7-羥乙基白楊素聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米粒的制備及體外釋放評價

王小娟，楊寶樂，馬 川，何 蕾，景臨林，黃 瓊，馬慧萍

1. 甘肅中醫(yī)藥大學藥學院，甘肅 蘭州 730000

2. 聯(lián)勤保障部隊第九四○醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730050

3. 西安交通大學第一附屬醫(yī)院藥學部，陜西 西安 710061

白楊素（5，7-二羥基黃酮）是存在于許多天然植物、蜂蜜和蜂膠中的黃酮類化合物。體內(nèi)外研究顯示，白楊素具有抗氧化、抗缺氧、抗炎、抗腫瘤、抗癌和抗病毒活性等多種生物活性和藥理作用［1-2］，且對多種疾病表現(xiàn)出很好的治療作用［3］。7-HEC 是前期對白楊素進行結構改造而得到的新結構黃酮類化合物（圖1），化學名為5-羥基-7-羥乙基黃酮，其呈黃色針狀，普通狀態(tài)下呈棉絮狀［4］，對低壓性缺氧大鼠運動性疲勞具有明顯保護作用，具有優(yōu)異的抗高原缺氧活性［5］。但是，7-HEC 溶解度低，不易被機體吸收，其臨床使用受到限制。

圖1 白楊素和7-羥乙基白楊素的化學結構式Figure 1 Chemical structures of chrysin and 7-hydroxyethyl chrysin

納米遞送系統(tǒng)是一種提高難溶性藥物溶解度的藥劑學途徑，可以提高藥物的生物相容性、穩(wěn)定性和藥物靶向性，降低不良反應、控制藥物釋放及刺激響應［6-8］，頗受醫(yī)藥研究者的重視。PLGA 由乳酸和羥基乙酸縮合而成，被人體吸收后可正常代謝，對生物體毒副作用低，是美國食品藥品監(jiān)督管理局批準的可安全使用的藥用高分子材料［9］。PLGA 具有良好的生物相容性和可降解性，具有靶向性及緩控釋特性［10］。為增加7-HEC 的溶解性，提高其生物利用度，本文擬采用難溶性藥物增溶技術探索7-HEC/PLGA 納米粒處方，采用乳化溶劑揮發(fā)法制備7-HEC/PLGA 納米粒，并進行表征及體外釋放研究，以期為開發(fā)抗高原缺氧新藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

7-HEC 由本實驗室自行合成；PVA 為成都市科隆化學品有限公司產(chǎn)品；泊洛沙姆188、甘露醇為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；乳糖、蔗糖為成都市科龍化工試劑廠產(chǎn)品；大豆磷脂為上海麥克林生化科技股份有限公司產(chǎn)品；PLGA為上海甄準生物科技有限公司產(chǎn)品；磷酸二氫鉀（分析純）、氫氧化鈉（分析純）為天津市大茂化學試劑廠產(chǎn)品；水為純化水，其他試劑和試藥均為分析純。

BSA223S-CW 型電子分析天平為北京賽多利斯科學儀器有限公司產(chǎn)品；ZKT-7F 型真空脫氣儀、RC12AD 型智能藥物溶出儀為天津天大天發(fā)科技有限公司產(chǎn)品；UV-1780 型紫外分光光度計為島津儀器（蘇州）有限公司產(chǎn)品；Zeta PALS 動態(tài)激光粒徑測定儀為美國Brookhaven 儀器公司產(chǎn)品；Starer2100pH 測定計為美國奧豪斯儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；掃描電鏡為德國ZEISS公司產(chǎn)品；D8 ADVANCE 型X 射線衍射儀為德國Bruker公司產(chǎn)品。

1.2 乳化溶劑揮發(fā)法制備7-HEC/PLGA納米粒

分別稱取PLGA 和7-HEC，溶于二氯甲烷中，并加入乳化劑，混勻，將所得納米粒乳化液逐滴加入純水中冰浴超聲（工作3 s，間隔3 s）后再快速分散到 PVA 水溶液中冰浴超聲（工作3 s，間隔3 s），磁力攪拌4 h 揮發(fā)有機溶劑。以553×g離心10 min 除去大顆粒和析出的藥物，上清液以35 418×g離心40 min，沉淀重懸于蒸餾水中，35 418 ×g離心10 min。洗滌兩次，重新分散在少量蒸餾水中，冷凍干燥收集納米粒，得到7-HEC/PLGA納米粒。

