頂復(fù)門原蟲多胺合成研究進(jìn)展

殷熙娟,廖申權(quán),戚南山,李 娟,呂敏娜,蔡海明,胡俊菁,林栩慧,宋勇樂,張健騑,劉文俊,孫銘飛*

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院,廣東廣州 510225;2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部禽流感等家禽重大疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心,廣東廣州 510640)

頂復(fù)門原蟲是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲,包括瘧原蟲(Plasmodiumspp.)、弓形蟲(Toxoplasmagondii)、隱孢子蟲(Cryptosporidiumspp.)及艾美耳球蟲(Eimeriaspp.)等。當(dāng)前寄生原蟲病的防治主要依賴抗原蟲藥物,隨著抗原蟲藥物長(zhǎng)期使用,寄生原蟲對(duì)絕大多數(shù)藥物出現(xiàn)耐藥性,且耐藥性問題日益嚴(yán)重,因而,抗原蟲藥物靶標(biāo)的研究及新型抑制劑篩選成為研究的熱點(diǎn)之一。多胺(polyamines,PAs)是一類含有2個(gè)或以上氨基,帶正電荷的小分子脂肪族化合物,廣泛存在于生物體內(nèi),可以與DNA、RNA、蛋白質(zhì)及含有負(fù)電荷基團(tuán)的磷脂物質(zhì)結(jié)合,參與維持細(xì)胞核酸和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、離子通道調(diào)節(jié)與蛋白質(zhì)合成,還可以通過調(diào)節(jié)翻譯起始過程關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子真核起始因子2和真核細(xì)胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1的磷酸化,以及利用亞精胺作為真核生物翻譯起始因子5A的誘導(dǎo)前體來調(diào)節(jié)翻譯起始和延伸[1]。多胺在頂復(fù)門原蟲生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖與致病等多個(gè)階段發(fā)揮重要作用[2]。頂復(fù)門原蟲的多胺合成途徑與宿主細(xì)胞的經(jīng)典路徑不同,寄生原蟲的多胺生物合成路徑存在多樣性,具有經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑[3];并且頂復(fù)門原蟲多胺代謝限速酶,如鳥氨酸脫羧酶和S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶等半衰期與宿主細(xì)胞限速酶的半衰期存在顯著差異[4]。近年來,以頂復(fù)門原蟲多胺合成限速酶及多胺轉(zhuǎn)運(yùn)載體為靶標(biāo)的抗寄生原蟲抑制劑研究取得了一定進(jìn)展。本文就頂復(fù)門原蟲多胺的生物學(xué)功能、生物合成及抗原蟲抑制劑研究等進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 多胺的生物學(xué)功能

多胺是一類聚陽(yáng)離子脂肪族化合物,存在于所有的細(xì)胞中,是細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的物質(zhì)。多胺是由帶氨基的碳鏈組成的小分子,其氨基帶正電荷,能夠與DNA、RNA、蛋白質(zhì)及含有負(fù)電荷基團(tuán)的磷脂物質(zhì)通過離子鍵和氫鍵結(jié)合。哺乳動(dòng)物與頂復(fù)門原蟲細(xì)胞內(nèi)的多胺包括腐胺(putrescine,Put)、亞精胺(spermidine,Spd)和精胺,主要參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖與分化等,在頂復(fù)門原蟲的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖多個(gè)階段發(fā)揮重要作用。真核生物多胺合成途徑高度保守,通過經(jīng)典途徑合成多胺,該途徑的合成底物為鳥氨酸,利用精氨酸酶(arginase,ARG)將L-精氨酸轉(zhuǎn)換為L(zhǎng)-鳥氨酸,再通過鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase,ODC)作用產(chǎn)生腐胺;然后利用S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase,AdoMetDC)將S-腺苷甲硫氨酸脫羧,生成脫羧S-腺苷甲硫氨酸(decarboxylated S-adenosylmethionine,dcSAM);將dcSAM作為氨基丙基供體,在亞精胺合成酶(spermidine synthase,SpdS)作用下將腐胺轉(zhuǎn)化為亞精胺;亞精胺經(jīng)精胺合成酶作用生成精胺[5]。

