棉花根際真菌中拮抗菌的篩選鑒定

于欣茹

（阜陽市農業科學院，安徽 阜陽 236065）

大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）是由土壤傳播的病原菌，可導致棉花黃萎病，常存在于寄主植物的維管束系統中，一般殺菌劑無法接觸到病原體[1]。赤霉病由多種鐮刀菌侵染引起，病原菌主要以菌絲體在寄主病殘體或種子上越夏過冬，也可在土壤中營腐生生活過冬[2]。棉花與其根際真菌的共生關系使棉花獲得對病原體的一定抗性，同時可改善其發育過程和提高產量，促進養分吸收和提高肥料使用效率。研究表明，木霉（Trichodermasp.）作為低成本、有效和環保的生物防治劑，可在各種病理系統中建立自己的位置，對土壤平衡的影響較小，且不會損害控制病原體的有益生物[3]。黑曲霉（Aspergillus niger）作為一種植物溶磷真菌，可用作潛在的生物肥料，能增加土壤磷酸鹽對植物的生物有效性[4]。通過調整土壤微生物的生態，將生防菌株制成有機肥來創造良好的根際微生物環境，以達到防控土傳病害的研究在當前備受關注。利用有益微生物防治植物病害是切實可行的策略之一，尋找環境中高效、多功能的生防微生物是目前棉花黃萎病及赤霉病等病害防治的發展方向之一。本試驗從中棉所08 等6 個陸地棉品種的根際土壤中分離出真菌，并篩選出拮抗赤霉病菌和大麗輪枝菌，且對棉花種子安全性無影響的真菌，為提高生物防治真菌利用效率提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中棉所08、中棉所41、中植棉2、冀棉11、魯棉研28 和魯棉研21植株的根際土壤；病原菌株為赤霉病菌（Fusarium graminearum）F0609、大麗輪枝菌V1070；蘇棉9號種子。

硫酸卡那霉素（Kanamycin），利福平（Rifampicin），Maker DL2000（TaKaRa公司），PCR相關試劑購自南京諾唯贊公司。

無菌操作臺，高壓蒸氣滅菌鍋，電泳儀（EPS601型），PCR儀，光學顯微鏡（南京江南永新），掃描電鏡（日立S-3000N，日本Hitachi）。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同棉花品種根際真菌的分離刮取不同棉花品種根表附著的土壤，用無菌水制成懸浮液（1 g土壤溶于100 mL水中），搖勻靜置取上清液，用梯度稀釋法涂布在有硫酸卡那霉素（50 mg/L）和利福平（50 mg/L）的馬鈴薯瓊脂培養基（Potato Glucose Agar，PDA）平板上，每個品種3次重復。選取合適的濃度（每皿30～300 個菌落）對菌落計數，根據平板上菌落的顏色、形態和大小等挑取不同單菌落，平板劃線純化后4 ℃保存。

1.2.2 根際真菌對赤霉病菌的拮抗作用用異步培養法于PDA 平板中心接種直徑5 mm 赤霉病菌F0609 菌餅，28 ℃培養2 d 后，在距菌餅1 cm 處的四周接種分離得到的根際真菌，28 ℃恒溫箱中培養，以不接種根際真菌為對照。當對照赤霉病菌F0609 長至培養皿邊緣時，測量抑菌率。每菌株重復3次。

抑菌率（%）=1－處理病原菌的直徑÷對照病原菌的直徑×100。

1.2.3 根際真菌的鑒定將分離到的菌株在PDA平板上培養，顯微鏡下觀察菌絲和孢子，參照《真菌鑒定手冊》[5]進行形態學鑒定。

依據各品種根際真菌優勢種群和抑菌率效果，提取抑菌率高的菌株基因組DNA 進行分子生物學鑒定。采用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）擴增菌株的18S rDNA序列。

PCR反應體系：2×High Fidelity Mix12.5 μL引物（20 μmol/L）1.0 μL DNA模板1.0 μL超純水9.5 μL總體積25.0 μL