1.3 測定7-HEC/PLGA 納米粒粒徑、PDI 和Zeta電位

將7-HEC/PLGA 納米粒重新分散在蒸餾水中配制成混懸液，取適量置于比色皿，用Zeta PALS動態(tài)激光粒徑測定儀測定納米粒的粒徑、PDI 和Zeta電位。

1.4 測定7-HEC/PLGA納米粒包封率、載藥量

1.4.1 專屬性考察 稱取7-HEC、PLGA 和磷脂適量，用甲醇溶解后適當稀釋，以甲醇作為空白對照，在185~400 nm波長范圍內(nèi)進行紫外光譜的全波長掃描。

1.4.2 線性關系考察 精密量取10 mg 7-HEC，置于10 mL 容量瓶中，加入適量甲醇，超聲5 min使其完全溶解，再加入甲醇稀釋至刻度，作為7-HEC 的標準儲備液。精密量取儲備液適量，用甲醇稀釋至濃度分別為1、2、3、4、5、6、7、8 μg/mL，精密吸取3 mL 不同濃度的7-HEC 溶液用紫外-可見光分光光度計在268 nm 處測量吸光度，每份樣品測量三次，取平均值作為最終吸光度。以7-HEC 濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標建立標準曲線。

1.4.3 包封率、載藥量測定 精密稱取5 mg 7-HEC/PLGA 納米粒，充分溶解于5 mL 甲醇中超聲20 min，采用紫外-可見分光光度計測量納米粒中7-HEC 吸收峰的吸光度，根據(jù)標準曲線計算藥物濃度及含量。按下式計算7-HEC/PLGA 納米粒的包封率和載藥量。包封率（%）=實測載藥量/理論載藥量×100%；載藥量（%）=測得納米粒中的藥物含量/納米?？傎|量×100%。

1.5 單因素考察7-HEC/PLGA 納米粒制備工藝及處方

以1.2 中7-HEC/PLGA 納米粒的制備方法為基礎，以粒徑、PDI、包封率、載藥量及Zeta 電位為評價指標進行單因素實驗考察乳化劑種類（大豆磷脂、泊洛沙姆188、聚乙烯醇）、大豆磷脂質量分數(shù)（1%、2%、3%、4%、5%）、油（二氯甲烷）水體積比（1∶5、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15、1∶20）、PVA 質量分數(shù)（0.5%、1.0%、2.0%、3.0%）、藥載比（1∶20、2∶20、3∶20、4∶20）、超聲功率比（30%、40%、50%、60%、70%）、超聲時間（1、2、3、4、5 min）、納米粒乳化液再次分散在PVA 后的超聲時間（2、3、4、5 min）對制備納米粒的影響，確定工藝處方。

1.6 Box-Behnken 響應面法優(yōu)化7-HEC/PLGA 納米粒處方

結合單因素實驗結果選擇試驗因素，以包封率（Y1，權重系數(shù)均定為0.25）、載藥量（Y2，權重系數(shù)均定為0.25）、粒徑（Y3，權重系數(shù)均定為0.5）為評價指標，其中包封率和載藥量越大越好，而粒徑越小越好。為了矢量一致，擬定粒徑0 nm 為1000分、500 nm為500分、1000 nm為0分（理想狀態(tài)下），按照下式歸一化后計算綜合評分（overall desirability）：綜合評分=（Y1/Y1max）×0.25+（Y2/Y2max）×0.25+（Y3/Y3max）×0.5。 運用Design Expert 10 軟件分析得到最佳處方，為檢驗所得制備工藝的可行性，按最佳處方制備三批樣品用以試驗驗證。分別測定7-HEC/PLGA 納米粒的綜合評分實際值，并與預測值相比較，當實際值與預測值偏差小于5%，說明7-HEC/PLGA 納米粒實際測得的值與預測值較為接近，證明采用Box-Behnken 響應面法優(yōu)化7-HEC/PLGA 納米粒處方具有良好的預測性，可靠性較高。

