三氯生和雙酚A 對斑馬魚神經毒性的比較研究

韓曉雯,徐婕妤,王偉偉,錢秋慧,王慧利* (.蘇州科技大學環境科學與工程學院,江蘇 蘇州 5009；.溫州醫科大學檢驗醫學院生命科學學院,浙江 溫州 35035)

三氯生(TCS)是一種高效的廣譜抗菌劑,被廣泛應用于牙膏、洗滌劑等生活用品及醫療器械中[1].TCS 生產及使用過程中被釋放到環境,由于目前現有的常規污水處理方式難以完全除去TCS,導致TCS 對水生生態系統產生持續性污染影響[2-4].在水生系統中,TCS 的濃度從低到高,從納克水平到10000 倍不等, COVID-19 以來,大量含TCS 消毒劑的使用導致部分地區兒童TCS 預估每日攝入量(EDI)已超過每日可接受攝入量(ADI)[5-6].由于其具有較長的半衰期,并且具有蓄積作用,TCS 極易對生物機體的正常生長發育造成影響,并通過生物累積作用,導致人體暴露和健康影響,從而對環境和人類造成潛在的健康風險[4-5,7].有研究顯示,TCS 在母體羊水、尿液、臍帶血清和母乳樣本中廣泛檢出,對胎兒產生潛在的健康影響[8].與TCS 類似,雙酚A(BPA)也因具有高效、低耐久性的優點而作為一種塑料合成材料廣泛應用于人類的日常用品中,例如食品貯存容器、醫用器械、供水管道與防護涂料中[9].已有研究表明,在海洋和淡水水體收集的多種魚類體內,可檢測到濃度范圍為0.2～13000μg/kg 的BPA[10].已有的體內和體外實驗研究表明,環境中低劑量TCS和BPA 長期作用于水生系統,對魚類和高等脊椎動物的生殖、免疫系統、肌肉功能造成不良毒性影響以致威脅到生物安全[7,9].然而,探究人類或其他生物早期TCS 和BPA 暴露與神經發育之間的關系及其機制的相關研究較少,對TCS 和BPA 進行生物毒性相關研究和評估具有一定必要性.因此,本研究探討與比較環境內分泌干擾物TCS 和BPA 的致毒機理,旨在為“污染性疾病”的認識、生態安全評價與環境健康維護提供參考.

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗以斑馬魚為模型生物,主要使用野生型AB 品系斑馬魚與轉基因斑馬魚Tg(elavl3:EGFP)以及Tg(fli1:EGFP),所用斑馬魚購于國家斑馬魚資源中心,按照標準斑馬魚養殖手冊飼養于斑馬魚養殖系統,雌雄成魚分缸飼養,系統水溫維持在(28.5±0.5) ℃,pH 值為6.8～7.5,光暗周期為14h 光照和10h黑暗,每日早晚分2 次投喂新鮮孵育豐年蝦,并清理飼料殘渣與排泄物.

1.2 實驗試劑及儀器

實驗試劑:三氯生(CAS No.3380-34-5, 99.9%),雙酚A(CAS No.201-245-8,99.9%),均購于Sigma-Aldrich 公司(St.Louis, USA).藥品溶劑為丙酮(Acetone,99.9%),購于浙江中星化工試劑有限公司.基因逆轉錄試劑盒購于北京寶日醫生物有限公司;第一鏈cDNA 合成試劑盒、Trans Start@ Greenq PCR SuperMix 試劑盒來源于北京全式金公司, AO染色試劑盒以及乙酰膽堿酯酶活性檢測試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司.

實驗儀器:斑馬魚養殖系統(上海海圣生物實驗室有限公司)、體式顯微鏡(Cover-015,日本奧林巴斯)、臺式低溫高速離心機(Gentrifuge5424R,德國Eppendorf 公司)、制冰機(IBS-20,寧波特朗普儀器有限公司)、渦旋混合器(XW-80,上海醫科大學儀器廠)、F6/F10 手持式高速勻漿機(上海凈信科技公司)、Step OnePlus? Real-Time PCR System((48 孔)美國thermofisher 科技公司).