PCR 反應條件：98 ℃預變性2 min，98 ℃變性45 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30個循環，最后72 ℃延伸10 min。

PCR 產物委托第三方公司南京擎科進行測序，將測序結果提交到NCBI 數據庫并進行BLAST比對。

1.2.4 根際真菌對大麗輪枝菌V1070的拮抗作用鑒定將已鑒定的10 株真菌分別與大麗輪枝菌V1070 進行平板對峙試驗，在PDA 平板上間隔3 cm接根際真菌和大麗輪枝菌V1070菌餅（直徑5 mm），28 ℃培養5 d，每天觀察記錄抑菌率，選出抑菌率較高的真菌。

1.2.5 根際真菌對大麗輪枝菌V1070 菌絲的影響從對峙的平板上挑取大麗輪枝菌V1070和拮抗真菌間接近但不接觸的菌絲，用光學顯微鏡和掃描電鏡觀察，以平板上單獨生長的大麗輪枝菌V1070菌絲做對照。

1.2.6 根際真菌對種子發芽的安全性測驗將黑曲霉An1 菌株于馬鈴薯瓊脂培養液中培養（28 ℃，150 rpm）48 h，過濾除去黏連菌絲。用純水將濾液稀釋10倍浸泡蘇棉9號種子8 h，對照組用無菌水浸泡。在滅菌的營養土和蛭石為1∶3 的基質中播種100粒，以露白5 mm作為發芽指標，3 d后開始計數發芽率和鮮重并拍照。

2 結果與分析

2.1 根際真菌對赤霉病菌F0609的拮抗作用

用十字交叉法計算抑菌率，結合形態學鑒定，發現不同棉花品種根際真菌中優勢種群相同，對赤霉病菌F0609 有拮抗效果的大多數是曲霉屬、青霉屬和木霉屬（圖1）。其中，中棉所08 根際真菌的平均抑菌率為35.31%，中棉所41 為30.28%，中植棉2 號21.50%，魯棉研28 為26.39%，魯棉研21 為12.06%，冀棉11 為20.33%。即棉花根際土壤中存在對赤霉病菌F0609 有拮抗效果的土壤真菌，中棉所08和中棉所41中選取的菌株平均抑菌率較高。

圖1 各品種棉花根際真菌拮抗赤霉菌F0609的分離

2.2 根際真菌測序及鑒定

選取拮抗赤霉病菌F0609效果好的10個根際真菌菌株，標號1—10（圖2），提取18S rDNA送南京擎科公司測序。在BLAST上檢索同源性（表1），10個拮抗真菌菌株包括5個屬，其中曲霉屬有5個，為優勢種群，青霉屬1個，木霉屬1個，鐮刀霉屬2個，被孢霉屬1個。

表1 10株根際真菌的18S rDNA部分序列分析

圖2 菌液18S rDNA擴增產物凝膠電泳結果

2.3 根際真菌對大麗輪枝菌V1070的拮抗作用

將已鑒定的10 株真菌分別與大麗輪枝菌V1070 進行平板對峙試驗，篩選出抑菌率較高的菌株4 株，分別為來自中棉所08 的黑曲霉An1、來自魯棉研21 的棘孢木霉Tr1、來自魯棉研21 的層出鐮孢霉Fu1 和來自冀棉11 的高山被孢霉Mo1，分別與大麗輪枝菌V1070 在PDA 培養基上對峙培養，觀察到4種根際真菌對大麗輪枝菌V1070有不同程度的拮抗效應（圖3），其中，黑曲霉菌An1 和棘孢木霉Tr1對大麗輪枝菌V1070的抑制效應最強，An1對大麗輪枝菌V1070 的平均抑菌率達91%，Tr1 為87%，高山被孢霉Mo1 為76%，層出鐮孢霉Fu1 抑制率為70%。這4 種真菌均有作為生物防治真菌應用的潛力。

