伊氏錐蟲感染的昆明小鼠血常規(guī)變化和病理組織學(xué)觀察

甘 露,諾明達(dá)來,鄭會(huì)珍,金 敏,李永暢,巴音查汗

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052)

伊氏錐蟲(Trypanosomaevansi)可在多種哺乳動(dòng)物血液細(xì)胞外增殖[1]。近幾年我國(guó)新疆馬的伊氏錐蟲感染率為3.96%,駝感染率為4.62%[2]。伊氏錐蟲宿主廣泛,除馬、駱駝、水牛、牛、豬和犬以外,嚙齒動(dòng)物也易患伊氏錐蟲病[3],大多數(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(大鼠、小鼠和兔子)易感染[4]。動(dòng)物感染伊氏錐蟲后出現(xiàn)貧血 、免疫抑制、消瘦、神經(jīng)癥狀、運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)、癱瘓等癥狀。伊氏錐蟲以縱分裂的方式在宿主血液中大量繁殖,分泌或產(chǎn)生大量毒素,這些毒素引起宿主不同的病理反應(yīng)[5]。伊氏錐蟲可穿透組織進(jìn)入關(guān)節(jié)液或穿透大腦中的腦脊液[6]。可在動(dòng)物組織、血漿和空腔液中觀察到寄生蟲[7]。在組織器官中多見于心、肝、脾、肺和腎等。本文以前期已建立的昆明小鼠伊氏錐蟲體內(nèi)試驗(yàn)?zāi)Ｐ?通過人工感染馬陽(yáng)性血液,觀察小鼠體內(nèi)血液指標(biāo)變化及感染伊氏錐蟲后臟器組織的病理變化,為探索伊氏錐蟲病的診斷治療及免疫機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及樣品 昆明小鼠(KM)6只,均為雌鼠,體重相近,6～8周齡,購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,試驗(yàn)組和對(duì)照組各3只;伊氏錐蟲陽(yáng)性血液,由本實(shí)驗(yàn)室前期采集巴州馬血液保存于液氮中。

1.1.2 試劑 石蠟(熔點(diǎn)56～58℃),上海懿洋儀器有限公司產(chǎn)品;乙醇,天津永晟精細(xì)化工有限公司產(chǎn)品;二甲苯,天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司產(chǎn)品;其他試劑為蘇木素、伊紅(醇溶性)和鹽酸。

1.1.3 儀器設(shè)備 石蠟切片機(jī)和顯微鏡,Leica公司產(chǎn)品;生物組織包埋機(jī),天津市天利航空機(jī)電有限公司產(chǎn)品;HH-S數(shù)顯控溫水浴鍋;江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 人工感染試驗(yàn)小鼠 試驗(yàn)小鼠腹腔注射陽(yáng)性馬血(PC)0.1 mL,對(duì)照組小鼠注射0.9%生理鹽水0.1 mL,試驗(yàn)組和對(duì)照組飼養(yǎng)條件相同。

1.2.2 試驗(yàn)小鼠血常規(guī)檢測(cè) 采集各組小鼠全血,經(jīng)全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測(cè)定白細(xì)胞(WBC)、淋巴細(xì)胞(LY)、紅細(xì)胞(RBC)、血小板平均容積(MPV)、紅細(xì)胞平均體積(MCV)等17項(xiàng)血常規(guī)指標(biāo)。

1.2.3 小鼠血液涂片制作 試驗(yàn)組接種伊氏錐蟲后,6只小鼠每間隔24 h進(jìn)行尾靜脈無菌采血,滴至載玻片涂制成血液涂片,待自然干燥后滴適量甲醇固定;待完全晾干后進(jìn)行吉姆薩染色[8],染色結(jié)束后用蒸餾水將血涂片沖洗干凈,自然晾干后滴石蠟油在油鏡(10×100)下鏡檢感染率。

1.2.4 收集試驗(yàn)小鼠臟器 待小鼠感染伊氏錐蟲數(shù)達(dá)到一定高峰并出現(xiàn)死亡時(shí),用心臟采血法對(duì)每只小鼠采0.7～0.8 mL全血,4℃保存。將小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟放置雙蒸水中清洗30 s,放置固定液中固定48 h,用于組織病理切片的制作。

1.2.5 伊氏錐蟲PCR檢測(cè) 抗凝管無菌采集感染小鼠血液,通過全血基因組試劑盒提取DNA;按照GenBank中發(fā)表的伊氏錐蟲PFR基因序列(登錄號(hào):GQ392136),用Primer 5軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物,引物序列和反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)[9],PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.2.6 病理切片制作 分別取心臟、肝臟、脾臟、腎臟各1塊,將所取組織塊放入包埋盒中,自來水沖洗24 h;然后依次放入70%、80%、90%、95%、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ的乙醇中脫水;再放入二甲苯與乙醇等體積混合液、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ使之透明;將透明的組織塊放入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ、石蠟Ⅲ中,使其充分浸蠟后包埋,切片及展片,然后放入恒溫箱中過夜;其中脫水透明和浸蠟的時(shí)間可根據(jù)組織塊的大小和質(zhì)地適當(dāng)調(diào)整[10]。