1.7 表征7-HEC/PLGA納米粒

1.7.1 掃描電鏡觀察納米粒外觀 取7-HEC/PLGA 納米?；鞈乙旱斡阢~柱，常溫下自然揮干，于真空條件下噴金后置于掃描電鏡下觀察7-HEC/PLGA納米粒外貌形態(tài)。

1.7.2 X 射線衍射儀檢測納米粒固體狀態(tài) 分別稱取7-HEC、PLGA、兩者物理混合物和7-HEC/PLGA 納米粒50 mg 樣品，置于樣品池中，采用X 射線衍射儀檢測樣品衍射峰。CuKα1 為X 射線管陰極，檢測條件為衍射角范圍為5°~60°，掃描速率為5°/min，掃描模式為2θ，電壓為40 kV，電流為30 mA。

1.8 篩選7-HEC/PLGA納米粒的凍干保護劑

取7-HEC/PLGA 納米?；鞈乙?，加入一定體積的凍干保護劑后用保鮮膜封口，－80 ℃預凍2 h，再置于冷凍干燥機中冷凍干燥24 h，得到不同比例、不同類型凍干保護劑的7-HEC/PLGA 納米粒凍干粉，考察凍干后凍干粉的外觀和復溶后的粒徑。

1.9 透析擴散法觀察7-HEC/PLGA 納米粒的體外釋放量

采用透析擴散法研究7-HEC 原料藥和載藥PLGA 納米粒的溶出速率。搖床的溫度設置為（37.0±0.5）℃，轉速設為100 轉/min。溶出介質分別為模擬胃液（pH 1.2）、模擬血漿（pH 7.4）和模擬腸液（pH 6.8），均加入0.5%的泊洛沙姆作為增溶劑。將含有相同量的7-HEC 原料藥和7-HEC/PLGA 納米粒分別放入6 個透析袋中，各加入5 mL 溶出介質后密封，將透析袋浸入到相應的溶出介質（100 mL）中。取樣時間點設為0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、8、12、24 和48 h。取樣時從溶出介質中取出5 mL樣品，并立即補充等體積的溶出介質，以確保溶出介質的體積保持不變。采用紫外-可見光譜法測定各個時間點釋放液的藥物質量濃度，計算藥物累計釋放量。

2 結 果

2.1 建立7-HEC/PLGA納米粒含量測定方法

在185~400 nm 波長范圍內(nèi)進行紫外光譜的全波長掃描，結果見圖2。7-HEC 在波長268 nm處無輔料的吸收干擾，方法專屬性良好，因此選用268 nm 為7-HEC 的檢測波長。以7-HEC 濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標進行線性回歸。得到7-HEC 的線性回歸方程為y=88.071x－0.0022（r2=0.9995），表明7-HEC 在1~8 μg/mL 范圍內(nèi)濃度和吸光度呈良好的線性相關性。該回歸方程可用于后續(xù)7-HEC/PLGA 納米粒包封率、載藥量的計算。

圖2 PLGA、7-HEC、磷脂、PVA 紫外光譜的全波長掃描結果Figure 2 Full wavelength scanning of UV spectroscopy of PLGA， 7-HEC， phospholipids and PVA

2.2 7-HEC/PLGA 納米粒制備工藝及處方的單因素考察結果

2.2.1 乳化劑對7-HEC/PLGA 納米粒性能的影響 乳化劑為大豆磷脂時，乳液的粒徑較小，電位絕對值較高，并且為均勻的澄清乳劑，有藍色的乳光，見表1。因此選擇大豆磷脂作為乳化劑。

表1 采用不同乳化劑制備的7-HEC/PLGA納米粒性能Table 1 Effect of emulsifier on 7-HEC/PLGA nanoparticles（±s，n=3）

表1 采用不同乳化劑制備的7-HEC/PLGA納米粒性能Table 1 Effect of emulsifier on 7-HEC/PLGA nanoparticles（±s，n=3）

7-HEC：7-羥乙基白楊素；PLGA：聚乳酸-羥基乙酸共聚物；PDI：多分散系數(shù).

