林麝解沒食子酸鏈球菌的分離鑒定及藥敏試驗

李 穎,黃志鑫,張琰杰,李 鵬,李旭鑫,胡清霞,呂 妮,李 超,謝宏林,李 哲,王興龍*

(1.西北農林科技大學,陜西楊凌 712100;2.片仔癀(漳州)醫藥有限公司,福建漳州 363000;3.陜西省銅川市新區坡頭街道辦事處,陜西銅川 727100;4.陜西省銅川市耀州區疫病預防控制中心,陜西銅川 727100)

林麝(forest musk deer)為哺乳綱偶蹄目反芻亞目,是我國一級保護瀕危野生動物。公麝有麝香腺能分泌麝香,麝香是四大名貴動物藥材之一。疫病是導致林麝死亡的重要原因,其中肺炎引起林麝死亡較多。肺炎是林麝呼吸道的主要疾病[1],銅綠假單胞菌[2]、肺炎克雷伯菌[3]等可以引起林麝肺炎,常見的肺炎癥狀主要是肺充血、出血、肺氣腫和肺部出現大小不等的化膿灶等癥狀。2021年10月某林麝養殖場連續出現林麝死亡,林麝出現精神沉郁、食欲減退、鼻腔有分泌物、咽部腫脹、呼吸困難等癥狀。為分析發病原因,對病死林麝剖檢,初步判斷為細菌性肺炎引起的敗血癥。為確診病因,采集病料通過病原菌分離純化、形態觀察、生化試驗和16S rRNA序列分析,并進行了藥物敏感性試驗,為該病的臨床用藥和養殖管理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與病料 昆明小鼠25只,購自科奧華仁生物公司。病料采自陜西省某林麝養殖場,病料樣品為2歲發病公麝的各臟器組織。

1.1.2 主要試劑 各種染色試劑、細菌微量生化反應管和抗菌素藥敏片,杭州濱和微生物試劑有限公司產品;普通營養培養基、LB營養培養基和綿羊血瓊脂培養基,南京諾唯贊生物科技有限公司產品;DNA Marker DL 2 000和2×TaqMasterMix,南京諾贊生物科技有限公司產品。

1.1.3 主要儀器 SHA-X恒溫搖床,上海智勝分析儀器制造有限公司產品;SW-CJ-IBU超凈工作臺,上海博訊實業有限公司產品;TC-5000 PCR儀,Techne有限公司產品;電泳儀,北京六一生物科技有限公司產品。

1.1.4 引物設計與合成 16S rRNA 擴增通用引物序列為LPW-57(5′-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和LPW-58(5′-AGGCCCGGGAACGTATTCAC-3′),由西安擎科生物科技股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離培養 對病料進行常規消毒,并觀察其病變部分。將病變部位無菌接種在綿陽血平板上,37℃恒溫培養24 h后觀察菌落顏色及形態。選取典型菌落接種于普通營養瓊脂和血平板上分離純化,37℃恒溫培養24 h,挑取單個菌落進行革蘭氏染色并鏡檢,觀察菌落形態。

1.2.2 分離菌株生化鑒定 挑取分離菌株培養物分別接種于葡萄糖、乳糖、尿素、V-P反應、棉籽糖、甘露醇、枸櫞酸鹽、阿拉伯糖、鼠李糖等細菌微量生化反應管中,于37℃培養18～24 h,分析并記錄反應結果,結果參照文獻判斷[4]。

1.2.3 分離菌株PCR鑒定 采用煮沸法提取模板DNA,用16S rRNA PCR通用引物LPW-57和LPW-58進行PCR擴增,目的條帶大小為1 300 bp。PCR擴增程序為:94℃ 2 min;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,35個循環;72℃ 5 min。將PCR產物送到西安擎科生物有限公司進行測序。陽性對照鴨源和牛源解沒食子酸鏈球菌由實驗室分離保存。

1.2.4 分離菌株藥敏試驗 利用藥敏紙片法進行藥敏試驗,挑取純培養的菌液100 μL,并均勻涂布于普通營養瓊脂平板上,用無菌鑷子貼上藥敏片,置37℃溫箱培養18 h,記錄抑菌圈直徑,抑菌環直徑判定依據歐盟藥敏試驗標準(EUCAST)。

1.2.5 小鼠的致病性試驗 挑純培養的單菌落溶于無菌PBS中制成菌懸液,按傾注平板培養方法進行活菌計數。 將25只小鼠隨機分成5個組,每組 5只。第1～4組為試驗組,第5組為空白對照組。對試驗組小鼠進行腹腔注射菌懸液 0.2 mL/只(含菌量為2×108CFU/mL、2×107CFU/mL、2×106CFU/mL、2×105CFU/mL),對照組小鼠接種相同劑量無菌PBS 0.2 mL/只,各組接種后隔離飼養,每隔12 h觀察小鼠臨床表現。對各組出現癥狀及死亡小鼠進行剖檢,觀察病變無菌分離細菌[5]。

