羥氯扎胺鹽酸左旋咪唑復方混懸液對靶動物牛的安全性試驗

高馨兒,陳玲玲,姚學強,周凱仁,王 娟,周緒正,朱曉鵬,張繼瑜*

(1.甘肅農業大學動物醫學院,甘肅蘭州 730070;2.中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所,甘肅蘭州 730050;3.萬禾草畜產業科技開發有限責任公司,甘肅張掖 734312)

20世紀80年代開始,羥氯扎胺和左旋咪唑被聯合用于蠕蟲病的預防及治療。近年來,羥氯扎胺鹽酸左旋咪唑復方混懸液及羥氯扎胺左旋咪唑復方片劑已經在許多國家批準上市,且已廣泛用于臨床驅蟲治療并取得良好的療效[1]。羥氯扎胺鹽酸左旋咪唑復方混懸液對牛胃腸蠕蟲的療效試驗中,藥物組第7天顯示出100%有效率,且持續到試驗結束(第21天),表明羥氯扎胺左旋咪唑復方藥物對于完全和快速去除蠕蟲卵具有很高的功效,該藥物耐受性良好,在治療動物中未發現有毒性,有廣泛的抗寄生蟲活性[2]。本試驗參照《獸藥臨床試驗質量管理規范》、《獸藥研究技術指導原則匯編》(2006-2011年)及《VICH藥物靶動物安全性試驗指導原則》的要求設計[3]。通過評估推薦給藥量(0.25 mL/kg)的0、1、3、5 倍治療劑量的羥氯扎胺鹽酸左旋咪唑復方混懸液在靶動物牛體內的安全性和耐受性,以期為羥氯扎胺鹽酸左旋咪唑復方混懸液對牛的臨床安全用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 試驗選用32頭10～12月齡健康西門塔爾肉牛,由甘肅省張掖市萬禾草畜產業科技開發有限公司提供,體重226～348 kg,雌雄各半。飼養于圍欄內,在試驗前3個月內未接受任何藥物治療。試驗牛可以自由取水,并以不含抗生素的全混合飼料喂養。將32頭牛隨機分為0、1、3、5倍推薦劑量組,每組8頭(雌、雄各4頭)。

1.1.2 試驗藥物 羥氯扎胺鹽酸左旋咪唑復方混懸液(批號:20210701),淺黃色不透明液體,由中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所研制。

1.1.3 主要儀器 MultifugeX3R低溫高速離心機,賽默飛世爾科技中國有限公司產品;ErbaXL-640全自動生化分析儀,德國 ErbaMannbcim 有限公司產品;ProCyte DX全自動五分類血細胞分析儀,愛德士緬因生物制品貿易(上海)有限公司產品;Leica RM2265全自動旋轉式組織切片機、Leica HI1210石蠟切片水浴槽和Leica HI1220臨床組織病理學烤片臺,徠卡顯微系統(上海)貿易有限公司產品;BX43+SC50正置顯微鏡帶成像系統,奧林巴斯(中國)有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥 將32頭西門塔爾牛隨機分為4組,每組8頭,雌雄各半。即對照組0劑量組(0 mL/kg),推薦給藥劑量1倍劑量組(0.25 mL/kg),3倍劑量組(0.75 mL/kg),5倍劑量組(1.25 mL/kg)。每頭牛有耳標記號,試驗牛被隨機分成4組,每頭牛都有適當的活動范圍,每組之間有一定的距離。試驗前逐頭稱重,以體重按劑量口服羥氯扎胺鹽酸左旋咪唑復方混懸液,連續給藥3 d。

1.2.2 血生化檢測 在試驗開始前(第0天)、給藥結束后(第4天)及試驗結束后(第18天)分別從試驗牛頸靜脈采集5 mL血液進行血液生化檢測[4]。檢查的指標包括谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、總蛋白(TP)白蛋白(ALB)、堿性磷酸酶(ALP)、肌酐(CR)、甘油三酯(TG)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、葡萄糖(GLU)。

1.2.3 血液學檢查 在試驗開始前(第0天)、給藥結束后(第4天)及試驗結束后(第18天)分別從試驗牛頸靜脈采集5 mL血液于EDTA抗凝采血管。檢查的指標包括白細胞計數(WBC)、淋巴細胞(LYM)、單核粒細胞(MON)、中性粒細胞(NEU)、嗜酸性粒細胞(EOS)、嗜堿性粒細胞(BAS)、紅細胞計數(RBC)、血紅蛋白含量(HGB)、紅細胞比容(HCT)、紅細胞平均體積(MCV)、平均紅細胞血紅蛋白含量(MCH)、平均紅細胞血紅蛋白濃度(MCHC)、血小板計數(PLT)、平均血小板體積(MPV)、血小板壓積(PCT)。

1.2.4 臨床觀察 試驗過程中每天記錄試驗牛的體溫、呼吸、排泄、飲食及精神狀態,觀察有無試驗牛死亡或其他異常行為,記錄異常表現和毒性反應的持續時間。試驗開始前記錄全部試驗牛體重為初始體重,試驗結束后記錄存活(未剖解)牛體重為最終體重。