乳化劑種類大豆磷脂泊洛沙姆188聚乙烯醇粒徑（nm）330.80±0.46 435.67±0.58 616.44±0.32 PDI 0.20±0.25 0.21±0.01 0.25±0.56包封率（%）57.40±1.02 22.26±1.03 30.04±1.32載藥量（%）5.20±0.22 2.02±0.43 2.73±0.32 Zeta電位（mV）－14.52±0.62－10.45±0.54－11.32±0.72

2.2.2 大豆磷脂質量分數(shù)對7-HEC/PLGA 納米粒性能的影響 隨著大豆磷脂質量分數(shù)的增加，粒徑呈現(xiàn)先變小后增大趨勢，Zeta 電位絕對值先增大后減小?？赡苁钱敶蠖沽字|量分數(shù)過高時，體系的黏度也隨之上升，使納米粒的粒徑反而變大的緣故。見表2。綜合考慮，選擇質量分數(shù)為3%左右的大豆磷脂。

表2 采用大豆磷脂不同質量分數(shù)制備的7-HEC/PLGA納米粒性能Table 2 Effect of soybean phospholipid mass fraction on 7-HEC/PLGA nanoparticles（±s，n=3）

表2 采用大豆磷脂不同質量分數(shù)制備的7-HEC/PLGA納米粒性能Table 2 Effect of soybean phospholipid mass fraction on 7-HEC/PLGA nanoparticles（±s，n=3）

7-HEC：7-羥乙基白楊素；PLGA：聚乳酸-羥基乙酸共聚物；PDI：多分散系數(shù).

大豆磷脂質量分數(shù)（%）1 2 3 4 5粒徑（nm）339.57±0.55 334.25±0.45 329.42±0.46 335.84±0.33 356.38±0.86 PDI 0.21±0.01 0.21±0.73 0.22±0.33 0.30±0.65 0.29±0.84包封率（%）67.32±1.88 77.45±1.43 81.52±1.73 80.65±0.88 41.30±0.93載藥量（%）5.83±0.45 7.22±0.43 8.15±0.82 7.96±0.53 3.76±0.79 Zeta電位（mV）－14.10±1.37－17.64±0.69－18.10±0.77－17.30±0.72－13.65±1.73

2.2.3 油水體積比對7-HEC/PLGA 納米粒性能的影響 隨著水相加入增多，7-HEC/PLGA 納米粒粒徑先增大后減小，在1∶15 時粒徑較小，載藥量、包封率較高，并且載藥量隨后減小。見表3。綜合考慮，選擇油水體積比1∶15。

表3 采用不同油水體積制備的7-HEC/PLGA納米粒性能Table 3 Effect of oil-water volume ratio on 7-HEC/PLGA nanoparticles（±s，n=3）

表3 采用不同油水體積制備的7-HEC/PLGA納米粒性能Table 3 Effect of oil-water volume ratio on 7-HEC/PLGA nanoparticles（±s，n=3）

7-HEC：7-羥乙基白楊素；PLGA：聚乳酸-羥基乙酸共聚物；PDI：多分散系數(shù).

油水體積比1∶5 1∶8 1∶10 1∶12 1∶15 1∶20粒徑（nm）321.70±1.45 347.52±0.65 355.43±0.87 371.68±0.58 338.29±0.97 345.51±0.81 PDI 0.30±0.55 0.28±0.92 0.31±0.84 0.39±0.69 0.28±0.57 0.34±0.54包封率（%）66.48±1.73 75.06±0.87 87.50±1.53 53.50±1.72 81.52±1.46 70.26±2.05載藥量（%）6.04±0.57 6.82±0.62 7.95±0.90 4.86±0.57 8.15±0.73 6.30±0.48 Zeta電位（mV）－14.60±1.09－13.54±1.35－10.65±0.95－15.10±1.55－18.43±1.65－15.61±0.89

