腎著湯促進小鼠坐骨神經(jīng)損傷后髓鞘再生作用的研究

接琳琳，于 寧，孫秀玲，張彩霞，張 淼

（1.山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，山東 煙臺 264199；2.煙臺市煙臺山醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 煙臺 264001）

坐骨神經(jīng)損傷是一種臨床常見病，預(yù)后差、恢復(fù)慢、病后伴長期神經(jīng)性疼痛，甚至?xí)斐捎谰眯赃\動能力損傷，給患者造成心理障礙，也給社會帶來重大負擔(dān)[1]。臨床對于坐骨神經(jīng)損傷的治療方法眾多，如西醫(yī)療法[2]、中醫(yī)中藥[3]、干細胞[4]等。髓鞘結(jié)構(gòu)異常可導(dǎo)致多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如神經(jīng)病理性疼痛[5]等。雪旺細胞是構(gòu)成周圍神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的膠質(zhì)細胞，其形成的髓鞘包膜可促進軸突存活和生長，進而促進損傷神經(jīng)的修復(fù)[6]。Wang等[7]發(fā)現(xiàn)姜黃素通過調(diào)控RUNX家族轉(zhuǎn)錄因子2來增強雪旺細胞的增殖和髓鞘化，進而修復(fù)損傷的坐骨神經(jīng)。

腎著湯記載自《金匱要略》中，又稱甘草干姜茯苓白術(shù)湯，其組成為甘草、白術(shù)、干姜和茯苓，功效為祛寒除濕，主治腎著病。趙天才等[8]認為該病是因素體虛弱、正氣不足、滕理不密、衛(wèi)外不固、寒濕之邪乘虛而入，注于經(jīng)絡(luò)、留于關(guān)節(jié)，使陽氣痹阻于腰部而發(fā)病。名方選解中有關(guān)于腎著湯可用于治療坐骨神經(jīng)痛的報道[9]。甘草、白術(shù)、干姜、茯苓等四味中藥辛溫甘淡，方中以干姜為君，取其辛熱之性，溫中祛寒；以茯苓為臣，淡滲利濕。兩者配伍，一熱一利，熱以勝寒，利以滲濕，寒去濕消，則病本得除。佐以白術(shù)健脾燥濕，以助除濕；使以甘草調(diào)諸藥而和脾胃。四藥配合，共奏祛寒除濕之效，寒濕盡去，則冷重自愈。

研究檢測應(yīng)用腎著湯后髓鞘的損傷和再生的表達變化，以期從神經(jīng)再生和功能恢復(fù)的角度分析腎著湯對坐骨神經(jīng)損傷的作用，為闡明腎著湯在坐骨神經(jīng)損傷后髓鞘再生機制提供實驗依據(jù)，并為臨床治療坐骨神經(jīng)損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和造模腎著湯制備：方劑組成為甘草 6 g、白術(shù) 6 g、干姜 12 g、茯苓 12 g，加入1 000 mL水煎至600 mL，分裝至于4 ℃冰箱備用。對實驗7 d組小鼠灌胃3次/d，早中晚各1次。

造模：24只成年雄性昆明小鼠，研究過程遵循國際通行的動物福利和倫理準(zhǔn)則。以隨機數(shù)字表法分為正常組、對照7 d組（損傷）、實驗7 d組（損傷后予以腎著湯灌胃）。正常組不做任何處理，其余2組使用10%水合氯醛進行麻醉后暴露坐骨神經(jīng)，使用血管鉗交替夾住和松開1 cm長坐骨神經(jīng)3次，夾住10 s后松開30 s，再制作坐骨神經(jīng)損傷模型。對照7 d組制作坐骨神經(jīng)損傷模型后，每天正常飼養(yǎng)；實驗7 d組在對照7 d組基礎(chǔ)上，早中晚各予以灌胃腎著湯。

電鏡觀察：取材后，一部分坐骨神經(jīng)使用1%四氧化鋨酸固定，用于電鏡觀察。取小鼠坐骨神經(jīng)修剪成 1 mm3立方體，在4 ℃的2.5%戊二醛溶液內(nèi)固定過夜。第2天使用1%四氧化鋨酸固定3 h后，依次浸入乙醇、丙酮中，包埋、切片，最后采用鈾染色，并于透射電子顯微鏡下觀察。