圖3 4種棉花根際真菌對大麗輪枝菌V1070的拮抗作用

2.4 根際真菌對大麗輪枝菌V1070菌絲的影響

用光學顯微鏡和掃描電鏡觀察平板上接近而不接觸的菌絲。用光學顯微鏡可看到黑曲霉An1對大麗輪枝菌V1070造成不同程度的損傷，表現為菌絲變細長，褶皺變多，菌絲有孔洞和斷裂，促進產孢，分生孢子變多（圖4A）。用掃描電鏡可以看到菌絲分支增多，各部位都有膨大跡象，內含物質露出，細胞質外泄變得透明卷曲，菌絲體呈念珠狀且頂端細胞變形膨大，形成球狀空泡（圖4C）。說明黑曲霉An1在平板上通過影響大麗輪枝菌V1070的發育進程，從而產生競爭性抑制。

圖4 An1與V1070對峙培養12 h后對菌絲和孢子形態的影響

2.5 黑曲霉An1對棉花種子發芽的影響

經黑曲霉An1處理的蘇棉9號棉花種子5 d 后發芽率為55%，10 d后鮮重2.9 g/株，對照組5 d后發芽率54.6%，10 d 后鮮重2.3 g/株（圖5），表明黑曲霉An1 處理對蘇棉9號種子發芽及幼苗鮮重積累的影響均不明顯。

圖5 黑曲霉An1對種子發芽的影響

3 結論與討論

相關研究表明，許多絲狀真菌，例如里氏木霉（Trichoderma reesei），能分泌多種纖維素分解酶，可以抑制病源真菌的生長，破壞細胞新物質沉積，從而導致菌絲體從頂端破碎，內容物外泄，直至死亡[6]。從多種植物根際土壤可分離到對根癌農桿菌有明顯抑制效果的黑曲霉[7]。新陸中37棉花根際土壤中篩選的4 株粉紅粘帚霉（Clonostachys rosea）、3 株高山被孢霉（Mortierella alpina）以及1 株球毛殼菌（Chaetomium globosum）對大麗輪枝菌均有一定的拮抗作用[8]。來源于土壤的菌株赭曲霉（Aspergillus ochraceus）AAM-1 對大腸埃希氏菌和白菜黑腐病菌顯示較好的抑菌效果[9]。木霉和青霉混合施用使小麥紋枯病和赤霉病發病率明顯降低[10]。黑曲霉孢子的代謝產物對青枯雷爾氏菌和軟腐歐文氏菌有顯著的拮抗活性[11]。健康棉株的內生真菌鐮孢鐮刀菌CEF559 對黃萎病有生物防治潛力，CEF559 可完全抑制大麗輪枝菌分生孢子的產生，溫室研究中，CEF559 對青枯病的防治效果大于60%[12]。從鳳凰木的根際土壤中分離的曲霉屬真菌得到化合物，對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和近平滑念珠菌有抗菌活性[13]。大量具有生防潛力的根際微生物棲息在根表，能更好地定殖在植株根系，且安全無污染，同時可以避免類似化學藥劑施用后病原菌產生的抗性問題[14]。

由于拮抗赤霉菌的真菌報道較少，因此先篩選抗赤霉菌的根際真菌，再篩選抗大麗輪枝菌的根際真菌。本研究從6個陸地棉品種（中棉所08、中棉所41、中植棉2、冀棉11、魯棉研28 和魯棉研21）的根際土壤中，分離出64 株對赤霉病菌F0609 具有抑制作用的真菌，選取10 株進行測序鑒定，其中黑曲霉An1、棘孢木霉Tr1、層出鐮孢霉Fu1 和高山被孢霉Mo1，對大麗輪枝菌V1070 的抑制率分別為91%、87%、76%和70%。用掃描電鏡觀察拮抗真菌黑曲霉An1 對大麗輪枝菌V1070 菌絲的影響，發現黑曲霉An1使大麗輪枝菌V1070形態異常，孢子破裂，生長受到抑制。用黑曲霉An1 處理棉花的種子，發現其對棉花種子發芽率和鮮重無明顯影響。下一步研究將圍繞幾種真菌的拮抗機制及具體生防應用展開，為提高生防菌的利用效率提供參考。