新流腺三聯(lián)滅活疫苗對(duì)禽流感病毒和禽腺病毒流行株攻毒的免疫保護(hù)試驗(yàn)

楊靈芝,李本科,朱 杰,李振清,李桂芹

(1.山東博萊威生物技術(shù)研究所,山東濱州 256606;2.山東濱州沃華生物工程有限公司,山東濱州 256606;3.濱州市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,山東濱州 256600; 4.濱州職業(yè)學(xué)院,山東濱州 256603)

我國(guó)是蛋雞、肉雞養(yǎng)殖大國(guó),據(jù)統(tǒng)計(jì)2021年我國(guó)商品蛋雞存欄量11億只,肉雞出欄量高達(dá)125億只,雞新城疫、H9亞型禽流感和禽腺病毒病(Ⅰ群,4型)等傳染病是目前危害我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重要病毒性傳染病[1-3],嚴(yán)重危害我國(guó)的養(yǎng)雞產(chǎn)業(yè),給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

雞新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的禽的一種急性、高度接觸性傳染病,是危害當(dāng)前養(yǎng)禽業(yè)最嚴(yán)重的禽病之一,世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為必須報(bào)告的動(dòng)物疫病,我國(guó)在《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012-2020)》中,將其列為優(yōu)先防治的5種一類動(dòng)物疫病之一。本病主要侵害雞和火雞,其中雞最易感,多呈敗血癥經(jīng)過,主要特征是呼吸困難、下痢和神經(jīng)癥狀,主要病變?yōu)轲つぁ{膜出血[4]。禽流感(Avian influenza,AI)是由H9亞型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的以出現(xiàn)呼吸道癥狀、神經(jīng)癥狀、高發(fā)病率、心包炎、胰臟多量壞死點(diǎn)或壞死灶,蛋、種雞產(chǎn)蛋量急劇下降等為主要特征的一種病毒性傳染病,主要病變是以鼻腔黏膜發(fā)炎,鼻腔和眶下竇充有漿液或黏液,有的病例呈干酪樣,鼻咽部和氣管黏膜充血,氣囊混濁、水腫或有纖維素性炎癥為特征[4]。禽腺病毒病又稱安卡拉病,是由Ⅰ群4型禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)引起的急性高度致死性傳染病,死亡迅速,流行面廣,給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病在肉雞、肉種雞、蛋雞、麻雞、三黃雞均有發(fā)病,各個(gè)日齡均可感染,死亡率高,以水平傳播為主。剖檢最明顯的特征是心包腔有黃色或淡黃色積液、肺水腫、肝腫大,部分雞的腎臟或胰腺出血[5-7]。

疫苗預(yù)防接種仍是控制這些家禽傳染病的有效手段,但由于禽病的種類多,并且新的疫病及變異株不斷出現(xiàn),使得雞只不得不多次接種疫苗,這不但費(fèi)時(shí)費(fèi)力,而且會(huì)引起雞群的應(yīng)激反應(yīng)。因此,雞新城疫、禽流感(H9亞型)、禽腺病毒病(Ⅰ群,4型)三聯(lián)滅活疫苗成為目前我國(guó)養(yǎng)雞市場(chǎng)急需的疫苗產(chǎn)品,免疫一次即可有效控制這3種傳染病的發(fā)生[8-10]。本研究采用雞新城疫病毒La Sota株、H9亞型禽流感病毒YT株和禽腺病毒(Ⅰ群4型)QD株制備雞新城疫、禽流感(H9亞型)、禽腺病毒病(Ⅰ群,4型)三聯(lián)滅活疫苗,并通過測(cè)定疫苗對(duì)2020-2022年在國(guó)內(nèi)分離的H9亞型禽流感和禽腺病毒(Ⅰ群4型)流行毒株感染的免疫保護(hù)情況,為H9亞型禽流感和禽腺病毒病(Ⅰ群4型)的防控以及疫苗的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 雞新城疫、禽流感(H9亞型)、禽腺病毒病(Ⅰ群,4型)三聯(lián)滅活疫苗(La Sota株+YT株+QD株,批號(hào):211107),由山東濱州沃華生物工程有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 試驗(yàn)用雞 21日齡SPF雞,北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品,雞的品種為白萊航。