1.3 斑馬魚胚胎的收集、染毒和飼養

基于BPA 的環境檢測濃度在ng/L～mg/L 水平不等,在工業廢水中甚至可以達到370mg/L[11],而TCS 的環境監測濃度在0～1000ng/L 不等,在畜牧水產養殖等特殊環境中,其監測濃度高達mg/L 級別[12].通過實驗測定擬合二者對120hpf斑馬魚幼魚的LC50 值分別為9.06 和0.51mg/L[13],本研究中BPA 和TCS 的濃度均選擇250μg/L,分別不足其LC50 的1/36 和1/2.目的是使斑馬魚暴露于亞致死劑量下,以便捕捉和統計其幼魚的表觀發育畸形,運動行為異常,潛在的分子變化及深入探索潛在的分子機制.實驗前一天晚上將斑馬魚按照雌雄比2:2放入產卵器中,使用透明隔板分隔雌魚及雄魚,次日早上開燈刺激產卵,2h 后收集胚胎.挑選優質胚胎孵育至 6h 后進行暴毒實驗.設置對照組(CTR 0.01%丙酮)和藥物處理組(TCS 250μg/L、BPA 250μg/L 處理組),加入預先配制的TCS 與BPA 溶液開始暴毒,每間隔24h 換液一次以保持染毒濃度,連續暴毒120h 后,進行后續實驗.

1.4 幼魚AO 凋亡染色

胚胎暴露3dpf 后,分組收集于1.5mL 離心管,加入1mL PBS 低速震蕩漂洗2 次,吸去PBS 殘液后,避光加入AO 凋亡染液,避光染色15min 后吸去AO 染色液,避光加入PBS 漂洗胚胎3 次.將幼魚移至載玻片,加入魚酚麻醉劑,于體視熒光顯微鏡下成像記錄.

1.5 幼魚行為學分析

將對照組、TCS 處理組以及BPA 處理組暴露5dpf 的斑馬魚幼魚移至96 孔無菌培養板后移入Noldus(荷蘭)行為分析儀觀察箱,參考之前的行為學分析方法[14],利用EthoVisionXT 軟件設定實驗程序進行運動軌跡采集,統計運動指標.

1.6 乙酰膽堿酯酶活性檢測

分別從對照組、TCS 處理組以及BPA 處理組吸取暴露5dpf 的幼魚于FP 管中, PBS 清洗兩次,吸取RIPA 液超聲勻漿,2500r/min 速度下離心 15min,吸取上清液待測.樣本蛋白質濃度根據碧云天BCA 蛋白濃度試劑盒操作流程進行測定.使用乙酰膽堿酯酶(AChE)測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)測定乙酰膽堿酯酶(AChE)的活性.

1.7 RT-qPCR

根據制造商說明從不同處理組暴毒5dpf 幼魚中提取總RNA,根據逆轉錄體系將總RNA 逆轉錄合成cDNA.根據TransStart Green qPCR Super Mix 試劑盒操作要求配制樣本反應液,在ABI7500 儀器上運行程序進行 RT-qPCR 分析.

1.8 生物信息學分析

從有機小分子活性數據庫 PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取TCS 及BPA 的結構式,導入 Pharm Mapper 在線數據庫(http://lilabecust.cn/pharmmapper/)對靶點進行預測,將篩選得到的藥物靶蛋白導入 STRING 在線數據庫(https://cn.string-db.org/),進行 String 轉化,利用Metascape 數據庫(https://metascape.org)及微生信在線平臺(https://www.bioinformatics.com.cn)分析轉化結果.

1.9 數據分析方法

數據以(平均值±標準差)(SD)表示,實驗組間比較在 Tukey 排序檢驗之后進行單向方差分析(ANOVA),所有統計分析均以SPSS 18.0 軟件(芝加哥,美國)進行,顯著性水平記錄為P<0.05(*),P<0.01(**),P<0.001(***).

