豬細小病毒TaqMan熒光定量PCR檢測方法的建立及應用

楊 奕,吳發興,康京麗,孫洪濤,王志亮,許信剛,張 琪*

(1.西北農林科技大學動物醫學院,陜西楊凌 712100;2.中國動物衛生與流行病學中心,山東青島 266032)

豬細小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是一種單股線狀負鏈DNA病毒。PPV感染可引起母豬不孕、流產、產畸形胎、木乃伊胎甚至死胎等,阻礙了養豬業的發展[1]。在所有的養豬國幾乎都發現有PPV,國內各地豬群感染程度各有不同[2]。PPV可感染不同日齡豬,僅成年豬表現繁殖障礙癥狀,其他日齡豬均為隱性感染,PPV易與其他豬繁殖障礙病混淆,影響了臨床診斷[3]。快速準確檢測PPV是防控的首要條件[2]。豬細小病毒的檢測有許多報道,但如何選擇更為合適的靶基因尚無報道[4]。本研究針對豬細小病毒VP2基因的高度保守區域,設計1對特異性引物以及1條特異性探針,并優化反應時間和反應溫度,對敏感性、重復性與特異性進行評價。結果表明這種方法更為快速準確,對臨床PPV檢測及預防有良好的實用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 參考病毒株與臨床樣品 PPV1、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、豬圓環病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2) 、偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)由中國動物衛生與流行病學中心提供。臨床待檢樣品來自于不同省份的發病豬場。

1.1.2 主要試劑 病毒DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、pGM-T載體試劑盒、質?？焖傩√嵩噭┖?均為天根生化科技有限公司產品;PremixTaq(Ex Taq Version 2.0 plus dye)、ddH2O,均為寶日醫生物技術(北京)有限公司產品;2×AccurateTaqMaster Mix、DNA Marker,均為艾科瑞生物工程有限公司產品;感受態細胞DH5α、Premix ExTaq(Probe qPCR),均為北京擎科生物科技有限公司產品。

1.1.3 主要儀器 實時熒光定量PCR儀、96孔熱循環PCR儀,西安天隆生物儀器有限公司產品;凝膠成像分析儀,天根生化科技有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 引物及探針設計與合成 按照GenBank庫中PPV的標準參考毒株序列(OG155649.1),針對VP2基因的保守區域設計1對特異性引物以及1條特異性TaqMan探針。引物和探針均由北京擎科生物科技合成,用ddH2O稀釋引物濃度至20 μmol/L,并置于-20℃冰箱保存備用(表1)。

表1 引物及探針序列

1.2.2 重組質粒構建 按照核酸提取試劑盒的步驟提取PPV血清DNA并作為模板,用合成的特異性引物進行PCR擴增,將PCR產物進行凝膠電泳鑒定,用膠回收試劑盒對產物進行回收,將回收產物連接載體pMD18-T,構建重組質粒。對重組質粒進行測序鑒定,鑒定為陽性的質粒作為質粒標準品,測定質粒濃度,計算質?？截悢?拷貝數=質粒濃度(ng/μL)×10-9×6.02×1023/(660×質粒總長度)[5]。

1.2.3TaqMan熒光定量PCR反應體系及條件優化 對引物濃度進行優化,從0.1 μmol/L開始,按照0.1 μmol/L逐次增加直至0.8 μmol/L。對探針濃度進行優化,從0.1 μmol/L開始,按照0.1 μmol/L逐次增加直至0.4 μmol/L。對退火溫度進行優化,從54℃開始,按照2℃逐次增加直至64℃。在該反應條件下陽性標準品10倍系列稀釋(101～109)的質粒作為模板。

1.2.4 標準曲線建立 對以上反應條件進行優化后,即可獲得TaqMan熒光定量PCR檢測方法的最佳反應條件。將重組質粒標準品按照10倍倍比稀釋,從107copies/μL稀釋至100copies/μL,依次作為模板,建立PPV的TaqMan熒光定量PCR檢測方法的標準曲線。

1.2.5 特異性試驗 用優化后的反應條件和反應體系分別對PPV、PEDV、PCV2、PRRSV、PRV的核酸樣品進行擴增,評估該方法的特異性。

1.2.6 敏感性試驗 將8.76×107～8.76×100copies/μL的標準質粒作為模板,用本研究建立的TaqMan熒光定量PCR方法進行擴增,得到該方法能檢出的最低標準品濃度。

1.2.7 重復性試驗 分別取107、106、105copies/μL稀釋度的質粒標準品作為模板,進行3次批內和批間重復性試驗。對所得Ct值的變異系數和平均值進行計算,分析該方法的重復性。

1.2.8 臨床樣品檢測 將臨床采集的102份PPV血清樣品處理后提取核酸,用本研究所建立的TaqMan熒光定量PCR方法以及普通PCR方法同時進行檢測,以評估該方法臨床應用效果。

2 結果

2.1 重組質粒構建

將鑒定為陽性的質粒送至北京擎科生物科技有限公司進行測序,通過Blast比對,測序結果顯示插入片段與目的片段同源性為100%,表明重組質粒構建成功。計算重組質?？截悢禐?.76×1010copies/μL。