1.1.3 攻毒用毒株 3株H9亞型禽流感病毒流行毒株:①A/chicken/Hebei/HD/2020(HD株),②A/chicken/Yunnan/CX/2021(CX株)③A/chicken/Liaoning/DL/2022(DL株)。HD株是2020年10月從河北邯鄲某雞場(chǎng)的病死雞中分離得到,為河北分離株,AIV(H9)HD株E4代病毒液,108.4EID50/0.1 mL;CX株是2021年12月從云南楚雄某雞場(chǎng)的病死雞中分離得到,為云南分離株,AIV(H9)CX株E4代病毒液,108.5EID50/0.1 mL;DL株是2022年5月從遼寧大連某雞場(chǎng)的病死雞中分離得到,為遼寧分離株,AIV(H9)DL株E4代病毒液,108.4EID50/0.1 mL。均由山東濱州沃華生物工程有限公司分離、鑒定并保存。

3株禽腺病毒(Ⅰ群4型)流行毒株:① FAdV/chicken/Sichuan/NJ/2020(Ⅰ群,4型)(NJ株) ②FAdV/chicken/Jiangsu/HA/2021 (Ⅰ群,4型)(HA株)③FAdV/chicken/ Hebei/CZ/2022 (Ⅰ群,4型)(CZ株)。NJ株是2020年6月從四川內(nèi)江某雞場(chǎng)的病死雞中分離得到,為四川分離株,NJ株F4代病毒液,107.8TCID50/0.1 mL;HA株是2021年2月從江蘇淮安某雞場(chǎng)的病死雞中分離得到,為江蘇分離株,HA株F4代病毒液,107.5TCID50/ 0.1 mL;CZ株是2022年1月從河北滄州某雞場(chǎng)的病死雞中分離得到,為河北分離株,CZ株F4代病毒液,107.6TCID50/0.1 mL。均由山東濱州沃華生物工程有限公司分離、鑒定并保存。

疫苗檢驗(yàn)用毒株:H9亞型禽流感病毒YT株、禽腺病毒(Ⅰ群4型)QD株,均由山東濱州沃華生物工程有限公司保管,其中AIV(H9)YT株,毒價(jià)為108.5EID50/0.1 mL;FAdV QD株,毒價(jià)為107.5TCID50/0.1 mL。

1.1.4 檢驗(yàn)用抗原 AI H9亞型HI抗原由山東濱州沃華生物工程有限公司實(shí)驗(yàn)室制備提供。

1.2 方法

1.2.1 免疫接種 取21日齡SPF雞160只,分為2組,第1組80只,經(jīng)肌肉注射雞新城疫、禽流感(H9亞型)、禽腺病毒病(Ⅰ群,4型)三聯(lián)滅活疫苗(La Sota株+YT株+QD株),0.3 mL/只;第2組80只,不接種疫苗,作為對(duì)照組,每組在同條件下分別隔離飼養(yǎng)。

1.2.2 禽流感H9亞型HI抗體效價(jià)測(cè)定 免疫后21 d,取免疫雞40只和對(duì)照雞40只,分別采血,分離血清,用禽流感(H9亞型)血凝抑制試驗(yàn)抗原按文獻(xiàn)[11]附錄方法進(jìn)行HI抗體效價(jià)測(cè)定。

1.2.3 禽流感病毒攻毒保護(hù)試驗(yàn) 將采血后的免疫雞40只和對(duì)照雞40只各隨機(jī)分為4組,每組10只,分別用AI(H9亞型)YT株、HD株、CX株和DL株進(jìn)行攻毒,各翅靜脈注射禽流感病毒液0.2 mL(含108.0EID50)。攻毒后第5天,分別采集每只雞的泄殖腔及氣管拭子,將同一只雞的泄殖腔及氣管拭子混合后作為1個(gè)樣品,每個(gè)樣品經(jīng)尿囊腔接種9～11日齡SPF雞胚5枚,每胚0.2 mL,孵育觀察5 d,逐胚測(cè)定雞胚液的HA效價(jià)。每個(gè)樣品接種的5枚雞胚中只要有1枚雞胚胚液的HA效價(jià)不低于1∶16(微量法),即可判為病毒分離陽性,對(duì)病毒分離陰性的樣品,應(yīng)盲傳1次后再進(jìn)行判定,以確定新流腺三聯(lián)苗對(duì)4株H9亞型禽流感毒株攻擊的保護(hù)。