HE染色:二甲苯Ⅰ5 min→二甲苯Ⅱ 5 min→無水乙醇Ⅰ 2 min→無水乙醇Ⅱ 2 min→95%乙醇 2 min→85%乙醇 2 min→70%乙醇 2 min→50%乙醇 2 min→純化水洗片3 min→蘇木精染液5～10 min→純化水洗片刻3 min→1%鹽酸乙醇分化5～30 s→自來水洗堿化(返藍(lán)) 10～20 min→純化水洗片3 min→50%乙醇 1 min→70%乙醇 1 min→85%乙醇 1 min→95%乙醇 2 min→0.5%伊紅 2 min→純化水洗片3 min→95%乙醇Ⅰ2 min→95%乙醇Ⅱ2 min→無水乙醇Ⅰ2 min→無水乙醇Ⅱ2 min→二甲苯Ⅰ5 min→二甲苯Ⅱ 5～10 min→樹膠封片[11]。

2 結(jié)果

2.1 血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果

隨著感染天數(shù)的增加,試驗(yàn)小鼠WBC、NEU、HCT、MCH、PLT值逐漸降低,LYM%、MCV、RDWR-SD、MPV值在死亡時(shí)明顯升高。健康小鼠血常規(guī)未見明顯異常(表1)。

表1 小鼠血常規(guī)變化

2.2 試驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠器官大小對(duì)比

對(duì)比試驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠各器官大小(長(zhǎng)×寬),發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組小鼠脾臟、肝臟,心臟均明顯變大,肺臟及腎臟變化較小(表2)。

表2 小鼠各器官大小比較

2.3 血涂片和PCR檢測(cè)結(jié)果

感染小鼠血涂片顯示,血液中含大量伊氏錐蟲(圖1A),對(duì)照組小鼠紅細(xì)胞正常(圖1B)。PCR檢測(cè)到799 bp的目的條帶,與預(yù)期大小相符(圖2),根據(jù)血涂片和PCR結(jié)果,發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)小鼠體內(nèi)存在伊氏錐蟲。

A.試驗(yàn)組;B.對(duì)照組

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～3.感染小鼠;4～6.對(duì)照組;7.陰性

2.4 小鼠主要器官病理變化

試驗(yàn)小鼠脾臟淤血,髓質(zhì)間有大量紅細(xì)胞,有較多形態(tài)改變的淋巴濾泡;肝臟中央靜脈、小葉間靜脈淤血,肝細(xì)胞腫脹,肝竇間隙變窄;肺泡腫脹,肺泡壁增寬,支氣管出現(xiàn)纖維化,間質(zhì)可見炎癥細(xì)胞;心臟中心肌纖維腫脹,出現(xiàn)顆粒變性,染色后顏色加深,并伴有較多的伊氏錐蟲體;腎小囊間隙變窄,腎小管上皮細(xì)胞腫脹,管腔變窄;對(duì)照組小鼠均未出現(xiàn)明顯病理變化(圖3)。

A.脾臟(40×);C.肝臟(40×);E.肺臟(40×);G.心臟(40×);I.心臟(40×);K.腎臟(40×);B.脾臟(100×);D.肝臟(100×);F.肺臟(100×);H.心臟(100×);J.心臟(100×);L.腎臟(100×)

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn),白細(xì)胞數(shù)隨著感染伊氏錐蟲的天數(shù)呈逐漸下降的趨勢(shì),伊氏錐蟲是一種血鞭毛寄生蟲,可以生活在液體中,白細(xì)胞的減少會(huì)造成血液系統(tǒng)疾病,這與血常規(guī)中血小板數(shù)值相符合,血小板的降低說明造血功能出現(xiàn)障礙。嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)是白細(xì)胞的一部分,占白細(xì)胞總數(shù)的0.5%～5%,在寄生蟲侵入時(shí)極為敏感。過敏反應(yīng)、寄生蟲感染和其他免疫反應(yīng)中嗜酸性粒細(xì)胞極為活躍[12],嗜酸性粒細(xì)胞顯著上升。本試驗(yàn)中,中性粒細(xì)胞(NEU)和淋巴細(xì)胞(LYM)逐漸下降,說明自身的免疫系統(tǒng)遭到破壞,中心粒細(xì)胞是一類白細(xì)胞,兩者細(xì)胞計(jì)數(shù)下降和脾臟的腫大相關(guān)聯(lián)。通過血常規(guī)發(fā)現(xiàn),試驗(yàn)小鼠血小板體積增多,而血小板(凝血細(xì)胞)是血液中凝血思想因素,可能由于采血時(shí)血液未能及時(shí)和肝素混合而導(dǎo)致的。而紅細(xì)胞壓積(HCT),紅細(xì)胞(RBC)顯著下降,可能是受到伊氏錐蟲大量增殖的影響,感染小鼠營(yíng)養(yǎng)不良出現(xiàn)貧血現(xiàn)象。

伊氏錐蟲對(duì)小鼠具有較高的致病性,感染伊氏錐蟲的小鼠紅細(xì)胞壓積下降,白細(xì)胞增多;感染小鼠不同內(nèi)臟器官病理組織切片中觀察到錐蟲,特別是在肝臟、脾臟和心臟血管內(nèi),而未感染小鼠體內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明顯變化,本研究可為伊氏錐蟲病的診斷與預(yù)防提供理論依據(jù)。