2 頂復(fù)門原蟲的多胺生物合成

2.1 瘧原蟲多胺合成途徑

多胺參與瘧原蟲的發(fā)育和繁殖過程,尤其在蟲體快速繁殖的裂殖體時(shí)期對(duì)多胺的需求量增多。研究發(fā)現(xiàn)瘧原蟲體內(nèi)多胺的含量從環(huán)形體到裂殖體升高了10～20倍,并且瘧原蟲體內(nèi)多胺主要為亞精胺,其次為腐胺和精胺[6]。瘧原蟲通過經(jīng)典途徑合成多胺,參與多胺生物合成的酶包括精氨酸酶、鳥氨酸脫羧酶、S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶和亞精胺合成酶,研究顯示瘧原蟲缺少精胺合成酶,但亞精胺可以通過亞精胺合成酶作用生成精胺[7]。

2.1.1 瘧原蟲ODC/AdoMetDC的生物學(xué)功能 惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)多胺的生物合成由ODC和AdoMetDC兩個(gè)限速酶調(diào)控,與其他物種不同的是,瘧原蟲的ODC/AdoMetDC是一種雙功能酶,由同一個(gè)開放閱讀框編碼,氨基端的AdoMetDC與羧基端的ODC由一段含274個(gè)氨基酸的鉸鏈區(qū)相連。PfODC/AdoMetDC由氨基端的AdoMetDC和羧基端的ODC二聚體構(gòu)成異源四聚體[8]。研究發(fā)現(xiàn),PfODC/AdoMetDC雙功能酶的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各自發(fā)揮其生物學(xué)功能,抑制PfODC/AdoMetDC雙功能酶中ODC結(jié)構(gòu)域的酶活性并不影響AdoMetDC的酶活性,反之亦然。PfODC/AdoMetDC對(duì)鳥氨酸和S-腺苷甲硫氨酸的Km值分別為41 μmol/L和58 μmol/L;鳥氨酸和S-腺苷甲硫氨酸的酶活性分別為38和20 nmol/min每mg蛋白,PfODC/AdoMetDC對(duì)兩個(gè)底物的催化效率相近,提示可能與瘧原蟲維持腐胺生成與S-腺苷甲硫氨酸脫羧平衡相關(guān)[8]。然而研究顯示,宿主細(xì)胞ODC對(duì)鳥氨酸催化活性達(dá)12 800 nmol/min每mg蛋白,較PfODC/AdoMetDC對(duì)鳥氨酸的催化活性高[9]。PfODC/AdoMetDC是瘧原蟲多胺合成的主要調(diào)控酶,瘧原蟲ODC/AdoMetDC調(diào)節(jié)機(jī)制與哺乳動(dòng)物ODC和AdoMetDC均不同,研究表明,腐胺反饋抑制PfODC的效率是哺乳動(dòng)物ODC的10倍;二胺可以激活哺乳動(dòng)物AdoMetDC活性,而對(duì)PfAdoMetDC無效。PfODC/AdoMetDC的半衰期為2 h,而宿主細(xì)胞ODC和AdoMetDC的半衰期約15～35 min,與瘧原蟲ODC/AdoMetDC半衰期相比較短[10]。PfODC/AdoMetDC與宿主ODC和AdoMetDC生物學(xué)特性存在明顯差異,因此,PfODC/AdoMetDC已成為抗瘧原蟲藥物的潛在靶標(biāo)。