2.2.4 PVA 質量分數(shù)對7-HEC/PLGA 納米粒性能的影響 PVA 質量分數(shù)在0.5%~1.0%時，乳化液的乳化效果更好，可以裝載更多的藥物。當PVA 質量分數(shù)繼續(xù)增大，粒徑變大，包封率和載藥量開始下降，見表4。選擇PVA濃度為0.5%。

表4 采用不同PVA質量分數(shù)制備的7-HEC/PLGA納米粒性能Table 4 Effect of PVA mass fraction on 7-HEC/PLGA nanoparticles（±s，n=3）

表4 采用不同PVA質量分數(shù)制備的7-HEC/PLGA納米粒性能Table 4 Effect of PVA mass fraction on 7-HEC/PLGA nanoparticles（±s，n=3）

7-HEC：7-羥乙基白楊素；PLGA：聚乳酸-羥基乙酸共聚物；PVA：聚乙烯醇；PDI：多分散系數(shù).

PVA質量分數(shù)（%）0.5 1.0 2.0 3.0粒徑（nm）325.74±1.75 336.93±1.49 516.54±0.92 615.33±0.65 PDI 0.29±1.45 0.32±1.73 0.20±0.90 0.13±1.47包封率（%）81.12±0.95 82.63±1.71 81.86±0.94 65.37±1.37載藥量（%）8.25±0.57 7.62±0.94 7.92±0.75 5.41±0.96 Zeta電位（mV）－16.80±0.73－14.10±0.87－15.45±0.58－13.60±1.65

2.2.5 藥載比對7-HEC/PLGA 納米粒性能的影響 隨著藥物的增加，納米粒粒徑先減小后增大，包封率和載藥量則先升高再降低，見表5。綜合考慮，選擇藥載比2∶20。

表5 采用不同藥載比制備的7-HEC/PLGA納米粒性能Table 5 Effect of drug loading ratio on 7-HEC/PLGA nanoparticles（±s，n=3）

表5 采用不同藥載比制備的7-HEC/PLGA納米粒性能Table 5 Effect of drug loading ratio on 7-HEC/PLGA nanoparticles（±s，n=3）

7-HEC：7-羥乙基白楊素；PLGA：聚乳酸-羥基乙酸共聚物；PDI：多分散系數(shù).

藥載比1∶20 2∶20 3∶20 4∶20粒徑（nm）349.74±0.52 328.62±0.98 355.15±0.73 452.46±0.69 PDI 0.26±0.59 0.28±0.62 0.43±0.94 0.32±0.82包封率（%）79.77±0.34 81.52±0.65 50.55±0.79 49.57±0.86載藥量（%）6.80±0.57 7.15±0.98 7.59±0.53 7.06±0.46 Zeta電位（mV）－15.60±1.02－17.50±0.93－9.54±0.72－10.76±0.52

2.2.6 超聲功率比對7-HEC/PLGA 納米粒性能的影響 超聲功率比達50%時，7-HEC/PLGA 納米粒的包封率、載藥量相對較高，且粒徑和PDI值相對較小，見表6。故選擇超聲功率比為50%。

表6 采用不同超聲功率比制備的7-HEC/PLGA納米粒性能Table 6 Effect of ultrasonic power ratio on 7-HEC/PLGA nanoparticles（±s，n=3）

表6 采用不同超聲功率比制備的7-HEC/PLGA納米粒性能Table 6 Effect of ultrasonic power ratio on 7-HEC/PLGA nanoparticles（±s，n=3）

7-HEC：7-羥乙基白楊素；PLGA：聚乳酸-羥基乙酸共聚物；PDI：多分散系數(shù).