2 結果與分析

2.1 TCS 和BPA 對斑馬魚發育的影響

為了對TCS和BPA 對斑馬魚幼魚發育的影響作整體評價,把胚胎分為對照組、TCS 處理組和BPA 處理組,進行連續120hpf 的連續暴毒.結果發現,與對照組相比,在TCS 和BPA 暴露下,幼魚的形態在觀察下表現出多種明顯表觀畸形.72hpf 在TCS 和BPA 處理后幼魚開始出現卵黃囊腫,尤其是暴露到120hpf 時TCS 處理組和BPA 處理組幼魚畸形現象極為顯著,出現例如心包水腫、脊柱彎曲和游囊發育遲緩等發育畸形現象(圖1(a)).圖1(b)和圖1(c)量化了TCS 及BPA 的致畸率,其中BPA 組畸形率為31.6%(P<0.05),而TCS 組畸形率高達43.7%(P<0.001).

圖1 TCS 和BPA 暴露對斑馬魚胚胎發育的影響Fig.1 The effects of embryo development under TCS and BPA exposure

2.2 TCS 和BPA 對斑馬魚運動行為的影響

運動行為是神經功能最直觀的體現形式,且行為學檢測具有普適性、穩定性和易操作性的優點,因此,神經行為檢測在神經毒性的高通量篩選中被較為廣泛應用[15].為探究TCS 和BPA 對幼魚神經運動行為的影響,通過自主運動、光暗節律和聲刺激實驗評價TCS 及BPA 暴露對幼魚運動行為的影響.在自主運動實驗中,如軌跡示蹤熱圖(圖2(a))所示,與對照組相比,TCS 處理組和BPA 處理組幼魚運動軌跡更單一稀疏,多為短距離游動,行為熱度下降.自主運動顯示(圖2(b)),TCS 處理組及BPA 處理組運動距離顯著降低(P<0.05).同時,TCS 及BPA處理組幼魚移動速度也顯著降低(P<0.01) (圖2(c)),此外,與BPA 相比,TCS 處理組移動距離和移動速度略低,但不具有顯著性.表明TCS 及BPA 暴露可導致幼魚自主運動遲緩和活力下降,對斑馬魚的運動神經系統造成不良影響,且TCS 對斑馬魚的影響更大.

圖2 TCS 和BPA 暴露下對斑馬魚幼魚行為的影響Fig.2 Effects of TCS and BPA exposure on the behavior of zebrafish larvae

在光暗節律實驗中(圖2(d)),TCS 處理組和BPA處理組幼魚對光暗交替瞬間的反應較對照組更為遲鈍,行為變化較弱,且游動距離有小于對照組的趨勢,運動行為活力下降,證實TCS 和BPA 暴露對幼魚的光暗感知能力產生破壞且對相關神經有損害作用.在聲刺激狀態下(圖2(e)),與對照組相比TCS 處理組和BPA 處理組幼魚運動活力降低(P<0.05),表明TCS 及BPA 暴露對幼魚聽覺相關神經功能產生影響,導致幼魚對聲音刺激的敏感度和應激反應受到抑制,造成聽覺功能受損.

2.3 TCS 和BPA 環境暴露對斑馬魚神經系統發育的影響

為了探究TCS 和BPA 暴露對斑馬魚幼魚神經系統發育的影響以及它們對神經網絡形成與分化的影響,對Tg(elavl3:EGFP)神經轉基因斑馬魚和Tg(fli1:EGFP)血管轉基因斑馬魚進行暴露.作為神經系統發育的重要標志基因,elavl3 在神經元分化中發揮重要作用,利用Tg(elavl3:EGFP)品系轉基因斑馬魚可以有效觀察斑馬魚神經元生長情況[16];基因fli1在血管生成中發揮作用,因此可以通過觀察Tg(fli1:EGFP)轉基因斑馬魚研究TCS 和BPA 對斑馬魚血管發育的影響[17].如圖3(a)所示,對照組幼魚腦部的綠色熒光清晰,而經過120hpf 暴毒的TCS 處理組和BPA 處理組幼魚腦部熒光強度及面積下降,且出現間腦與后腦間隙模糊的情況(圖3(a)白色箭頭),表明TCS 和BPA 暴露后會使新生神經元細胞的數量減少,導致斑馬魚的早期神經發育受到抑制.Tg(fli1:EGFP)血管轉基因斑馬魚的結果顯示(圖3(b)),與對照組相比,在TCS 和BPA 的暴露處理下,斑馬魚幼魚身體和腦部血管發生消融,且腦部血管排列無序.