染色觀察：一部分坐骨神經(jīng)用4%多聚甲醛固定后，進行包埋后切片。伊紅染色法（HE染色）：將切片脫蠟處理后放入蘇木精水溶液中染色3 min，氨水中分色10 s。流水沖洗后放入酒精中梯度脫水，酒精伊紅染色液染色2～3 min，再經(jīng)二甲苯透明后中性樹膠封片。勞克堅牢藍(luxol fast blue)染色：將切片脫蠟處理后，放入Luxol Fast Blue染色液室溫過夜，將切片放入95%乙醇洗掉多余染色液后蒸餾水沖洗。分色液分色15 s后，70%乙醇分色30 s 至灰白質(zhì)清晰，蒸餾水沖洗，再入伊紅染色液體，后脫水、透明，封片。

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察坐骨神經(jīng)損傷后髓鞘的形態(tài)學(xué)改變HE染色中可見正常組坐骨神經(jīng)髓鞘排列規(guī)則緊密，見圖1-a；在對照7 d組的坐骨神經(jīng)中髓鞘出現(xiàn)形態(tài)變化，雜亂無章，部分區(qū)域出現(xiàn)脫髓鞘現(xiàn)象，見圖1-b；實驗7 d組髓鞘結(jié)構(gòu)開始修復(fù)，髓鞘結(jié)構(gòu)排列較緊密，見圖1-c。

圖1 HE染色中各組坐骨神經(jīng)損傷后髓鞘的形態(tài)學(xué)改變（×400）

2.2 電鏡觀察坐骨神經(jīng)損傷后髓鞘的形態(tài)學(xué)改變電子顯微鏡圖像顯示正常組坐骨神經(jīng)髓鞘呈同心圓層狀排列，結(jié)構(gòu)致密且清晰，見圖2-a；在對照7 d組的坐骨神經(jīng)中髓鞘出現(xiàn)形態(tài)變化，同心圓層狀出現(xiàn)折疊、雜亂無章，部分區(qū)域出現(xiàn)空泡、脫髓鞘的現(xiàn)象，見圖2-b；實驗7 d組髓鞘結(jié)構(gòu)開始修復(fù)，髓鞘松解情況改善，見圖2-c。

圖2 電鏡下各組坐骨神經(jīng)損傷后髓鞘的形態(tài)學(xué)改變（×400）

2.3 勞克堅牢藍染色觀察坐骨神經(jīng)損傷髓鞘的改變勞克堅牢藍染色結(jié)果顯示，正常組髓鞘呈藍色，結(jié)構(gòu)清晰完整，無髓鞘脫失，見圖3-a；對照7 d組中可見藍色區(qū)域極少，可見廣泛性脫髓鞘區(qū)域，見圖3-b；實驗7 d組切片中藍色區(qū)域明顯增多，髓鞘結(jié)構(gòu)可見，藍染髓鞘增多，見圖3-c。

圖3 勞克堅牢藍染色中各組坐骨神經(jīng)損傷后髓鞘的形態(tài)學(xué)改變（×400）

3 討論

坐骨神經(jīng)損傷是臨床上一種常見疾病，損傷中可見結(jié)締組織、髓鞘和軸突等多種損傷，通常會導(dǎo)致嚴(yán)重的功能障礙甚至永久性殘障。雪旺細胞的高度可塑性是創(chuàng)傷性損傷和周圍神經(jīng)病變后再生的關(guān)鍵因素。較嚴(yán)重的周圍神經(jīng)損傷，如撕脫傷、撕裂傷和挫傷，因介導(dǎo)再生所需的雪旺細胞損傷或死亡而受到影響，甚至由于雪旺細胞再生速度緩慢，遠端神經(jīng)再生可能需要數(shù)月或數(shù)年，甚至可能最終喪失再生能力[10-11]。盡管現(xiàn)代診斷和顯微外科技術(shù)進步，但坐骨神經(jīng)修復(fù)后的功能恢復(fù)往往不夠理想。