超聲功率比（%）30 40 50 60 70粒徑（nm）328.63±0.93 324.98±0.81 285.70±0.12 313.43±0.59 339.72±0.61 PDI 0.35±0.72 0.27±0.89 0.21±0.52 0.33±0.83 0.34±0.91包封率（%）47.25±0.48 56.64±0.39 64.47±0.82 51.39±0.51 45.41±0.82載藥量（%）5.11±0.94 5.14±0.69 6.06±0.27 5.02±0.69 5.16±0.87 Zeta電位（mV）－12.30±0.83－17.90±0.92－19.41±0.59－18.90±0.84－15.43±0.67

2.2.7 超聲時間對7-HEC/PLGA 納米粒性能的影響 隨著超聲時間延長，包封率、載藥量和Zeta電位絕對值均先增加后減小，雖然4 min 時制備的納米粒具有較小的粒徑，但包封率和載藥量低于3 min 時，且4 min 時的PDI 值也相對較高，見表7。故選擇超聲時間為3 min。

表7 采用不同超聲時間制備的7-HEC/PLGA納米粒性能Table 7 Effect of sonication time length on 7-HEC/PLGA nanoparticles（±s，n=3）

7-HEC：7-羥乙基白楊素；PLGA：聚乳酸-羥基乙酸共聚物；PDI：多分散系數(shù).

超聲時間（min）12345粒徑（nm）374.81±0.32 309.75±0.97 301.29±0.82 286.43±0.74 297.70±0.96 PDI 0.41±0.65 0.34±0.84 0.31±0.97 0.32±0.84 0.33±0.74包封率（%）65.08±0.73 69.73±0.75 70.70±0.94 64.14±0.63 62.47±0.96載藥量（%）4.52±0.67 4.89±0.90 6.42±0.43 5.74±0.74 4.86±0.94 Zeta電位（mV）－15.98±0.72－16.47±0.93－18.90±0.71－16.40±0.83－13.38±0.75

2.2.8 二次分散工藝中超聲時間對7-HEC/PLGA納米粒性能的影響 分散在PVA 后超聲時間為3 min 時，7-HEC/PLGA納米粒的粒徑較小，包封率和載藥量較高，見表8。故二次分散選擇超聲時間為3 min。

表8 二次分散工藝中采用不同超聲時間制備的7-HEC/PLGA納米粒性能Table 8 Effect of secondary dispersion process on 7-HEC/PLGA nanoparticles（±s，n=3）

表8 二次分散工藝中采用不同超聲時間制備的7-HEC/PLGA納米粒性能Table 8 Effect of secondary dispersion process on 7-HEC/PLGA nanoparticles（±s，n=3）

7-HEC：7-羥乙基白楊素；PLGA：聚乳酸-羥基乙酸共聚物；PDI：多分散系數(shù).

超聲時間（min）2345粒徑（nm）251.61±1.97 217.39±0.94 218.78±0.83 224.32±0.86 PDI 0.35±0.47 0.28±0.92 0.31±0.74 0.34±0.81包封率（%）70.70±0.75 78.28±1.03 76.52±0.85 72.83±0.73載藥量（%）6.42±0.05 7.11±0.74 7.05±0.82 6.62±0.91 Zeta電位（mV）－17.20±1.17－18.73±0.93－15.53±0.87－13.30±0.95

2.3 Box-Behnken響應面法優(yōu)化處方及驗證

2.3.1 試驗設計及結果 結合單因素實驗結果及相關文獻關于PLGA納米粒影響因素的分析，選擇油水體積比、藥載比和乳化劑質量分數(shù)為自變量（分別為X1、X2、X3），以納米制劑的包封率、載藥量和粒徑大小作為響應值（分別為Y1、Y2、Y3），采用響應面法對7-HEC/PLGA 納米粒處方做進一步優(yōu)化，X1、X2、X3在－1、0、1 水平分別為1∶12、1∶15、1∶20，1∶20、2∶20、3∶20，2%、3%、4%。結果見表9。

表9 Box-Behnken 響應面法優(yōu)化7-HEC/PLGA 納米粒處方試驗結果Table 9 Experimental results of Box-Behnken response surface methodology for optimizing the preparation process and prescription of 7-HEC/PLGA nanoparticles