圖3 TCS 和BPA 暴露下對斑馬魚神經系統發育的影響Fig.3 The effects of TCS and BPA exposure on the development of the nervous system of zebrafish

利用吖啶橙(AO)染色以研究TCS 及BPA 暴露對細胞凋亡的影響.結果表明,暴露至120hpf 時,對照組幼魚腦部存在少量自然凋亡情況而TCS 處理組和BPA 處理組幼魚腦部可觀察到明顯致密濃縮的綠色熒光碎片顆粒(圖3(c)白色箭頭),熒光強度及數量較對照組顯著增強,表明TCS 和BPA 可誘導腦部細胞凋亡,影響斑馬魚的神經系統發育.

2.4 TCS 和BPA 暴露對斑馬魚幼魚神經相關功能基因和生物標志物的影響

為了進一步探究TCS 和BPA 對斑馬魚幼魚神經毒性的影響機制,本研究篩選了4 個神經相關功能基因(elavl3、gfap、ngn1、gap43)進行RT-qPCR驗證.結果顯示(圖4(a)～(d)),與對照組相比,TCS 處理組及BPA 幼魚的elavl3、gfap、ngn1、gap43 基因表達均受到抑制,其中elavl3、gfap和ngn1 表達水平顯著下降,而gap43 基因表達沒有顯著差異,表明TCS 和BPA 都能對與神經發育相關基因的表達產生抑制作用.而乙酰膽堿酯酶(AChE)結果顯示(圖4(e)),與對照組相比,TCS 處理組AChE 顯著增加(P<0.01),而BPA 組AChE 表達略有提升但不具有顯著性.

圖4 TCS 和BPA 暴露下對斑馬魚幼魚神經發育相關基因以及生化指標的影響Fig.4 The effects of TCS and BPA exposure on neurodevelopment-related genes and biochemical indicators in zebrafish larvae

2.5 TCS 和BPA 作用靶基因的功能分析

基于上述TCS 和BPA 暴露對斑馬魚產生的神經毒性作用,為進一步分析TCS 和BPA 對生物產生毒性作用的機制和作用途徑,本文通過生物信息學分析預測TCS 和BPA 的作用靶基因,并對其進行基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析.圖5 展示了TCS 及BPA 富集排名前10 的GO terms(P<0.05),以及排名前 20 的 KEGG 途徑(P<0.05).

圖5 TCS 及BPA 作用的靶基因GO 功能富集與KEGG 通路富集Fig.5 GO functional classification and KEGG pathway analysis of TCS and BPA target genes

GO 分析顯示(圖5(a)-(b)),生物過程(Biological process)方面,TCS 的靶基因主要富集在“細胞氨基酸代謝過程(Cellular amino acid metabolic process)”、“有機酸分解代謝過程(Organic acid catabolic process) ”和“羧酸分解代謝過程(Carboxylic acid catabolic process)”等生物過程,其中“有機酸分解代謝過程”和“羧酸分解代謝過程”可以富集較多的BPA 靶基因.在細胞組成(Celluar component)方面,TCS 主要富集在“Sin3 復合體(Sin3complex)”和“線粒體基質(Mitochondrial matrix)”中,而BPA 在“線粒體基質”中也存在較多富集的靶基因.此外,BPA 的靶基因還在“過氧化物酶體(Peroxisome)”以及“微體(Microbody)”中富集.在分子功能(Molecular function)方面,TCS 主要富集在“核受體活性(Nuclear receptor activity)”和“配體激活的轉錄因子活性(Ligand-activated transcription factor activity)”,而BPA 則富集在“維生素結合(Vitamin binding)”和“有機酸結合(Organic acid binding)”.其中,TCS和BPA 的靶基因均可在“維生素結合”,“核受體活性”以及“類固醇結合(Steroid binding)”功能中富集.