2.1.2 瘧原蟲ARG的生物學(xué)功能 瘧原蟲精氨酸酶水解L-精氨酸生成L-鳥氨酸和尿素,為Mn2+激活。PfARG由411個(gè)氨基酸殘基組成,分子質(zhì)量為46.5 ku,PfARG與人精氨酸酶hARGⅠ和hARGⅡ的相似性分別為28%和27%。PfARG是一種三聚體蛋白,分析發(fā)現(xiàn)PfARG存在兩段多肽序列的插入,分別是位于L2環(huán)由74個(gè)氨基酸殘基組成的低復(fù)雜度區(qū)域和L8環(huán)的11個(gè)氨基酸殘基,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),L2環(huán)的低復(fù)雜度區(qū)域偏離三聚體界面,對(duì)酶活性影響不顯著;而L8環(huán)氨基酸殘基位于三聚體界面,參與多個(gè)分子內(nèi)和分子間的相互作用,對(duì)酶活性至關(guān)重要。PfARG對(duì)精氨酸的Km值為13 mmol/L,Vmax值為每mg蛋白31 μmol/min[11]。用伯氏瘧原蟲(P.berghei)arg-基因缺失株子孢子感染小鼠,發(fā)現(xiàn)P.berghei在小鼠體內(nèi)的紅細(xì)胞外期感染力顯著下降[12],提示ARG可作為抗瘧原蟲紅細(xì)胞外期感染藥物的潛在靶標(biāo)。

2.1.3 瘧原蟲SpdS的生物學(xué)功能 瘧原蟲亞精胺合成酶PfSpdS由321個(gè)氨基酸殘基組成,分子質(zhì)量為36.6 ku。PfSpdS與人亞精胺合成酶hSpdS的相似性為37.4%[13]。Northern blot和Western blot分析發(fā)現(xiàn),PfSpdS在瘧原蟲成熟滋養(yǎng)體階段高表達(dá);間接免疫熒光試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PfSpdS定位于蟲體細(xì)胞質(zhì)。PfSpdS對(duì)腐胺和S-腺苷甲硫氨酸的Km值分別為52.0 μmol/L和35.3 μmol/L。瘧原蟲缺少精胺合成酶,利用高效液相色譜技術(shù)(high performance liquid chromatography,HPLC)發(fā)現(xiàn)PfSpdS還具有亞精胺氨基丙基轉(zhuǎn)移酶活性,將亞精胺轉(zhuǎn)化為精胺,PfSpdS對(duì)亞精胺的Vmax值為75.3 nmol/min每mg蛋白,該催化效率為PfSpdS對(duì)腐胺催化效率的15%,該結(jié)果與前期研究并未在瘧原蟲基因組數(shù)據(jù)中注釋到精胺合成酶,以及在瘧原蟲體內(nèi)檢測(cè)到較低水平精胺的結(jié)果相一致;并且在此催化反應(yīng)中生成的甲硫腺苷是PfSpdS的反饋抑制劑,其對(duì)PfSpdS半數(shù)抑制濃度(IC50)為159 μmol/L[13]。構(gòu)建約氏瘧原蟲(P.yoelii)PySpdS基因缺失株[14],發(fā)現(xiàn)PySpdS血紅期約氏瘧原蟲的生存至關(guān)重要。近年來研究解析了PfSpdS與底物腐胺、亞精胺,以及與抑制劑AdoDATO、4MCHA等的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu),為以PfSpdS靶標(biāo)的抑制劑篩選提供試驗(yàn)依據(jù)。