1.2.4 禽腺病毒(Ⅰ群4型)攻毒保護(hù)試驗(yàn) 免疫后21 d,取另外免疫雞40只和對(duì)照雞40只各分為4組,每組10只,分別用FAdV QD株、NJ株、HA株和CZ株進(jìn)行攻毒,各肌肉注射禽腺病毒(Ⅰ群4型)病毒液0.2 mL(含2×107.0TCID50)。攻毒后觀察7 d,結(jié)束時(shí)進(jìn)行剖檢觀察病變,當(dāng)試驗(yàn)雞出現(xiàn)死亡或精神沉郁、食欲減退、蜷縮,剖檢可見心包積液或肝脾腫大任何一項(xiàng)即判定為發(fā)病,記錄對(duì)照組試驗(yàn)雞的發(fā)病及免疫組試驗(yàn)雞的保護(hù)情況,以確定新流腺三聯(lián)苗對(duì)4株禽腺病毒(Ⅰ群4型)毒株攻擊的保護(hù)。

2 結(jié)果

2.1 禽流感(H9亞型)HI抗體測(cè)定結(jié)果

新流腺三聯(lián)滅活疫苗免疫SPF雞21 d后,取免疫雞40只和對(duì)照雞40只,分別采血,進(jìn)行H9亞型AI HI抗體效價(jià)測(cè)定。結(jié)果顯示,疫苗免疫后21 d免疫組試驗(yàn)雞均產(chǎn)生良好的HI抗體水平,幾何平均值達(dá)到1∶676～1∶832,對(duì)照組試驗(yàn)雞HI抗體均<1∶2(表1)。

表1 新流腺三聯(lián)苗免后AI HI抗體測(cè)定結(jié)果

2.2 禽流感(H9亞型)攻毒試驗(yàn)結(jié)果

將上述采血后的免疫雞40只和對(duì)照雞40只各分為4組,每組10只,分別翅靜脈注射禽流感(H9亞型)病毒YT株、HD株、CX株和DL株病毒液0.2 mL(含108.0EID50)進(jìn)行攻毒,攻毒后第5天,采集泄殖腔及氣管拭子,尿囊腔接種9～11日齡SPF雞胚進(jìn)行病毒分離。結(jié)果顯示,疫苗免疫后用與制苗毒株同源的YT株攻毒后,對(duì)照組雞10/10發(fā)病,免疫組雞10/10保護(hù);用2020-2022年分離的3株AI 流行毒株攻毒后,對(duì)照組雞9/10～10/10發(fā)病,免疫組雞均9/10以上保護(hù)。結(jié)果表明,新流腺三聯(lián)滅活疫苗對(duì)H9亞型禽流感流行毒株HD株、CX株和DL株強(qiáng)毒攻毒具有良好的免疫保護(hù)作用(表2和表3)。

表3 新流腺三聯(lián)苗免后AIV攻毒試驗(yàn)結(jié)果

2.3 禽腺病毒(Ⅰ群4型)攻毒試驗(yàn)結(jié)果

免疫后21 d取另外免疫雞40只和對(duì)照雞40只各隨機(jī)分為4組,每組10只,分別肌肉注射FAdV QD株、NJ株、HA株和 CZ株病毒液0.2 mL(含2×107.0TCID50)進(jìn)行攻毒,攻毒后觀察7 d,對(duì)死亡及存活試驗(yàn)雞進(jìn)行剖檢觀察病變。發(fā)現(xiàn)攻毒后第2天對(duì)照組試驗(yàn)雞開始發(fā)病,死亡集中在第3～5天,7 d后剖檢觀察組織病變,發(fā)病雞均出現(xiàn)心包積液、肝臟及腎臟腫大等典型病變,免疫組試驗(yàn)雞均未見明顯異常(圖1)。疫苗免疫保護(hù)結(jié)果顯示,用與制苗毒株同源的QD株攻毒后,對(duì)照組雞10/10發(fā)病且8/10死亡,免疫組雞10/10保護(hù);用2020-2022年分離的3株FAdV流行毒株攻毒后,對(duì)照組雞9/10～10/10發(fā)病且6/10以上死亡,免疫組雞均10/10保護(hù)。結(jié)果表明,新流腺三聯(lián)滅活疫苗對(duì)禽腺病毒(Ⅰ群4型)流行毒株NJ株、HA株和CZ株強(qiáng)毒攻毒具有良好的免疫保護(hù)作用(表4)。

