二氫乳清酸脫氫酶抑制劑ASLAN003抗戊型肝炎病毒的研究

劉 丹,張繼凱,丁曉慧,郭虹波,王文世

(徐州醫科大學病原生物學與免疫學教研室,江蘇省免疫與代謝重點實驗室,江蘇徐州 221004)

戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)通過糞-口途徑在人和動物之間傳播的RNA病毒,HEV是一種人獸共患病原體[1]。HEV為單股正鏈RNA類囊膜病毒,呈20面體對稱結構,其基因組由1個5′甲基化帽,1個3′polyA多聚尾,至少3個部分重疊的開放閱讀框(ORFs)ORF1、ORF2和ORF3組成[2]。ORF1主要編碼病毒復制相關的非結構蛋白,ORF2負責編碼病毒衣殼蛋白包裹著病毒RNA,ORF3編碼一種促進病毒從宿主釋放的磷蛋白,已有研究認為HEV編碼蛋白與HEV跨種屬傳播有關[3]。

HEV屬于肝炎病毒科(Hepeviridae),包括引起哺乳動物和禽類感染的正戊肝病毒屬(Orthohepevirus)以及感染魚類的魚戊肝病毒屬(Piscihepevirus)[4]。正戊肝病毒屬又分為A、B、C、D 4個種[5],HEV-A宿主包括人、家豬、野豬、鹿、兔和駱駝等;HEV-B僅來自禽類,宿主主要是家禽和野生鳥類;HEV-C1來自大鼠、HEV-C2來自雪貂;HEV-D在蝙蝠中發現。已知來自許多動物物種的HEV毒株會跨越物種障礙并感染人類。近幾年,在中國香港、西班牙等地陸續發現了人感染大鼠HEV-C1的病例[6]。也有研究報道,在韓國有豬HEV傳播給人類的風險[7]。近年來人感染HEV的發病率也呈迅速上升趨勢,因此HEV的跨種傳播和抗病毒研究也受到廣泛的重視。

HEV一般情況下導致急性自限性感染,不需要特殊治療。但對孕婦和免疫功能低下的患者有發展成慢性肝炎、肝硬化和肝癌的風險[8]。對于HEV感染目前還沒有公認的治療方法。利巴韋林和α干擾素是治療HEV感染最常用的廣譜藥物。但是利巴韋林有致畸性,禁用于妊娠患者;并且α干擾素會導致器官移植受者的移植排斥反應,不能用于大多數移植受者[9]。因此,迫切需要開發安全且有效的新型抗HEV的藥物。

二氫乳清酸脫氫酶(dihydroorotate dehydrogenase,DHODH)抑制劑能夠抑制多種RNA病毒的復制,如新冠病毒[10]、登革病毒等。ASLAN003是一種新型的高效的口服DHODH抑制劑,正在進行臨床Ⅱ期的研究,并獲FDA孤兒藥的認定資格。在急性髓樣白血病(AML)異種移植小鼠中延長其存活時間[11]。但是ASLAN003是否能夠抑制HEV的復制尚不清楚。因此,本研究通過高斯熒光素酶的HEV復制子系統和野生型的HEV復制模型,研究ASLAN003對HEV復制的影響,為臨床治療慢性HEV患者提供了潛在的新型抗病毒藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 Huh7細胞,HEK 293T細胞,HEV復制子細胞模型和HEV復制細胞模型,徐州醫科大學免疫與代謝重點實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 ASLAN003抑制劑,Cayman公司產品;高糖DMEM培養基和胎牛血清,Bio-Channel公司產品;高斯熒光素酶報告基因檢測試劑盒,上海碧云天公司產品;WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒,KeyGen公司產品;First-Strand cDNA Synthesis Kit,SYBR Green qPCR Master Mix(2X),APEx Bio公司產品;FITC山羊抗兔IgG,Jackson公司產品;Hoechst,賽默飛公司產品;兔源抗HEV ORF2 pAb抗體,徐州醫科大學免疫與代謝重點實驗室保存。

1.1.3 主要儀器 多功能檢測酶標儀,美國伯樂公司產品;實時熒光定量PCR檢測儀,美國羅氏公司產品;細胞培養箱,中國賽默飛世爾科技有限公司產品;倒置熒光顯微鏡,日本奧林巴斯公司產品。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據GenBank中HEV基因(JQ679013.1)序列,用DNAman軟件設計實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測引物,在蘇州金唯智生物科技有限公司合成。GAPDH-F/R引物由徐州醫科大學免疫代謝實驗室提供,試驗設GAPDH基因作為對照基因,引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.2 細胞培養 從-80℃冰箱中取出凍存的細胞,快速將其放入37℃水浴鍋中解凍,待細胞解凍后,將細胞轉移到3 mL完全培養基中,1 000 r/min離心5 min后棄去培養基,加入10% FBS的DMEM培養基,置于37℃、5% CO2培養箱培養,待細胞長滿后進行傳代。細胞傳代,首先棄去培養皿內的培養基,用無菌PBS清洗2遍,加入1 mL胰酶進行消化,待細胞回縮變圓后棄去胰酶,按照1∶4比例加入完全培養基傳代。