2.1.4 瘧原蟲多胺的轉(zhuǎn)運(yùn) 瘧原蟲可以利用從頭合成途徑合成多胺,并為蟲體提供腐胺、亞精胺和精胺等主要的多胺來源,此外,瘧原蟲還利用轉(zhuǎn)運(yùn)載體從宿主細(xì)胞攝取多胺及多胺合成所需底物。早期研究發(fā)現(xiàn)正常紅細(xì)胞不合成多胺,在紅細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)出亞精胺和精胺[15]。分析諾氏瘧原蟲(P.knowlesi)腐胺轉(zhuǎn)運(yùn)載體,發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞感染P.knowlesi后,從發(fā)育早期的環(huán)形體即可檢出腐胺,且呈現(xiàn)時(shí)間和溫度依賴性的飽和狀態(tài)。感染細(xì)胞與正常細(xì)胞的腐胺轉(zhuǎn)運(yùn)載體對(duì)腐胺的親和力相近,其Km值分別為34.6 μmol/L和37.2 μmol/L;但感染細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)載體對(duì)腐胺的轉(zhuǎn)運(yùn)效率更高,感染細(xì)胞與正常細(xì)胞對(duì)腐胺轉(zhuǎn)運(yùn)的Vmax值分別為11.6和4.21 nmol/min每100億個(gè)紅細(xì)胞。伯氏瘧原蟲精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體是一種陽(yáng)離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體,在蟲體配子生殖時(shí)期起著至關(guān)重要作用[16]。瘧原蟲陽(yáng)離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體家族蛋白中溶質(zhì)運(yùn)載蛋白家族蛋白7可以轉(zhuǎn)運(yùn)精氨酸、L-賴氨酸和L-鳥氨酸等陽(yáng)離子氨基酸[17];并且證實(shí)肝內(nèi)期瘧原蟲主要通過捕獲宿主細(xì)胞精氨酸,通過精氨酸-ODC/AdoMetDC途徑合成蟲體發(fā)育所需的多胺,提示精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白家族蛋白7在蟲體肝細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育期起著重要作用,可以作為抗瘧原蟲藥物的潛在靶標(biāo)。

2.2 弓形蟲多胺合成途徑

弓形蟲缺少精氨酸脫羧酶和鳥氨酸脫羧酶,不能用精氨酸從頭合成蟲體所需的多胺[18]。弓形蟲用逆轉(zhuǎn)途徑生成亞精胺和腐胺,參與該逆轉(zhuǎn)途徑的酶包括亞精胺/精胺N1乙酰基轉(zhuǎn)移酶、亞精胺N1乙酰基轉(zhuǎn)移酶(spermidine N1-acetyltransferase,SAT)和多胺氧化酶(polyamine oxidase,PAO)[3]。弓形蟲以精胺為底物,利用Tg乙酰基轉(zhuǎn)移酶或TgPAO將精胺轉(zhuǎn)化為亞精胺;再通過TgSAT或TgPAO將亞精胺轉(zhuǎn)換為腐胺。Tg乙酰基轉(zhuǎn)移酶對(duì)精胺的Km值為180 mmol/L,酶活性為1.84 nmol/min每mg蛋白;TgSAT對(duì)亞精胺的Km值為240 mmol/L,酶活性為3.95 nmol/min每mg蛋白;TgPAO對(duì)乙酰精胺的Km值為36 mmol/L,酶活性為10.6 nmol/min每mg蛋白。HPLC技術(shù)分析發(fā)現(xiàn),弓形蟲體內(nèi)主要的多胺成分為亞精胺,其次為腐胺和精胺[19]。

研究發(fā)現(xiàn),弓形蟲存在腐胺、精氨酸和鳥氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體,可以從宿主細(xì)胞攝取腐胺、精氨酸和鳥氨酸,其中腐胺轉(zhuǎn)運(yùn)載體對(duì)腐胺的親和力高,其Km值為0.9 μmol/L[20]。弓形蟲精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體TgNTP1存在12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,分子質(zhì)量約58 ku,TgNTP1對(duì)精氨酸的Km值為88 μmol/L,Vmax為3.5 pmol/min每個(gè)卵囊。TgNTP1對(duì)精氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)作用不依賴Na+、Cl-、K+、Mg2+或Ca2+等離子,但對(duì)pH敏感,當(dāng)pH>8時(shí),TgNTP1對(duì)精氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)效率顯著下降。同時(shí),研究表明TgNTP1在弓形蟲發(fā)育及致病過程中起著重要作用[21],是抗弓形蟲藥物研發(fā)的潛在靶標(biāo)之一。

