急性心肌梗死中環狀RNA CDR1as位點篩選的研究

唐賽賽，孫秀梅，王海鳳，許夢婷，林 浩，李文勇

（1.山東中醫藥高等專科學校，山東 煙臺 264199；2.濱州醫學院煙臺附屬醫院檢驗科，山東 煙臺 264100；3.濱州醫學院煙臺附屬醫院腫瘤科，山東 煙臺 264100）

心肌梗死（myocardial infarct，MI）發病率逐年升高，且呈年輕化趨勢。近年來，一些個體中已有明顯的家族遺傳表現，提示遺傳因素在誘發MI過程發揮重要作用，而基因多態性是決定這種遺傳性的重要因素。因此，進行單核苷酸多態性（SNP）對比研究，可確定SNP位點與疾病發生風險關系[1-2]。位于X染色體q27.1的小腦變性相關蛋白1反義轉錄物（CDR1as）也叫LINC00632。其作為miRNA-7海綿，通過抑制miRNA-7a活性而上調其靶基因聚ADP核糖聚合酶（PARP）和特異性蛋白1（SP1）[3]的表達，促進MI進程[4]。Shao等[5]研究發現CDR1as在糖尿病心肌病中促進心肌細胞凋亡；Zhang等[6]研究發現MI患者外周血CDR1as表達水平明顯升高，這均提示CDR1as可作為心臟損傷輔助診斷的依據。因此，本研究對CDR1as基因中國漢族人群最小等位基因頻率（MAF）＞20%的SNPs位點（rs12688274、rs5907638、rs76284232）進行分型，篩選出影響MI發生風險的SNPs位點，現報道如下。

1 資料與方法

①獲取基因在染色體上的位置信息。打開http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/Index，輸入基因 LINC00632，點擊“Go”進入LINC00632基因信息界面，出現染色體上的位置為X:139,791,932-139,854,844。②VCF to PED Converter界面操作步驟。點擊“Tools”按鈕找到左側“VCF to PED Converter”打開并點擊“VCF to PED Converter”將CDR1as在染色體上的位置信息和Choose data collections or provide your own file URLs選擇Phase 3。Select one or more phase 3 populations選擇中國漢族北京人群（CHB），Base format選擇Numbers。勾選biallelic only，其他參數默認，點擊run，如圖1所示。③等待刷新完畢，顯示done，點擊查看結果。下載ped和info文件，info文件存儲SNP的編號、位置信息，ped下載后將該文件解壓縮后與info文件放在同目錄下。④在Haploview里，默認第一種輸入格式linkage format，Data File點擊Browser選擇之前保存的ped文件，info文件自動識別（也可“Browser”手動選擇info文件，其他參數不變，點擊“OK”導入數據）。進入check marker界面，將根據哈代-溫伯格平衡定律的cut off值設為0.05，MAF設為0.2。其他參數默認，點擊“rescore markers”自動篩選符合條件的SNP，在表格區域顯示在check markers篩選的SNPs。設置篩選條件，默認r2閾值為0.8，r2＞0.8說明兩個位點高度連鎖，其他參數可不調整。確認參數后，點擊run tagger，彈出篩選結果，得到15組（其中10個沒有和其他SNPs高度連鎖）。最后，根據位點在基因上的位置和MAF大于20%選出合適的位點進行分析。

圖1

2 結果

2.1 CDR1as染色體位置在千人基因組中查找到CDR1as在染色體的位置為X: 139,791,932-139,854,844，用于VCF to PED Converter。

2.2 CDR1as中其他高度連鎖的染色體位置編號通過Haploview軟件得到CDR1as中其他高度連鎖的染色體位置編號，見表1。

表1 CDR1as中其他高度連鎖的染色體位置編號（MAF＞20%）

2.3 CDR1as中沒有高度連鎖的染色體位置CDR1as中其他沒有捕獲的染色體位置為X:139796996，X:139854816，X:139812042，X:139826741，X:139853006，X:139797629，X:139793630，X:139803812，X:139845866，X:139844407。

2.4 CDR1as的基因多態性結合NCBI上SNP位點在染色體的位置，挑選位于外顯子區域并且有轉錄本的SNPs，見表2。

表2 CDR1as的基因多態性

3 討論

MI常見以冠狀動脈粥樣硬化為基礎疾病的患者，在各種因素誘導下冠狀動脈斑塊破裂，心肌進而急性缺血、缺氧，持續一段時間后引起心肌缺血性壞死。MI主要癥狀為持久且嚴重的心絞痛，常伴心律失常、低血壓、心力衰竭甚至休克，好發于老年人群。隨著人口老齡化加劇，MI發病率呈上升趨勢且逐漸年輕化，嚴重威脅生命安全，因此盡早識別、診斷對保護心肌正常細胞及改善患者預后十分關鍵。MI病因和發病機制復雜，其危險因素包括遺傳、抽煙、喝酒、年齡、性別等[7]。目前認為MI是多基因參與、遺傳和環境因素共同作用的結果，遺傳因素不僅與MI發病相關，還影響MI進展與預后情況。遺傳變異的主要物質就是基因，基因在結構上分為編碼區和非編碼區兩部分。真核生物的編碼區是不連續的，分為外顯子和內含子，轉錄過程中會修剪內含子，拼合外顯子形成轉錄產物。外顯子區域占整個人類基因組1%左右，卻包含85%左右的已知疾病的變異基因。相比全基因組測序，外顯子測序成本低，且可檢測到全基因組測序無法鑒定的SNP位點。最常見的遺傳變異是SNP，當排除其他混雜因素時，一個遺傳標記在病例組中出現的頻率明顯高于正常對照組，說明其與該疾病具有關聯性。

1976年，環狀RNA（circRNA）首次從RNA病毒中被檢測出來[8]，被認為是線性RNA剪接錯誤的產物[9]。但近年來，高通量測序技術被廣泛應用，研究發現很多人類疾病的發生發展與circRNA有關，circRNAs在心血管疾病發生和發展中的分子機制被探討和驗證[10-13]，如circRNAs分子在人類、老鼠心臟內廣泛表達，并可作為微型核糖核酸或相關蛋白的海綿分子，參與心血管疾病的調節過程[14]。且circRNA與線性RNA不同，其不具有5'端帽子和3'端尾結構，呈共價閉合環狀結構，不易受RNA外切酶降解，因此可在組織或體液中穩定存在。這提示circRNA具有成為心血管疾病的分子診斷標志物的潛力[15-16]。也有研究表明circRNA基因的多態性可影響自身的空間結構，改變circRNA的表達及其調控的信號通路，進而影響個體對心肌梗死的易感性[17]。Geng等[4]研究發現circRNA中的CDR1as參與MI的過程，發揮針對miR-7的“分子海綿”生物功能，與miR-7結合后miR-7活性受到負向調控，使miR-7對miR-7靶基因PARP和SP1的抑制作用下降，從而上調靶基因表達促進心肌細胞凋亡。MI發生后會引起心肌細胞凋亡、纖維化重塑等變化，嚴重影響心臟功能[18]。所以適當減少心肌細胞凋亡對治療MI非常重要。

綜述所述，針對MI的研究中CDR1as可能作為一個新型潛在靶點，本文在CDR1as眾多個SNPs位點篩選出位于外顯子區域且有轉錄本的3個檢測位點分別為rs12688274、rs5907638、rs76284232，證明通過PubMed、千人基因組計劃和Haploview聯用可實現標簽SNPs篩選，值得進一步探索。這可能為后續研究CDR1as與MI的相關性節省大量人力物力，也可能為其他基因篩選SNP提供新的方法。