圖1 對(duì)照組和免疫組雞剖檢病變

表4 新流腺三聯(lián)苗免后FAdV攻毒試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

2015年以來,Ⅰ群禽腺病毒病在我國(guó)山東、河北、江蘇、安徽等多個(gè)省份廣泛流行,病死率高于30%,給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)帶來嚴(yán)重?fù)p失[12]。我國(guó)流行毒株主要血清型包括FAdV-4、FAdV-11、FAdV-8a和FAdV-8b等,不同血清型FAdV毒株均能感染雞且引起雞心包積液綜合征和包涵體肝炎,其中以FAdV-C-4流行范圍最廣、致病性最高,在家禽養(yǎng)殖中危害最大[13-14]。疫苗預(yù)防是疫病控制的重要措施和手段,目前研制的Ⅰ群禽腺病毒病相關(guān)生物制品有Ⅰ群4型禽腺病毒病滅活疫苗、Ⅰ群4型禽腺病毒病卵黃抗體、Ⅰ群4型禽腺病毒病亞單位疫苗、新城疫-禽流感(H9亞型)-禽腺病毒病(Ⅰ群,4型)三聯(lián)滅活疫苗等[10,15-17],研制出安全、穩(wěn)定、高效的商品化疫苗,才能實(shí)現(xiàn)對(duì)該病的有效防控。

采用雞新城疫、禽流感(H9亞型)、禽腺病毒病(Ⅰ群,4型)三聯(lián)滅活疫苗免疫3周齡SPF雞,免疫后21日,采血測(cè)定禽流感H9亞型HI抗體效價(jià),同時(shí)分別用H9亞型禽流感YT株及2020-2022年在國(guó)內(nèi)分離的HD株、CX株和DL株流行毒株進(jìn)行攻毒,結(jié)果顯示,免疫組禽流感H9亞型HI抗體效價(jià)幾何平均值為1∶676～1∶832,對(duì)照組試驗(yàn)雞HI抗體均<1∶2;用H9亞型禽流感病毒YT株、HD株、CX株和DL株攻毒,對(duì)照組雞9/10～10/10發(fā)病,免疫組雞均9/10以上保護(hù)。表明采用AI(H9亞型)YT株制備的三聯(lián)滅活疫苗對(duì)近幾年流行的H9亞型禽流感分離毒株具有良好的交叉保護(hù)作用。

采用雞新城疫、禽流感(H9亞型)、禽腺病毒病(Ⅰ群,4型)三聯(lián)滅活疫苗免疫3周齡SPF雞,免疫后21日分別用禽腺病毒(Ⅰ群,4型)QD株及2020-2022年在國(guó)內(nèi)分離的NJ株、HA株和CZ株進(jìn)行攻毒,結(jié)果顯示,對(duì)照組雞9/10～10/10發(fā)病且至少6/10死亡,免疫組雞均10/10保護(hù)。表明采用FAdV QD株制備的三聯(lián)滅活疫苗對(duì)近幾年流行的禽腺病毒(Ⅰ群,4型)分離毒株具有良好的交叉保護(hù)效果。

綜上表明,雞新城疫、禽流感(H9亞型)、禽腺病毒病(Ⅰ群,4型)三聯(lián)滅活疫苗(La Sota株+YT株+QD株)對(duì)目前禽流感(H9亞型)、禽腺病毒(Ⅰ群,4型)國(guó)內(nèi)流行毒株具有良好的保護(hù)力,能夠有效防控流行毒株的感染。