2 結果

2.1 臨床表現及剖檢病理變化

發病林麝最初出現發熱、厭食癥狀,部分林麝體溫可達41℃,隨后鼻腔流出黏液性分泌物,呼吸急促、氣喘,精神沉郁、食欲廢絕、停止反芻;部分發病麝跛行、難以站立;頭頸扭曲,出現神經癥狀(圖1A);眼結膜充血。死亡林麝剖檢可見肺臟腫大、廣泛性出血(圖1B),淋巴結、咽部以及膽囊腫大;肝臟腫大邊緣鈍厚有出血點,其病灶區與胸腔粘連。腎臟和脾臟有出血點,腎臟質感脆。

圖 1患病林麝臨床癥狀及剖檢肺臟變化

2.2 分離菌株的形態鑒定

將菌株接種于綿羊血瓊脂培養基,37℃培養24 h,菌落為灰白色、透明、濕潤黏稠,露珠狀,周圍出現β型溶血環。鏡檢發現為革蘭氏陽性球菌,命名為YL-1(圖2)。

A.血平板生長形態; B.革蘭染色鏡檢(1 000×)

2.3 生化鑒定

分離菌在葡萄糖、乳糖、尿素、VP反應、棉籽糖、甘露醇試劑管反應均呈陽性,在枸櫞酸鹽、阿拉伯糖、鼠李糖試劑管反應均呈陰性(表1)。與解沒食子酸鏈球菌的生化結果一致,因此初步確定分離菌株為解沒食子酸鏈球菌。

表1 分離菌株的生化特性

2.4 分離菌株的16S rRNA PCR分子鑒定

對分離菌株進行16S rRNA PCR檢測,PCR擴增產物大小為1 300 bp左右(圖3),與預期片段大小一致。將測序結果與NCBI數據庫中已有的序列進行Blast對比,與致病性解沒食子酸鏈球菌(GenBank登錄號:No-CP054015)相似性達到99%,系統進化分析結果(圖4)顯示,YL-1與其他分離菌株親緣關系較遠。

M.DNA標準DL 2 000; 1.分離菌株; 2.鴨源解沒食子酸鏈球菌; 3.牛源解沒食子酸鏈球菌; 4.陰性對照

圖4 基于16S rRNA基因構建的系統發育樹

2.5 藥物敏感性試驗結果

分離菌對環丙沙星、頭孢拉定、氧氟沙星、氯霉素、丁胺卡那、哌拉西林、新霉素、麥迪霉素、新霉素、四環素和紅霉素等藥物敏感,對苯唑西林、頭孢呋辛、多黏菌素B、復方新諾明等有耐藥性(表2)。

表2 分離菌的藥敏試驗結果

2.6 致病性試驗結果

25只昆明系小鼠接種菌液后出現精神沉郁、采食活動減少、弓腰、顫抖等臨床癥狀。攻毒1組(2×108CFU/mL)從第4天開始死亡,到第7天小鼠全部死亡;攻毒2組(2×107CFU/mL)從第5天開始逐漸死亡,到第7天小鼠全部死亡(圖5);PBS對照組小鼠未出現死亡,精神、食欲正常。從死亡小鼠的肺臟、肝臟和腎臟中能分離到該致病菌(圖6),說明分離得到的解沒食子酸鏈球菌具有致病性。

圖5 不同菌液濃度下小鼠的生存曲線

A.肺臟; B.肝臟; C.腎臟

3 討論

分離菌為牛鏈球菌,牛鏈球菌包括7個不同的種和亞種,即解沒食子酸鏈球菌解沒食子酸亞種、解沒食子酸鏈球菌巴氏亞種、馬腸鏈球菌、解沒食子酸鏈球菌馬其頓亞種、嬰兒鏈球菌嬰兒亞種、嬰兒鏈球菌結腸亞種和非解乳鏈球菌[6]。該菌首次在樹袋熊的排泄物中分離出[7],在人和多種動物中也分離到該菌[8]。人類感染主要是引起新生兒的敗血癥、腦膜炎和老年人的敗血癥、心內膜炎。動物的感染主要是引起多器官的損傷及敗血癥。由此可見該菌對人和動物影響非常大,目前在我國對該病研究較少,但隨相關病例報道數量的增加,應對該菌予以重視。

對病死林麝剖檢結果顯示,此菌對林麝的肝臟、肺臟等均有不同的損害,且病變明顯。由于發病林麝數量較多,且發病時間較集中,呼吸道感染的可能性較大,因此防控該病需要保持圈舍干凈、干燥、通風,每天清理糞便等雜物,保持地面清潔。另外,加強飼養管理,做好防凍措施,增強林麝自身抵抗力。林麝解沒食子酸鏈球菌對獸醫臨床常用抗菌藥物表現出較高的耐藥性,通過藥物敏感性試驗選擇高效的抗菌藥物予以及時治療,才可能獲得理想治療效果。解沒食子酸鏈球菌主要通過呼吸道方式傳播,患病林麝應及時隔離,切斷傳染源。

分離菌對健康昆明小鼠具有明顯的致病性。試驗組小鼠接種菌液后12 h開始出現精神沉郁、采食活動減少、弓腰、顫抖等臨床癥狀,直至死亡。剖檢可見小鼠肝臟、肺臟有出血點,肺臟腫大,腸壁變薄。本研究從病死林麝分離獲得致病性解沒食子酸鏈球菌,并證明了其致病性,分析了其藥物敏感性,特別是證明了解沒食子酸鏈球菌可能是林麝肺炎致病病原之一,為相關林麝的疫病防控提供了參考資料。