2.3 其他頂復(fù)門原蟲多胺合成途徑

微小隱孢子蟲(Cryptosporidiumparvum)多胺合成途徑與植物及部分細(xì)菌利用途徑相近,通過非經(jīng)典途徑合成多胺,參與該途徑的酶包括精氨酸脫羧酶(arginine decarboxylase,ADC),鯡精胺亞胺水解酶(agmatine iminohydrolase,AIH)、亞精胺/精胺N1乙酰基轉(zhuǎn)移酶和亞精胺N1乙酰基轉(zhuǎn)移酶(SAT)。研究發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲缺失ODC,利用CpADC起始多胺合成,CpADC將精氨酸脫羧生成鯡精胺,再通過CpAIH作用生成腐胺;隱孢子蟲也可以利用Cp乙酰基轉(zhuǎn)移酶通過逆轉(zhuǎn)途徑生成亞精胺,亞精胺經(jīng)CpSAT作用生成腐胺。CpADC是隱孢子蟲多胺合成途徑的限速酶,分子質(zhì)量為106 ku,最適反應(yīng)pH值為6.7,對(duì)精氨酸的Km值為200 μmol/L,Vmax值為325 pmol/h每mg蛋白;隱孢子蟲乙酰基轉(zhuǎn)移酶對(duì)精胺的Km值為50 μmol/L,Vmax值為7 970 pmol/h每mg蛋白,SAT亞精胺的Km值為130 μmol/L,Vmax值為1 044 pmol/h每mg蛋白。隱孢子蟲也具有AdoMetDC酶活性,作用生成的S-腺苷甲硫氨酸為蟲體亞精胺和精胺合成提供氨基丙基供體,其Vmax值為331 pmol/h每mg蛋白。研究顯示,隱孢子蟲體內(nèi)多胺成分以亞精胺為主,其次為鳥氨酸、鯡精胺、精胺、精氨酸和腐胺。

艾美耳球蟲多胺代謝途徑研究進(jìn)展較少,柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)具有ODC、AdoMetDC酶活性,其中EtODC對(duì)鳥氨酸的Vmax值為17 pmol/h每mg蛋白,EtAdoMetDC對(duì)S-腺苷甲硫氨酸的Vmax值為252 pmol/h每mg蛋白。EtAdoMetDC酶活性可以被Mg2+激活,腐胺對(duì)其酶活性無影響;然而CpAdoMetDC酶活性可以被腐胺激活,Mg2+對(duì)其酶活性無影響,兩者的生物學(xué)特性存在明顯差異。HPLC分析E.tenella蟲體內(nèi)多胺成分以精氨酸為主,其次為鳥氨酸和少量的腐胺、亞精胺和精胺。

頂復(fù)門原蟲多胺合成途徑呈現(xiàn)多樣性,瘧原蟲具有從頭合成途徑,弓形蟲主要利用轉(zhuǎn)運(yùn)攝取或逆轉(zhuǎn)途徑合成多胺,隱孢子蟲利用與植物、細(xì)菌等更相近的途徑合成多胺,艾美耳球蟲可能存在從頭合成多胺途徑,但目前研究較少[3]。這些研究結(jié)果提示,頂復(fù)門原蟲多胺合成方式的多樣化可能與蟲體多樣化的寄生部位相關(guān),如微小隱孢子蟲主要寄生于小腸上皮細(xì)胞的刷狀緣納蟲空泡內(nèi),并非完全寄生于宿主細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi),推測(cè)蟲體可能依賴從腸腔攝取多胺合成底物,如攝取宿主腸腔富含的精氨酸等進(jìn)行多胺合成。多胺在頂復(fù)門原蟲生存、發(fā)育、繁殖及致病過程中發(fā)揮著重要作用,以頂復(fù)門原蟲多胺合成途徑限速酶或轉(zhuǎn)運(yùn)載體為潛在靶標(biāo)的研究受到較多關(guān)注。