1.2.5 病理組織學觀察 試驗第4天,從0劑量組和5倍劑量組內隨機選擇4頭牛進行安樂死。試驗結束后,安樂死0劑量組及5倍劑量組剩余牛。剖檢收集心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟樣本,眼觀有無明顯病理變化,將樣本儲存在10%中性緩沖福爾馬林溶液中用于病理組織學觀察。

1.2.6 數據處理 將各組試驗數據用SPSS 24.0軟件進行統計學處理,采用單因素方差分析比較各組間數據差異,所有假設檢驗均在0.05顯著水平進行。結果數據以平均值±標準差(Mean±SD)表示。

2 結果

2.1 臨床觀察

試驗期間未出現牛死亡,1倍、3倍及5倍劑量組多數牛在每次給藥后12 h出現腹瀉反應,24 h后又恢復到正常;5倍劑量組個別牛出現表情呆滯、食欲減退,但均為暫時性,有明顯的時間依賴性,大部分試驗牛在給藥后12～24 h出現不良反應,停藥后隨著時間的推移,副作用逐漸減弱或消失;其他劑量組未出現采食、飲水及精神狀態明顯異常的臨床變化。

2.2 對牛體溫及體重的影響

各試驗組牛體溫基本保持平穩,均在正常范圍內。試驗前及試驗結束后對牛進行稱重,0劑量組及1倍劑量組試驗牛平均體重有所增加, 3倍劑量組及5倍劑量組試驗牛體重下降,可能是藥物引起的腹瀉及應激引起。

2.3 血液學分析

各試驗組牛血液學分析見表1和表2。與0劑量組相比,第0天3倍劑量組的紅細胞計數(RBC)、紅細胞比容(HCT)及平均紅細胞血紅蛋白含量(MCH),5倍劑量組的紅細胞計數(RBC)、紅細胞平均體積(MCV)、平均紅細胞血紅蛋白含量(MCH)、血小板計數(PLT)及血小板壓積(PCT)差異顯著(P<0.05);第4天3倍劑量組及5倍劑量組的嗜堿性粒細胞(BAS)、血紅蛋白含量(HGB)、紅細胞比容(HCT)、平均紅細胞血紅蛋白含量(MCH)及5倍劑量組的紅細胞計數(RBC)、紅細胞平均體積(MCV)差異顯著(P<0.05);第18天 3倍劑量組的紅細胞計數(RBC)、紅細胞平均體積(MCV)及平均紅細胞血紅蛋白濃度(MCHC),5倍劑量組的血小板計數(PLT)及血小板壓積(PCT)差異顯著(P<0.05)。試驗第4天5倍劑量組紅細胞計數(RBC)顯著高于對照組且高于正常范圍,分析是由于給藥導致試驗牛腹瀉引起的,第18天已恢復至正常范圍,其余各項差異顯著參數指標均在正常范圍內。其他血液學參數指標均無顯著差異(P>0.05)。

表1 試驗前及試驗后各組試驗牛血液學檢查結果

表2 試驗前及試驗后各組試驗牛血液學檢查結果

2.4 血清生化分析

各組試驗牛血液學分析結果見表3和表4。與0倍劑量組相比,第0天各試驗組血液生化參數指標均無顯著差異(P>0.05);第4天3倍劑量組及5倍劑量組的直接膽紅素(DBIL)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、甘油三酯(TG)及5倍劑量組的谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、肌酐(CR)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)均差異顯著(P<0.05),5倍劑量組的谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)均超出參考范圍,表明羥氯扎胺鹽酸左旋咪唑復方混懸液在5倍臨床推薦劑量下對動物的肝腎功能具有一定不良影響,雖然肌酸激酶(CK)同樣超出參考范圍,但結合其他數據,不能斷定肌酸激酶的變化是由肝功能損傷或心肌損傷引起的,其他參數指標雖然與對照組差異顯著,但仍在正常范圍內;試驗結束后,1倍劑量組及3倍劑量組白蛋白(ALB)、5倍劑量組白蛋白(ALB)、肌酐(CR)及肌酸激酶(CK)差異顯著(P<0.05)但試驗后各組的白蛋白(ALB)及肌酐(CR)均在正常范圍內,結合試驗前及試驗后的數據分析,肌酸激酶(CK)的異常升高應是動物應激所導致的。其他血液生化參數指標均無顯著差異(P>0.05)。

表3 試驗前及試驗后各組試驗牛血液生化分析結果

表4 試驗前及試驗后各組試驗牛血液生化分析結果

2.5 病理組織學觀察

試驗第4天,于0倍劑量組和5倍劑量組內隨機選擇四頭牛進行安樂死(雌雄各半)。試驗結束后(第18天),安樂死0倍劑量組及5倍劑量組剩余牛,對安樂死動物進行一般解剖分析,大劑量組與對照組動物均未見明顯肉眼可見病變。顯微鏡觀察見圖1和圖2,第4天鏡檢可見0倍劑量組試驗牛心肌纖維輕微充血及出血,肝臟可見部分肝細胞輕微水泡變性;5倍劑量組試驗牛心肌纖維輕微充血及出血,肺泡隔可見充血、部位肺泡隔纖維結締組織增生,部位腎小管可見輕微腫脹,這些輕微病變可能是由于連續給藥及驅逐過程中牛的應激反應導致,其他組織鏡檢均并未發現明顯病理變化。第18天鏡檢兩組均未發現明顯病理變化。