2.3.2 模型擬合、響應面優(yōu)化結果 利用Design Expert 10軟件對表9 中的試驗結果進行二次多元回歸分析，得到回歸方程：綜合評分＝0.96＋0.015×X1＋0.028×X2－0.025×X3－0.032×X1X2－0.016×X1X3－0.050×X2X3－0.068×X12－0.088×X22－0.073×X32，P<0.01，R2＝0.9976，調整R2＝0.9946，說明模型與實際吻合度良好，可信度較高。方差分析結果見表10。圖3 為各因素交互三維曲面圖，顯示7-HEC/PLGA納米粒最優(yōu)處方為油水體積比為1∶14.7、藥載比為2.12∶20、乳化劑質量分數(shù)為2.72%，在此條件下綜合評分預測值為0.928。

表10 Box-Behnken響應面法優(yōu)化7-HEC/PLGA納米粒處方的二次回歸方程方差分析結果Table 10 Optimization of 7-HEC/PLGA nanoparticles preparation process by Box-Behnken response surface method and ANOVA results of prescription quadratic regression equation

圖3 各因素對綜合評分的響應面三維圖Figure 3 Three-dimensional plot of the response surface of each factor to the composite score

2.3.3 最佳工藝驗證結果 三批次7-HEC/PLGA納米粒的平均粒徑為（240.28±0.96）nm、PDI 為0.25±0.69、包封率為（75.74±0.80）%、載藥量為（6.98±0.83）%、電位為（－18.17±0.17）mV，綜合評分實際值均值為0.951，與預測值0.928 的偏差為2.48%，說明采用Box-Behnken 響應面法優(yōu)化7-HEC/PLGA 納米粒處方具有良好的預測性，可靠性較高。

2.4 7-HEC/PLGA納米粒的表征

2.4.1 7-HEC/PLGA 納米粒的外觀及電鏡下表現(xiàn) 7-HEC/PLGA 納米粒的外觀見圖4A，略帶淺藍色乳光。取7-HEC/PLGA 納米?；鞈乙褐糜趻呙桦婄R下觀察外貌形態(tài)，結果見圖4B。7-HEC/PLGA 納米粒外貌形態(tài)呈較規(guī)則的球形或類球形，表面圓整光滑。提示包封較好。

圖4 7-HEC/PLGA納米粒的外觀及電鏡下形態(tài)Figure 4 Appearance and electron microscopic morphology of 7-HEC/PLGA nanoparticles

2.4.2 7-HEC/PLGA 納米粒固體狀態(tài)表征 X 射線衍射儀結果見圖5。與7-HEC、PLGA、兩者物理混合物比較，7-HEC/PLGA 納米粒峰強度明顯減弱，表明其狀態(tài)發(fā)生改變，7-HEC 已被載體包裹。

7-HEC：7-羥乙基白楊素；PLGA：聚乳酸-羥基乙酸共聚物.

2.5 凍干保護劑對7-HEC/PLGA 納米粒的影響

考察凍干后凍干粉的外觀和復溶后的粒徑，結果見表11。采用5%和10%甘露醇凍干粉納米粒均質地細膩，且PDI和粒徑無明顯差異。綜合考慮，選擇5%甘露醇作為凍干保護劑。

表11 采用不同凍干保護劑的7-HEC/PLGA 納米粒外觀和物理性能Table 11 Freeze-drying protective agent investigation results（±s，n=3）

表11 采用不同凍干保護劑的7-HEC/PLGA 納米粒外觀和物理性能Table 11 Freeze-drying protective agent investigation results（±s，n=3）

7-HEC：7-羥乙基白楊素；PLGA：聚乳酸-羥基乙酸共聚物；PDI：多分散系數(shù).

保護劑5%甘露醇10%甘露醇5%乳糖10%乳糖5%蔗糖10%蔗糖凍干粉外觀質地細膩質地細膩質脆質脆質脆且黏度較大質脆且黏度較大粒徑（nm）300.03±0.95 308.23±0.43 307.31±0.61 280.29±0.98 280.66±0.09 260.53±0.85 PDI 0.27±0.63 0.27±0.97 0.26±0.73 0.19±0.69 0.15±0.78 0.16±0.83