3 頂復(fù)門原蟲多胺合成的應(yīng)用研究

以頂復(fù)門原蟲多胺合成途徑限速酶(ODC、AdoMetDC、ADC、SpdS),以及多胺轉(zhuǎn)運(yùn)載體為潛在靶點(diǎn)的抑制劑研究較為廣泛(表1)。早期研究發(fā)現(xiàn)二氟甲基鳥氨酸(DL-α- difluoromethylornithine,DFMO)是ODC的不可逆抑制劑,DFMO最初被研發(fā)作為抗癌藥,隨后用于抗由布氏岡比亞錐蟲(Trypanosomabruceigambiense)所引起的非洲昏睡病;研究顯示DFMO對(duì)PfODC的親和力低,Ki值為87 600 μmol/L;對(duì)體外P.falciparum繁殖的IC50值為1 250 μmol/L[22]。DFMO在30 μmol/L時(shí)對(duì)體外E.tenella繁殖的抑制率達(dá)56%,但DFMO在抗瘧原蟲和抗球蟲的作用效果未達(dá)到臨床應(yīng)用效果,推測(cè)可能與瘧原蟲和球蟲對(duì)DFMO吸收效率低相關(guān)[3]。隨后研發(fā)了新的ODC抑制劑3-氨基氧-1-氨基丙烷(3-aminooxy-1-aminopropane,APA) 及其衍生物CGP52622A 和CGP54169A,對(duì)體外P.falciparum繁殖的IC50值分別為1.0、2.7、2.0 μmol/L,選擇指數(shù)分別為12.8、4.5和20.4,其中APA和衍生物CGP54169A對(duì)宿主細(xì)胞安全性更好[6]。研究發(fā)現(xiàn)甲基丙脒腙(methylglyoxal bis guanylhydrazone,MGBG)和MDL73811可以抑制AdoMetDC酶活性,其中MDL73811對(duì)PfAdoMetDC的Ki值為1.6 μmol/L,MGBG和MDL73811對(duì)體外P.falciparum的IC50值分別為224 μmol/L和3.0 μmol/L;PfAdoMetDC抑制劑CGP40215A和CGP48664A,兩種對(duì)PfAdoMetDC的Ki值分別為0.8 μmol/L和3.0 μmol/L,對(duì)P.falciparum的IC50值分別為1.8 μmol/L和8.8 μmol/L,其中CGP40215A的選擇指數(shù)值為41.3,而CGP48664A對(duì)宿主細(xì)胞的IC50值僅為0.18 μmol/L,該衍生物對(duì)宿主細(xì)胞毒性較大[6]。

表1 頂復(fù)門原蟲多胺合成與轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑

二氟甲基精氨酸(α-difluoromethylarginine,DFMA)可以抑制隱孢子蟲ADC活性,對(duì)體外微小隱孢子蟲繁殖的IC50值為30 μmol/L[3];未檢測(cè)到DFMO對(duì)微小隱孢子蟲的抑制效果,與微小隱孢子蟲缺失DFMO靶標(biāo)ODC研究結(jié)果相一致。環(huán)己胺(cyclohexylamine,CHA)、反式-4-甲基環(huán)己胺(trans-4- Methylcyclohexylamine,4MCHA)和5-氨基-1-戊烯(5-amino-1-pentene,APE)可以特異性抑制PfSpdS酶活性,其中4MCHA具有較好的抑制效果,對(duì)PfSpdS的IC50值為1.4 μmol/L,對(duì)體外瘧原蟲生長(zhǎng)抑制的IC50值為34.2 μmol/L[13]。研究也發(fā)現(xiàn)1-氨氧基-3-氨基丙烷可以抑制PfSpdS酶活性,其對(duì)PfSpdS的IC50值為84 μmol/L,抑制效率較對(duì)PfODC的低,推測(cè)APA因可以同時(shí)抑制PfODC與PfSpdS的酶活性,因而APA具有很好的抗瘧原蟲生長(zhǎng)效果,其抑制蟲體生長(zhǎng)的IC50值僅為1.0 μmol/L[6]。隨后,研究發(fā)現(xiàn)N-(3-氨丙基)環(huán)己胺(N-(3-aminopropyl)- cyclohexylamine,NAC)、4-甲基苯胺(4-methylaniline,4MAN)、S-腺苷-3-巰基-1,8-二胺基辛烷(S-adenosyl-3-thio-1,8- diaminooctane,AdoDATO)可以特異性抑制PfSpdS酶活性,其中NAC抑制PfSpdS活性的IC50值為7.4 μmol/L[22]。