現(xiàn)代臨床對于坐骨神經(jīng)損傷治療手段眾多，其中髓鞘的清除和再生是促進神經(jīng)修復(fù)的有效方式。研究發(fā)現(xiàn)，在坐骨神經(jīng)損傷模型中，7，8-二羥基香豆素可促進髓鞘的再生和損傷神經(jīng)的恢復(fù)[12]。香菇多糖主要通過加速雪旺細胞中髓鞘碎片的自噬清除來促進神經(jīng)再生，這個過程可能受到AMPK/mTOR信號通路的調(diào)控[13]。姜黃素可通過調(diào)控RUNX家族轉(zhuǎn)錄因子2來增強雪旺細胞的增殖和髓鞘化，進而促進損傷坐骨神經(jīng)的修復(fù)[7]。

腎著湯在臨床已得到廣泛應(yīng)用，但目前尚無對于腎著湯治療坐骨神經(jīng)損傷具體機制的研究。本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用腎著湯7 d后，髓鞘開始增生，而未用藥組髓鞘修復(fù)時間則大大延長。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，干姜的主要化學(xué)成分是以α-姜烯為主的多種揮發(fā)油，有抗炎、殺菌等作用[14]，此外在治療腰椎間盤突出癥中發(fā)現(xiàn)干姜中的姜黃素既可介導(dǎo)炎癥因子的表達，又可激活更多的活性氧和細胞凋亡[15]。茯苓中的三萜類和多糖類物質(zhì)也有很好的抗炎、增強免疫功能的作用[16]。白術(shù)中的白術(shù)內(nèi)酯類在抑制神經(jīng)細胞凋亡方面具有明顯作用，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ可抑制線粒體裂變緩解神經(jīng)炎癥[17]。甘草中的黃酮類化合物具有抗炎、神經(jīng)保護、提高免疫力等多種作用。腎著湯具有重要的神經(jīng)保護、抗氧化、抗炎作用，已通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在治療腰椎間盤突出治療中得到證實[18]。

多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病均伴隨髓鞘結(jié)構(gòu)異常，如阿爾茨海默病、佩-梅病和神經(jīng)病理性疼痛[5]。周圍神經(jīng)如視神經(jīng)、動眼神經(jīng)、坐骨神經(jīng)損傷與修復(fù)中，均可見髓鞘結(jié)構(gòu)的改變[19]。

本研究采用小鼠坐骨神經(jīng)損傷作為周圍神經(jīng)損傷的模型，在HE和電鏡下均明顯觀察到對照7 d組坐骨神經(jīng)髓鞘出現(xiàn)折疊、雜亂無章甚至脫髓鞘的表現(xiàn)。腎著湯灌胃7 d后髓鞘開始改善，勞克堅牢藍染色同樣可見腎著湯灌胃后藍染區(qū)域增多，與對照7 d組比較，髓鞘再生明顯。研究發(fā)現(xiàn)，修復(fù)型雪旺細胞可通過作用于c-Jun蛋白、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路、音猬因子（SHH）的遺傳因子、染色質(zhì)的修飾控制、調(diào)節(jié)修復(fù)程序，促進神經(jīng)元存活、受損軸突崩解、髓鞘清除、軸突再生并引導(dǎo)至其前靶標(biāo)，最終促進軸突的再生[20-21]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明腎著湯有重要的神經(jīng)保護、抗氧化、抗炎的作用[18]，且腎著湯為《金匱要略》[22-25]中用于治療寒濕滯著下焦所致腎著病的經(jīng)典名方,其用藥組方充分體現(xiàn)了張仲景治病求本、重視脾胃、因證制宜、祛邪安正等治療思想，而張仲景對于腎著病因病機的剖析以及在詳審腎著病機病位后所采用的理中焦、顧下焦的靈活治法，對后世中醫(yī)臨床治療雜病極具指導(dǎo)意義，值得后輩醫(yī)者在實際運用中學(xué)習(xí)借鑒。

綜上所述，腎著湯對坐骨神經(jīng)損傷后髓鞘再生有促進作用，腎著湯的作用機制是今后的研究方向。