KEGG 分析發現(圖5(c)～(d)),TCS和BPA 在“癌癥相關通路(Pathways in cancer)”、“碳代謝(Carbon metablism)”、“輔因子的生物合成(Biosynthesis of cofactors)”以及“谷胱甘肽代謝(Glutathione metabolism)”通路富集.值得注意的是,TCS 在“帕金森病(Parkinson disease)”、“藥物代謝-其他酶(Drug metabolism-other enzymes)”和“Wnt 信號通路(Wnt signaling pathway)”富集,而BPA 在“胰島素信號通路(Insulin signaling pathway)”、“PPAR 信號通路(PPAR signaling pathway)”、“HIF-1 信號通路(HIF-1signaling pathway)” 以及“色氨酸代謝(Tryptophan metabolism)”、“酪氨酸代謝(Tyrosine metabolism) ”、“ β- 丙氨酸代謝(Beta-Alanine metabolism)”等代謝相關通路富集,表明TCS 和BPA均能誘導神經毒性,但其誘導神經毒性的作用機制和途徑可能不同.

為了比較TCS 和BPA 作用靶基因對生物的毒性作用,利用Cytohubba 對TCS 及BPA 作用靶基因的關鍵基因(Hub基因)進行篩選,其中TCS組排名前十的Hub 基因(圖5(e))分別為EP300、RXRB、RXRG、THRB、MUC1、E2F1、BIRC5、CALML3、GCDH、ARHGEF7.其中,EP300 是自閉癥譜系障礙相關蛋白和基因相互作用網絡的關鍵樞紐,研究發現EP300在 lnc MEG3 對 CDH2 的調控中發揮重要作用,MEG3 可以通過與EP300 相互作用,上調CDH2,從而導致海馬神經元的凋亡和細胞凋亡[18].Shimizu 等[19]的一項研究則證實EP300 可以調控斑馬魚視神經頂蓋成體神經發生和再生神經發生過程中神經干細胞的增殖與分化,抑制EP300 的表達可以在生理條件下促進神經上皮樣干細胞新生神經元的生成.BPA 組排名前十的Hub 基因(圖5(f))分別為AR、PA2G4、CCNA2、MUC1、SMARCA4、HMGCS1、CLPP、INSR、HIBCH、ALK.其中PA2G4可以與受體、激酶以及一些細胞調節因子相互作用,與細胞周期調節和癌癥有關,研究證實PA2G4 敲降減少神經嵴中凋亡細胞的數量,也導致有絲分裂細胞的減少,表明PA2G4 在控制神經板,神經嵴和顱板結構域的大小方面發揮關鍵作用[20].值得注意的是MUC1在TCS 和BPA 作用的靶基因中均發揮重要作用.MUC1 是一種跨膜粘蛋白樣糖蛋白,是Toll 樣受體(Toll-like receptor,TLR)信號傳導的負調節因子,可以抑制TLR 激活引起的促炎反應,抑制TLR 介導的NF-κB 活化[21].NF-κB 可以激活細胞增殖和炎癥等細胞生物學過程,有研究證實NF-κB 可以調節星形膠質細胞中促炎因子的分泌,調控星形膠質細胞活化標志物GFAP 的表達[22].

綜上所述,TCS 和BPA 可以通過作用于神經相關的Hub 基因誘導神經毒性作用,其中抑制神經元發育和誘導細胞增殖或凋亡異常是TCS 和BPA 誘導神經毒性的重要方式.基于生信分析本文對TCS和BPA 誘導神經毒性的作用途徑和機制進行分析和比較,而在之前的實驗中,本文也證實了TCS 和BPA 急性暴露會誘導斑馬魚神經元的發育異常和細胞凋亡增加.這些發現有利于進一步的了解TCS和BPA 誘導的神經毒性效應和作用機制的異同.

3 討論

作為典型的環境內分泌干擾物,TCS 和BPA的親脂性和較強的生物蓄積能力導致其極易對生物造成毒性作用,越來越多的實驗證實了TCS 和BPA 對免疫、生殖、神經以及內分泌系統的影響.基于斑馬魚 (Daniorerio)轉基因品系豐富和中樞神經系統在功能上與人類神經系統高度相似等特點[23],本研究選擇環境中常見的兩種典型內分泌干擾物TCS 和BPA 為對象,以斑馬魚為模式生物,探究TCS 和BPA 對斑馬魚神經發育和運動行為的影響.