2.6 7-HEC/PLGA 納米粒的體外釋放情況

7-HEC/PLGA 納米粒的體外釋放結果見圖6。PLGA 包載的7-HEC 在不同介質中快速釋放，48 h 內(nèi)累積釋放度達到50%以上，證明PLGA 包載有效提高7-HEC在介質中的溶出度。

圖6 7-HEC和7-HEC/PLGA納米粒在不同介質中的釋放曲線Figure 6 Release profiles of 7-HEC and 7-HEC/PLGA nanoparticles in different media

3 討 論

目前，乳化溶劑揮發(fā)法是制備PLGA納米粒常用的方法，具有重復性強、穩(wěn)定性好、包封率高等優(yōu)點［11］。由于7-HEC 在水中溶解性差，油相滴入水相時，容易析出晶體，前期的水相選用了1% PVA 水溶液，所得納米粒粒徑較大，乳化效果不佳，包封率和載藥量均隨著PVA 質量分數(shù)增大而降低，粒徑隨著PVA 質量分數(shù)的增大而增大，可能的原因是PVA 是高分子乳化劑，有一定的黏性。后期改用0.5% PVA 作為水相，對超聲功率、時間均進行了篩選，發(fā)現(xiàn)在超聲功率50%，加入PVA 后超聲3 min 時可以得到最優(yōu)的納米乳化液。本實驗采用乳化溶劑揮發(fā)法制備7-HEC/PLGA 納米粒，在單因素分析結果的基礎上選擇油水體積比、藥載比、乳化劑質量分數(shù)作為考察因素，采用Box-Behnken 響應面法來優(yōu)化7-HEC/PLGA 納米粒得到最優(yōu)處方，制備工藝穩(wěn)定可行，得到粒徑較小、穩(wěn)定性良好的7-HEC/PLGA納米粒。

將納米粒制成凍干粉時，穩(wěn)定性可以得到較大改善，但整個體系在冷凍和解凍過程中可能會因為滲透壓的改變造成微粒的裂解，從而粒徑變大且發(fā)生漏藥。因此，在凍干的過程中選擇適合的凍干保護劑至關重要。本實驗選用不同質量分數(shù)的甘露醇、蔗糖、乳糖考察，5%甘露醇作為凍干保護劑時，粒徑、PDI 較小，凍干粉質地細膩，可能是甘露醇在凍干后含水量低，7-HEC/PLGA 納米粒的穩(wěn)定性增加，與蔗糖、乳糖相比具有較低的黏度［12］。

從體外釋放研究結果可以看出，PLGA 納米?？梢允?-HEC 快速釋放，并且在48 h內(nèi)累積釋放度達到50%以上，證明PLGA的包載可以有效提高難溶性藥物在介質中的溶出度。7-HEC在水中的溶解度低，當用普通溶出介質時，溶出液中幾乎沒有溶出的藥物，文獻中有報道采用吐溫80、吐溫20、聚氧乙烯蓖麻油等作為7-HEC 體外釋放的增溶劑［13-14］。經(jīng)實驗驗證后發(fā)現(xiàn)，以上增溶劑在測定波長處有干擾，影響含量測定；釋放介質中加入0.5%的泊洛沙姆可以有效增加7-HEC 在釋放介質中的溶解度，使其達到漏槽條件，故采用0.5%的泊洛沙姆作為增溶劑。本實驗制備的7-HEC/PLGA 納米粒明顯提高了7-HEC 的溶出度，為PLGA 包載納米粒技術提供了可行策略，具有更高的應用價值。

志謝研究得到國家自然科學基金（81571847，81872796）、軍隊衛(wèi)勤保障能力創(chuàng)新與生成專項計劃（21WQ045）、甘肅省自然科學基金（22JR11RA011）、聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院專項培育項目（2021yxky015）支持

AcknowledgementsThis work was supported by National Natural Science Foundation of China (81571847, 81872796),Military Medical Support Capability Innovation and Generation Special Program Plan (21WQ045),Natural Science Foundation of Gansu Province (22JR11RA011),The 940th Hospital of the Joint Logistics Support Force of PLA Special Cultivation Project (2021yxky015)

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

Conflict of InterestsThe authors declare that there is no conflict of interests

?The author(s) 2024. This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)