1.2.3 高斯熒光素酶檢測 將ASLAN003抑制劑進行倍比稀釋,濃度設置為0.2、1、5、10、50 μmol/L。分別將稀釋后的藥物加入到HEK 293T和Huh7中的HEV復制子(帶有高斯熒光素酶基因)模型中。將每個稀釋度設置3個復孔,并設置0.1% DMSO作為空白對照組,置于37℃、5% CO2培養箱中培養,72 h后收集上清備用,按照產品說明書配制高斯熒光素酶反應工作液,取80 μL工作液加入到20 μL上清中,用多功能檢測酶標儀采集熒光信號,通過檢測上清中高斯熒光素酶分泌量從而確定HEV的復制效率。

1.2.4 ASLAN003半數細胞毒性CC50檢測 將Huh7細胞鋪到96孔板中,使用不同濃度的ASLAN003抑制劑(0.2、1、5、10、50、200 μmol/L)加入到Huh7細胞中,72 h后棄去上清,收集細胞檢測細胞的增殖活性。按照96孔板每孔110 μL的量配制適量的WST-1檢測工作液,即100 μL DMEM培養基與10 μL的凱基四唑鹽混合。向各孔中加入110 μL的凱基四唑鹽工作液(包括未加細胞的空白孔),于37℃、5%的CO2培養箱中孵育3 h,用多功能酶標儀在450 nm波長處檢測每孔的光密度OD450 nm。將各孔的OD值減去空白孔OD值,各重復孔的OD值取平均值。細胞存活率以加藥組的OD值/對照組的OD值百分率表示。用Graphpad Prism 9計算出其半數毒性濃度(CC50)。

1.2.5 RT-qPCR檢測HEV RNA 將ASLAN003抑制劑稀釋為0.1 μmol/L和1 μmol/L,將0.1% DMSO作為對照,與HEV復制模型37℃共同孵育72 h后。收集細胞,利用Trizol法提取總RNA,反轉錄為cDNA后作為模版,然后用引物HEV-genome-F/R和GAPDH-F/R分別檢測HEV RNA和GAPDH基因的轉錄水平,分析結果。

1.2.6 間接免疫熒光檢測HEV ORF2蛋白 將0.016、0.08、0.4、2、10 μmol/L ASLAN003抑制劑與HEV復制模型37℃共同孵育72 h后,棄去細胞培養上清。用4%多聚甲醛固定細胞30 min后,用0.3% Triton對細胞打孔15 min。然后用50 g/L脫脂牛奶封閉細胞1 h,以兔源抗HEV ORF2蛋白的pAb(1∶3 000)為一抗,4℃孵育過夜,FITC標記山羊抗兔IgG(1∶500)為二抗,室溫孵育1 h,并用Hoechst(1∶500)染核15 min,經間接免疫熒光(IFA)檢測HEV ORF2蛋白的熒光水平。根據免疫熒光結果計算ASLAN003抑制HEV的IC50。

1.2.7 數據統計分析 用GraphPad Prism 9和Image J軟件作圖和統計學分析。單因素多組比較采用單因素方差分析,*P<0.05表示差異顯著。**P<0.01表示差異極顯著,***P<0.000 1表示差異極顯著。

2 結果

2.1 ASLAN003抑制HEV復制子的復制效率

將0.2、1、5、10、50 μmol/L的ASLAN003抑制劑與轉入HEV報告基因復制子的HEK 293T和Huh7細胞共同孵育后,收集上清,檢測高斯熒光素酶活性。結果顯示,與0 μmol/L(0.1% DMSO)對照組相比,ASLAN003在0.2 μmol/L～50 μmol/L范圍內均能顯著抑制HEV復制(P<0.000 1)(圖1A、圖1B)。

A.在HEK 293T細胞上,ASLAN003對HEV復制子模型的抑制作用;B.在Huh7細胞上,ASLAN003對HEV復制子模型的抑制作用

2.2 ASLAN003抑制HEV RNA復制

將ASLAN003抑制劑分別以0.1 μmol/L和1 μmol/L處理野生型HEV復制模型后,經72 h后收取細胞樣本。經RT-qPCR檢測HEV RNA復制水平,結果與0 μmol/L(0.1% DMSO)對照組相比,1 μmol/L ASLAN003可以將HEV RNA水平降低到50%左右(n=8,P<0.000 1)(圖2),說明ASLAN003能有效抑制HEV的復制。