為了評價TCS 和BPA 對斑馬魚胚胎發育的影響,本研究統計了亞致死劑量暴露下TCS 和BPA 誘導胚胎及幼魚的畸形情況,發現TCS 和BPA 暴露會導致幼魚的形態出現多種明顯表觀畸形,如卵黃囊腫、心包水腫、脊柱彎曲及游囊閉合發育遲緩的情況,且與BPA 處理組相比,TCS 處理組幼魚畸形情況更為嚴重,表明TCS 和BPA 具有明顯的致畸反應.在Sun 等[24]的研究中發現TCS 和BPA 對斑馬魚幼魚均有較為明顯的致畸作用,大部分發育異常的斑馬魚出現兩種或兩種以上的畸形情況,主要表現為卵黃囊腫、心包水腫和脊柱彎曲,這與本研究的發現相似.此外,其研究發現BPA 暴露導致的畸形率略高于TCS 暴露誘導的畸形率,而在本研究中TCS 致畸率更高,這可能是本研究與其研究暴露濃度不同導致.脊柱彎曲和頭部畸形與神經細胞失調有關[25],因此需要進一步研究TCS 和BPA 暴露對神經發育的影響.

斑馬魚幼魚行為模型可以檢測大腦和神經系統的功能變化,例如空間和社交學習、記憶、焦慮以及由神經遞質驅動的社交或疾病行為,斑馬魚對光暗刺激和聲音做出反應的游泳則是一種反射反應,可以反應對光照及聲刺激的敏感性和感知神經的功能[15].在本研究中斑馬魚幼魚對外界刺激的反射行為以及運動能力發生了改變.自主運動、光暗節律和聲刺激行為學實驗顯示,TCS 和BPA 暴毒可導致幼魚運動距離和游動速率降低,運動行為活力下降,并損傷幼魚對光暗刺激和聲音刺激的感知神經功能,對斑馬魚幼魚運動行為有明顯抑制作用.Ling等[25]研究了TCS 對斑馬魚運動行為的影響,證實TCS 會導致斑馬魚自主運動活力下降并破壞斑馬魚幼魚的晝夜節律;Heredia-García 等[26]則對BPA誘導的行為障礙進行研究,發現BPA 暴露濃度為220μg/L 時會擾亂斑馬魚的運動行為,具體表現為移動距離的降低,這與本研究的結果相似, 表明TCS和BPA 會導致運動神經系統和感知神經功能障礙,且與BPA 相比,TCS 對神經行為的影響更大.

基于上述TCS 和BPA 暴露對斑馬魚幼魚大腦發育和運動行為的影響,考慮到運動行為的改變可能與神經元結構以及神經傳遞有關,本研究分析了TCS 和BPA 暴露對斑馬魚神經元發育的影響[27].在斑馬魚早期神經發育過程中,elavl3 基因承擔十分關鍵的作用,elavl3 基因缺位會導致視覺神經系統缺陷,伴隨神經系統發育不良,是神經系統發育的重要標志基因[16].由于脈管發育與神經系統發育密不可分,而fli1 基因在血管生成中起著重要作用[17].轉基因斑馬魚幼魚的綠色熒光觀察結果表明,TCS 和BPA具有神經毒性作用,會抑制中樞神經發育和血管生成,導致中樞神經元細胞熒光強度和面積下降,血管消融和頭部血管排列雜亂無序,證實TCS 及BPA 暴露會對斑馬魚神經元發育和血管發育產生影響.在之前.Wang等[29]證實TCS暴露濃度為250 μg/L時會導致大腦神經元數量減少,后腦和間腦間隙模糊不清[28].血管生成是一個較為復雜的過程,血管發育對維持大腦功能具有重要作用.在本研究中發現TCS和BPA 暴露會導致頭部血管無序分布,出現血管消融的情況,這與之前的研究相似[29].據報道,TCS 可誘導神經元細胞凋亡,Szykowski 等[30]研究發現TCS激活了芳香烴受體(AhR)依賴性細胞凋亡,并影響了小鼠新皮質神經元原代培養物中細胞色素P450 酶Cyp1a1 和Cyp1b1 的表達;Qi 等[31]的研究發現BPA會以濃度依賴性方式降低細胞活力并誘導細胞凋亡,在暴露于50 和70 μmol/L BPA 的細胞中觀察到細胞凋亡引起的細胞死亡,這與本文的研究結果一致.在本研究中TCS 和BPA 暴露下均出現了細胞凋亡信號增加的情況,表明TCS 和BPA 可通過誘導腦部細胞凋亡,對斑馬魚產生神經毒性作用.