2.2 TaqMan熒光定量PCR反應體系及條件優化結果

優化后的TaqMan熒光定量PCR反應體系為20 μL,包括Premix ExTaq(Probe qPCR)10 μL、探針0.3 μL(20 μmol/L)、上游和下游引物各0.3 μL(20 μmol/L)、模板1 μL,ddH2O補足到20 μL。反應條件為:95℃ 30 s;95℃ 5 s、58℃ 30 s,40個循環。

2.3 標準曲線建立

將PPV重組質粒用ddH2O 10倍倍比稀釋,分別以8.76×107～8.76×100copies/μL為模板進行擴增。結果顯示,PPV重組質粒標準品在8.76×107～8.76×100copies/μL時與Ct值呈良好的線性關系,回歸方程式為y=-2.327x+40.950,相關系數為0.971。

圖2 PPV TaqMan熒光定量PCR檢測方法標準曲線

2.4 特異性試驗結果

用本研究建立的TaqMan熒光定量PCR檢測方法對PPV、CSFV、JEV、PRV、PCV2,PRRSV樣品進行檢測,同時設置陰性對照(ddH2O)(圖3),只有PPV出現特異性擴增曲線。

1.PPV擴增曲線;2～5.PEDV、PCV2、PRV、PRRSV擴增曲線;N.陰性對照

2.5 敏感性試驗結果

取8.76×107～8.76×100copies/μL的標準質粒作為模板,ddH2O作為陰性照,依照研究所建立的TaqMan熒光定量PCR方法來進行擴增。結果顯示,PPV重組質粒標準品最低檢測限為8.76×101copies/μL(圖4)。而常規PCR對PPV重組質粒標準品最低檢測限為8.76×102copies/μL(圖5)。表明該方法敏感性較常規PCR高,敏感性良好。

1～8.8.76×107～8.76×100 copies/μL標準模板TaqMan 熒光定量PCR擴增曲線;N.陰性對照

M.DNA標準DL 2 000;1～8.8.76×107～8.76×100 copies/μL標準模板常規PCR擴增

2.6 重復性試驗結果

取8.76×106、8.76×105、8.76×104copies/μL濃度的質粒標準品作模板,依照本研究建立的TaqMan熒光定量PCR檢測方法進行組內及組間重復性試驗,重復3次(表2),組內重復試驗變異系數均小于1%,組間重復試驗變異系數小于2%。

表2 組內與組間重復性試驗結果

2.7 臨床樣品檢測結果

用本研究建立的TaqMan熒光定量PCR檢測方法和普通PCR方法同時檢測102份疑似豬細小病毒豬血清樣品,結果顯示TaqMan熒光定量 PCR檢測方法共檢出16份陽性樣品,陽性檢出率為15.69%(16/102),而普通PCR陽性檢出11份陽性樣品且包含在TaqMan熒光定量 PCR檢測方法所檢出來的16份陽性樣品中,陽性檢出率為10.79%(11/102)。將TaqMan熒光定量 PCR檢測方法的陽性樣品擴增進行菌液PCR鑒定并測序,結果顯示所檢出的陽性樣本含有PPV。因此該熒光定量PCR方法可用于PPV的檢測,并且靈敏度高于普通 PCR檢測方法。

3 討論

PPV感染豬數周后才表現出典型臨床癥狀,且常與其他病毒性疾病混合感染,帶毒豬排毒后在豬群中普遍存在有PPV抗體,所以僅憑PPV抗體呈陽性或有疑似豬細小病毒病臨床癥狀,無法判斷是否感染PPV。只有精確檢測病毒抗原或抗體或核酸才能確定是否存在PPV感染[6]。TaqMan探針是熒光定量PCR探針的一種,與目標片段產生熒光信號,相較于其他熒光定量PCR可通過探針增強檢測特異性[7]。

彭澤琴等[8]對臨滄地區部分豬場和散養戶的190份血清樣品進行PPV抗體檢測,抗體平均陽性率為66.32%;陳文賢等[9]用乳膠凝集試驗對甘肅11個種豬場的150份血清樣本進行PPV檢測,陽性率為16%;孫泉云等[10]對上海某養豬場2015-2017年的129份種豬扁桃體樣本進行檢測,檢出陽性樣本110份,陽性率為8.74%;唐小明等[11]對湖南5個原種豬場的血清以及對應扁桃體樣品各1 000份進行抗體檢測,樣本陽性率為28.9%。張振倉等[12]從陜西省11個規模化養豬場采集仔豬血樣320份,應用PCR方法對樣本中的PPV進行檢測,樣本陽性率為3.64%,且為混合感染。PPV在不同地區或用不同檢測方法的檢出率存在差異,樣本批次不同或檢測方法的敏感性不同都可能導致這種差異,且抗體檢出率明顯高于抗原檢出率,可能由于受到野毒感染或接種PPV疫苗致使豬群體內抗體水平上升。

本研究基于PPVVP2基因建立了PPVTaqMan熒光定量PCR檢測方法,該方法特異性強,用于檢測實驗室豬常見病原如PEDV、PRRSV、PRV、PCV2等結果均呈陰性;重復性高,批間與批內變異系數均小于2%;靈敏度高,對陽性標準質粒檢測下限為87.6 copies/μL,完全可以用于臨床樣本檢測。