圖2 RT-qPCR檢測ASLAN003對HEV的復制效果

2.3 ASLAN003抑制HEV ORF2蛋白表達

將0.016、0.08、0.4、2、10 μmol/L的ASLAN003處理野生型HEV復制模型,72 h后用IFA檢測HEV ORF2蛋白的表達水平。結果顯示,與0 μmol/L(0.1% DMSO)對照組相比,0.4 μmol/L的ASLAN003能夠抑制HEV ORF2蛋白表達(圖3),升高藥物濃度后,ORF2蛋白的表達進一步下降。以上結果說明ASLAN003能夠抑制HEV復制。

圖3 IFA檢測ASLAN003對HEV的抑制作用

2.4 ASLAN003的細胞毒性CC50和對HEV抑制作用IC50的計算

利用0.2、1、5、10、50、200 μmol/L的ASLAN003處理Huh7細胞,72 h后通過WST-1試劑盒檢測其細胞毒性,結果發現,ASLAN003的CC50為294 μmol/L。將0.016、0.08、0.4、2、10 μmol/L的ASLAN003處理野生型HEV復制模型,72 h后通過IFA檢測HEV ORF2蛋白的表達。利用ORF2蛋白的表達量計算ASLAN003抑制HEV復制的IC50。通過Image J軟件對其ORF2陽性細胞進行計算發現,ASLAN003的IC50為0.231 μmol/L。以上結果表明,ASLAN003抑制HEV復制濃度遠低于其對細胞的毒性作用,利用現有濃度抑制HEV復制是安全的。

3 討論

HEV可感染禽類和哺乳動物,除了人源HEV以外,大鼠HEV和兔HEV也能跨宿主傳播到人[12]。但是由于人源HEV和動物源HEV基因組同源性較低[13],現有人源HEV疫苗是否能夠保護人免受動物源HEV的感染尚不可知。因此,用抗HEV抑制劑阻斷HEV的復制,從而達到治療HEV感染的效果。

目前,利巴韋林和α干擾素是治療HEV感染最常用的廣譜藥物。但是大量的副作用和禁忌癥限制了利巴韋林和α干擾素的應用。對于孕婦和器官移植受者等特殊患者尋找安全且有效的新型抗HEV藥物具有重要意義。DHODH是嘧啶從頭合成的關鍵限速酶,是一種經過驗證的治療靶點,可用于治療自身免疫性疾病,包括類風濕性關節炎和多發性硬化癥[14]。目前DHODH是一種新型的抗病毒治療靶點。本文用帶有高斯熒光素酶的HEV復制子模型和野生型HEV復制模型對DHODH抑制劑ASLAN003進行了抗病毒作用的研究。結果顯示ASLAN003不僅能顯著抑制HEV RNA復制,也能顯著抑制HEV ORF2蛋白的表達。說明ASLAN003通過阻斷HEV生命周期中的復制和表達發揮其抗HEV作用。通過檢測ASLAN003的CC50和IC50發現其為有效且安全的抑制劑,這為臨床治療慢性HEV患者提供了安全且有效的新型候選藥物。

基因3型HEV具有人獸共患的特性,可以感染豬、鹿等哺乳動物[15]。本文用基因3型HEV的野生型病毒和復制子體外培養模型,說明ASLAN003可以作為潛在抑制人HEV和豬HEV復制的藥物。雖然有研究建立了大鼠HEV體外模型[16],但是其復制效率較人源HEV體外復制模型較低,對篩選抗大鼠HEV復制的抑制劑具有一定的局限性。需要建立不同基因型的HEV體外復制模型,從而進一步驗證ASLAN003是否抑制其他動物來源HEV的復制。

ASLAN003通過激活AP-1轉錄因子抑制蛋白質合成,通過誘導細胞凋亡,促進細胞分化,可用于急性骨髓性白血病的治療[11]。但ASLAN003作為嘧啶核苷酸合成途徑的DHODH抑制劑,其發揮抗HEV作用機制還未曾研究。有研究報道,對于嘌呤核苷酸合成途徑抑制劑,通過補充外源性鳥嘌呤可以逆轉其抗病毒作用,說明嘌呤合成途徑抑制劑通過阻斷鳥嘌呤的合成抑制病毒復制[17]。因此,推測ASLAN003嘧啶合成途徑抑制劑是通過阻斷尿嘧啶的合成發揮抗病毒作用,其抑制HEV復制的具體作用機制還有待進一步的研究。

本研究首次證實了DHODH抑制劑ASLAN003阻斷HEV復制的效果,研究結果為進一步揭示ASLAN003的抗病毒機理奠定了基礎,ASLAN003可以作為潛在的抗HEV感染的新型藥物。