為了從分子層面探究TCS 和BPA 對斑馬魚神經發育的影響,本研究通過RT-qPCR 分析了TCS 及BPA 急性暴露對斑馬魚的四種神經相關基因(elavl3、gfap、ngn1、gap43)的表達水平的變化.elavl3、gfap、ngn1、gap43 基因都是與斑馬魚神經系統發育具有較強關聯性的基因,在神經元發育、神經細胞的細胞命運、神經元軸突生長與再生過程中發揮重要作用,對評價神經系統發育具有重要意義[32].elavl3 基因和ngn1 基因是神經元發育的標記基因,elavl3 基因表達的缺失會引起視覺神經系統損傷,并導致神經發育損傷[16].ngn1 基因與神經軸突生長有較強關聯,ngn1 也在神經細胞的細胞命運過程中發揮作用[33].研究發現gfap是一種在中樞神經系統的成熟星形膠質細胞的骨架中表達的中間絲蛋白,該基因可作為一種生物標記物分析斑馬魚神經毒性,gfap基因表達量的下調表明神經膠質細胞可能受到損傷[34].gap43 基因與神經元軸突生長和再生有關,在神經受損重新生長時誘導軸突再生長,當神經元軸突再生發育時表達量上升[35].郭子一等[13]探索了三種內分泌干擾物對斑馬魚神經毒性效應和機制,發現elavl3、ngn1 和gfap在Hub 基因和神經標志功能基因蛋白間的互作網絡發揮重要作用.本研究RT-qPCR 結果證實,TCS 和BPA 暴露會改變與斑馬魚幼魚神經發育相關基因的表達水平,導致elavl3、gfap和ngn1 表達下降而對gap43 的表達沒有顯著影響,且TCS 對這幾個神經相關基因的表達水平的影響更大.基于TCS 及BPA 處理下神經發育相關基因表達水平的變化可以推測,TCS 和BPA 暴露通過抑制elavl3、ngn1 和gfap的表達,影響神經細胞的生長,造成神經系統損傷,且亞致死劑量下TCS 比BPA 對神經系統的損傷更嚴重.

乙酰膽堿酯酶(AChE)具有催化神經突觸間隙中乙酰膽堿水解的功能,在神經系統信號傳遞過程中起到非常關鍵的作用,可作為生物標志物來檢測發育性神經毒性,且與運動行為具有關聯性,其活性變化可作為衡量神經毒性的重要指標之一[36].已有研究表明,TCS 可以通過調控AChE 的表達,造成運動行為障礙并誘導神經毒性[27];Murugan 等[37]則證實BPA可以通過改變AChE 活性和誘導氧化應激對斑馬魚誘導神經毒性作用.本研究中AChE 結果表明,TCS 和BPA 暴露會影響神經沖動的正常傳遞,且TCS 組對神經傳遞的影響更大.

