查閱相關文獻［5-6］，成功提取出6'''-芥子酰斯皮諾素，采用高效液相色譜法（HPLC）測定其含量，該成分在酸棗仁與理棗仁藥材中的含量存在很大的差異，該方法靈敏度高、準確度好且易于推廣，可有效解決酸棗仁摻偽理棗仁的問題。本研究起止時間為2020年12月至2022年12月。

1 儀器與試藥

1.1 儀器LC-2010A 高效液相色譜儀（日本島津公司），BP211D 型電子天平（精度為萬分之一）［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］，索式提取器（天津市北方玻璃儀器）。

1.2 試劑、試藥6'''-芥子酰斯皮諾素對照品（第三方公司提純，含量以94.8%計）；乙腈（默克化工技術（上海）有限公司，批號11166230132）為色譜純，水（高碑店娃哈哈宏振食品飲料有限公司，批號3119GH）為超純水，其他試劑均為分析純；酸棗仁藥材（10 批次），理棗仁藥材（10 批次），經河北省藥品醫療器械檢驗研究院段吉平主任藥師鑒定，見表1。

表1 酸棗仁和理棗仁藥材樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件色譜柱：Agela Venusil ASB C18 柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流動相：乙腈為流動相A，0.2%甲酸水溶液為流動相B，梯度洗脫條件見表2。檢測波長：335 nm；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；對照品溶液進樣量：10 μL，供試品溶液進樣量：20 μL；理論塔板數均不低于2 000。

表2 梯度洗脫條件

2.2 溶液的制備對照品溶液的制備：取對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 毫升含0.231 6 mg 的溶液，作為對照品儲備液。精密量取上述對照品儲備液3 毫升至10 毫升量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

供試品溶液的制備：取本品粉末（過四號篩），精密稱取2 g，置索氏提取器中，加石油醚（60～90 ℃）80 mL，回流4 h，棄去石油醚液，藥渣揮去溶劑，轉移至錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱定質量，回流2 h，放冷，再稱定質量，加70%的乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液25 mL，回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解，轉移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液［7］。

2.3 方法學考察線性關系考察：取對照品儲備液逐級稀釋得6 個質量濃度水平的對照品稀釋液，按“2.1”項下色譜條件測定，以對照品濃度為橫坐標（X），峰面積積分值為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得到回歸方程Y=187 507X+17 896，線性范圍為2.32～138.96 μg/L，相關系數（r）=1，表明方法線性關系良好［8］。

精密度試驗：精密吸取“2.2”項下同一對照品溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6 次測定，結果峰面積的相對標準偏差（RSD）為0.28%（n=6），表明儀器精密度良好［9］。

重復性試驗：取同一批（批次為L9，S4）樣品各6份，精密稱定，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，結果含量的RSD分別為1.51%、1.83%（n=6），表明方法重復性良好［10］。

定量限（LOQ）和檢測限（LOD）：將“2.2”項下的對照品溶液逐級稀釋，并依次進樣測定。按信噪比（S/N）=10 計算，該方法測定6'''-芥子酰斯皮諾素的定量限為2.08 μg/L；按S/N=3計算，該方法測定6'''-芥子酰斯皮諾素的檢測限為0.69 μg/L。

穩定性試驗：將供試品溶液（批次為L9，S4）在0、1、2、4、8、16、24 h 分別進樣測定，結果峰面積的RSD 為0.26%、0.33%（n=7），表明供試品溶液在24 h內穩定［11］。

加樣回收試驗：分別精密稱取已知含量的理棗仁和酸棗仁（批次L9、S4）（過四號篩）1 g，分成兩組，每組6 份，分別精密加入定量的對照品儲備液，按“2.1”項下色譜條件測定，并計算6'''-芥子酰斯皮諾素的加樣回收率［12］。理棗仁回收試驗結果見表3，酸棗仁回收實驗結果見表4。

表3 理棗仁6'''-芥子酰斯皮諾素回收試驗結果（n=6）

表4 酸棗仁6'''-芥子酰斯皮諾素回收試驗結果（n=6）

2.4 樣品含量測定（1）取不同批次酸棗仁（S1～S10）及理棗仁（L1～L10）樣品各2.0 g，精密稱定，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量，結果見表5。

表5 酸棗仁和理棗仁樣品測定6'''-芥子酰斯皮諾素結果/%

（2）取不同批次酸棗仁（S1～S10）分別加入理棗仁（L9），理棗仁占總質量的3%，取上述10份樣品各2.0 g，精密稱定，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量，結果見表6。

表6 酸棗仁3%摻偽樣品（理棗仁）10份測定6'''-芥子酰斯皮諾素結果/%

3 討論

3.1 提取方法的選擇本方法是在《中國藥典》2020 年版一部酸棗仁含量測定方法的基礎上加以改善而成。該方法通過定量加入70%乙醇，定量吸取濾液，可有效避免供試品溶液的損失，且該方法更簡單、重現性好、回收率高。

3.2 選取“酸棗仁3%摻偽樣品”作為判定依據的理由《中國藥典》2020 年版四部 0212 藥材和飲片檢定通則規定：除另有規定外，飲片中藥屑及雜質通常不得過3%，故選取“酸棗仁3%摻偽樣品”作為判定依據。

3.3 耐用性試驗按照《中國藥典》2020 年版四部9101 分析方法驗證指導原則的要求，對方法的耐用性進行考察。首先，選用了3種品牌的色譜柱，分別為Agela Venusil ASB C18 柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）、ShimNex CS C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Kromasil 100-5C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），結果不同色譜柱測定的6'''-芥子酰斯皮諾素含量差異不大，RSD＜2.0%。其次，選取了3 個品牌的高效液相色譜儀，分別為島津2010AHT、Agilent1260、Waters2695，結果不同儀器測得數據的RSD＜1.5%。同時檢測不同柱溫，不同流量，不同流動相比例，結果試驗中測得的數據RSD＜2.0%［13］。

3.4 樣品收集本次實驗共收集到酸棗仁樣品10批次［14］，產地覆蓋東北、河北、山東、山西、陜西、甘肅等幾大產區；理棗仁樣品10次，經市場調研，目前理棗仁樣品為越南進口品種，為了保證所用樣品具有代表性，分批次從不同商戶手中購買。

3.5 結果判定經實驗檢測其在酸棗仁中含量范圍為0.003 3%～0.005 1%，在理棗仁中含量范圍為0.050 6%～0.066 0%，3%摻偽樣品中含量范圍為0.005 0%～0.007 2%。由上述數據可判定，當樣品含量高于0.007 2%時，即可判定酸棗仁樣品中摻有理棗仁。

3.6 方法評價改進方法操作簡單［15］，樣品前處理方便，準確性好，回收率高，可靠性強，成功率高，對酸棗仁的質量控制［16］具有一定科學價值，經初步研究，此方法可適用于膠囊劑中酸棗仁藥材的摻偽鑒別，為中成藥中酸棗仁摻偽鑒別奠定科學依據［17］。