研究發(fā)現(xiàn)多胺類似物可以抑制多胺合成底物轉(zhuǎn)運(yùn)載體活性,從而抑制頂復(fù)門原蟲發(fā)育和繁殖。二芐基多胺類似物MDL27695可以抑制多胺轉(zhuǎn)運(yùn),從而抑制瘧原蟲生長(zhǎng),MDL27695對(duì)瘧原蟲抑制率IC50值為3 μmol/L。基于MDL27695結(jié)構(gòu)信息合成N,N′-脂肪族二胺系列衍生物,這些化合物可以有效抑制瘧原蟲和弓形蟲轉(zhuǎn)運(yùn)載體活性,其中化合物4、15、26和27對(duì)瘧原蟲抑制效果明顯,其IC50值均低于0.4 μmol/L;化合物13和25對(duì)弓形蟲抑制效果較好,1 μmol/L濃度化合物13可以抑制75%的弓形蟲發(fā)育,而1 μmol/L濃度化合物25可以完全抑制弓形蟲發(fā)育[24]。MDL27695以及N,N′-脂肪族二胺衍生物具有良好的體外抗原蟲效果,仍有待于通過動(dòng)物模型試驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)價(jià)這些衍生物的抗原蟲效果。

4 展望

頂復(fù)門原蟲的感染可引起瘧原蟲病、弓形蟲病、隱孢子蟲病和球蟲病等,嚴(yán)重危害人類與動(dòng)物健康。由于抗原蟲藥物的長(zhǎng)期使用,耐藥性問題日益突出,發(fā)現(xiàn)新的抗原蟲藥物靶標(biāo)并進(jìn)行抑制劑研發(fā)成為抗原蟲藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。多胺作為一種細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的脂肪族化合物,在頂復(fù)門原蟲的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖和致病等多個(gè)階段發(fā)揮重要作用,因而,以頂復(fù)門原蟲多胺生物合成限速酶為靶點(diǎn),開展抗原蟲藥物的研發(fā)成為近年來的研究熱點(diǎn)。二氟甲基鳥氨酸是多胺生物合成限速酶鳥氨酸脫羧酶的特異性抑制劑,臨床上用于治療由布氏岡比亞錐蟲寄生引起的非洲昏睡病。二氟甲基鳥氨酸在抗瘧原蟲和抗球蟲的作用效果并未達(dá)到臨床應(yīng)用效果,可能是瘧原蟲和球蟲對(duì)二氟甲基鳥氨酸吸收效率低。用計(jì)算機(jī)輔助虛擬篩選技術(shù),針對(duì)頂復(fù)門原蟲多胺生物合成限速酶鳥氨酸脫羧酶、S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶、亞精胺合成酶及多胺轉(zhuǎn)運(yùn)載體等開展了系統(tǒng)的抑制劑篩選工作,通過體外試驗(yàn)表明部分抑制劑的半數(shù)抑制濃度達(dá)至納摩爾級(jí),具有明顯的抑制原蟲生長(zhǎng)、發(fā)育的效果。基于藥物靶標(biāo)開展計(jì)算機(jī)輔助的虛擬篩選技術(shù)的應(yīng)用,加快了抗原蟲抑制劑篩選效率,為新型抗原蟲藥物的研發(fā)提供可借鑒的新思路和新技術(shù)。后續(xù)研究工作將利用動(dòng)物模型試驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)價(jià)這些抑制劑在體內(nèi)的作用效果,闡明多胺合成途徑抑制劑的作用效果,為抗原蟲新藥研發(fā)提供理論依據(jù)。