為進一步分析TCS 和BPA 誘導神經毒性的機制,基于生物信息學對TCS 和BPA 的作用靶基因在功能和富集通路上的異同進行分析,結果顯示TCS與BPA 在功能和涉及的通路上具有一定的相似性.值得注意的是,盡管TCS 和BPA 的靶基因在影響神經發育相關通路均有富集,但其誘導神經毒性的作用通路存在一定差異.TCS 靶基因在“配體激活的轉錄因子活性”以及“Wnt 信號通路”富集.芳香烴受體(AhR)是一種配體激活的轉錄因子,可以調控外源化合物代謝和控制細胞周期[38].之前的研究表明TCS 可以通過與芳香烴受體相互作用,降低大腦皮質層神經元中NF-κB 蛋白的表達,誘導神經毒性和細胞凋亡[30,39].最近的一項研究證實TCS 可能充當內分泌干擾物,影響小鼠神經元中Sirt1、Sirt3和AhR蛋白的表達,從而影響大腦中的神經激素平衡[40].Wnt 通路與胚胎發育、突觸生成與神經發生密切相關,Wnt 信號通路激活可抑制病理性神經炎癥的發生[41].BPA 的靶基因在胰島素信號通路、PPAR 信號通路、HIF-1 信號通路以及色氨酸代謝等代謝相關通路富集.PPAR 信號通路可以調節脂質代謝,最近的研究表明PPARs 的一種亞型PPARγ 具有抗氧化和抗炎功能,主要通過影響Wnt 信號通路、NF-κB信號通路等調控突觸可觸性,發揮神經保護作用[42].色氨酸是人體必需氨基酸之一,與神經遞質和蛋白質的產生密切相關,在中樞神經系統疾病和自身免疫疾病的發生和發展中發揮重要作用[43].TCS 和BPA 結構的區別可能是造成作用靶基因及基因富集通路不同的重要因素.TCS 可以通過影響生物的合成與代謝產生神經毒性,而BPA 則通過影響色氨酸、絡氨酸等氨基酸代謝以及PPAR 通路誘導神經炎癥的發生,產生神經毒性.Hub 基因篩選發現TCS和BPA 均能直接或間接作用于神經相關的Hub 基因,抑制神經元發育和誘導細胞異常增殖和凋亡,從而誘導神經毒性,這與之前的研究及我們實驗得出的結果相符.這些發現有利于進一步的了解TCS 和BPA 誘導的神經毒性效應和作用機制的異同.

4 結論

4.1 TCS 和BPA 可誘導斑馬魚幼魚產生卵黃囊腫、心包水腫、脊柱彎曲等畸形情況, 此外,與對照組相比,TCS 暴露組致畸率為43.7%(P<0.001),而BPA 致畸率為31.6%(P<0.05),表明TCS 和BPA 暴露誘導斑馬魚幼魚發育畸形,且相同劑量下TCS 對幼魚發育的影響更大.

4.2 行為學分析發現,TCS 和BPA 暴露導致幼魚運動活力下降,表現為移動距離和移動速度顯著降低(P<0.05、P<0.01);此外,光暗周期和聲刺激實驗發現TCS 和BPA 暴露損傷幼魚對光暗刺激和聲音刺激的感知神經功能,導致斑馬魚幼魚對光暗刺激和聲刺激敏感性降低.

4.3 TCS 和BPA 暴露影響斑馬魚神經和血管發育,減少中樞神經元的表達,并造成血管分布雜亂和血管消融.此外,TCS 和BPA 暴露還會導致頭部凋亡細胞數量增加,且TCS 比BPA 對神經和血管發育以及細胞凋亡的影響更大.抑制中樞神經元細胞的表達并導致血管發育障礙血管消融,且這種抑制可能是通過細胞凋亡誘導的.

4.4 生化指標檢測發現TCS 和BPA 通過影響斑馬魚幼魚體內乙酰膽堿酯酶活性,對神經傳導產生影響.RT-qPCR 結果顯示,TCS 和BPA 會降低與斑馬魚幼魚神經發育相關基因的表達水平,減少elavl3、gfap和ngn1 的表達,而對gap43 的影響不顯著,表明TCS 和BPA 影響乙酰膽堿酯酶以及elavl3、gfap、ngn1 和gap43 的表達,且TCS 對這些神經發育相關基因和乙酰膽堿酯酶的影響更大.

4.5 針對靶基因的GO 和KEGG 分析則說明TCS和BPA 作用的靶基因富集的功能和通路有一定相似性,均會對神經系統發育和功能產生影響,但TCS的內分泌干擾有關基因功能富集更為顯著,但二者涉及相關神經發育的代謝通路有所不同,TCS 可能通過內分泌干擾誘導神經毒性,而BPA 則可能通過影響氨基酸的合成與代謝誘導神經炎癥和神經疾病的發生.此外,誘導神經元發育異常和細胞增殖和凋亡異常也是TCS 和BPA 誘導神經毒性的潛在機制.