圖1 第4天0劑量組及5倍劑量組試驗牛組織病理學檢查結果(HE×200)

圖2 第18天0倍劑量組及5倍劑量組試驗牛組織病理學檢查結果(HE×200)

3 討論

近年來,由于養殖戶不合理用藥,導致蠕蟲耐藥性不斷增強,多種藥物的治療效果逐漸變差,寄生蟲呈混合感染的現象普遍發生,防控難度越來越大[5]。羥氯扎胺屬于水楊酰苯胺類抗寄生蟲藥,主要用于治療牛、羊肝片吸蟲感染引起的疾病,對絳蟲病和線蟲病也有良好的治療效果[6]。左旋咪唑是咪唑并噻唑類抗線蟲藥[7],具有免疫刺激特性,可增加延遲型免疫反應,并恢復受損的細胞[8]。羥氯扎胺鹽酸左旋咪唑復方混懸液作為羥氯扎胺及鹽酸左旋咪唑兩種藥物的聯合用藥,具有療效高、抗蟲譜廣、給藥便利等優點,是理想的抗蠕蟲藥優選,具有良好的應用前景。作為在國外已普遍使用的驅蟲藥之一,目前尚未有該藥物產生耐藥性的相關報道,選用羥氯扎胺及鹽酸左旋咪唑聯合用藥合理擴大了抗蟲譜,對不同蠕蟲均有良好的驅蟲效果,為蠕蟲病防治提供保障,研究表明羥氯扎胺鹽酸左旋咪唑復方混懸液目前并未產生耐藥性[9]。但此前國內并未有經批準的該藥物上市,為了促進該藥在國內的臨床應用研究,靶動物安全性試驗是不可缺少的藥物臨床前關鍵試驗。

本文連續3 d以臨床推薦劑量(0.25 mL/kg)的0、1、3、5倍劑量給牛口服羥氯扎胺鹽酸左旋咪唑復方混懸液,給藥后觀察14 d,評估藥物的安全性。在試驗開始前(第0天)、給藥結束后(第4天)及試驗結束后(第18天)抽取試驗牛血液進行血液學檢查及血清生化檢查。試驗第4天,于0倍劑量組和5倍劑量組內隨機選擇四頭牛進行安樂死(雌雄各半),試驗結束后安樂死0倍劑量組及5倍劑量組剩余牛,進行病理組織學觀察。綜合體重,臨床毒性觀察,血液學檢查,血清生化檢查和組織病理學檢查結果,為藥物的臨床安全應用提供合理依據。

試驗期間所有試驗牛體溫平穩,未出現異常升高或降低現象,試驗結束時,沒有牛死亡,除空白劑量組外,其他劑量組給藥后12 h多數牛均出現腹瀉反應,5倍劑量組個別牛有呆滯、食欲減退表現,但這些不良反應均為暫時性的,停藥后隨著時間的推移,副作用逐漸減弱或消失,其他劑量組未出現明顯臨床變化。對試驗前、給藥后、試驗結束后的牛分別進行血液學檢查及血液生化分析發現,與對照組相比,試驗組部分血液學參數及血液生化參數具有顯著差異(P<0.05)但大部分參數指標均在正常范圍內,可以忽略不計[10]。在血液生化指標中,谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)是評價肝功能敏感的指標,常見于各種肝炎[11-12],第4天5倍劑量組谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)均超出參考范圍,表明羥氯扎胺鹽酸左旋咪唑復方混懸液在5倍臨床推薦劑量下對動物的肝腎功能具有一定不良影響[13],肌酸激酶(CK)通常是骨骼肌和心肌損傷最敏感的指標,也是動物應激時最敏感的指標[14],由于肌酸激酶(CK)的異常升高現象自試驗開始一直存在,分析其應該是由于驅趕及給藥使試驗動物持續應激所導致的。病理組織學觀察結果沒有表現出任何細胞或組織損傷的明顯趨勢,第4天時試驗牛臟器可見不同程度的輕微病變,但第18天時對牛進行病理組織學觀察時未發現明顯病變,推測第4天時出現的輕微病變是由于給藥及驅逐過程中使試驗牛產生的持續應激反應所致。

綜上所述,使用羥氯扎胺鹽酸左旋咪唑復方混懸液按5倍臨床推薦劑量(1.25 mL/kg)連續3 d口服給藥對靶動物牛仍然具有良好的安全性,因此,按臨床推薦劑量(0.25 mL/kg)給牛口服羥氯扎胺鹽酸左旋咪唑復方混懸液是安全的,且該藥物使用安全范圍大,適合進行進一步研發。