3種流產劑對大鼠妊娠干預作用的比較研究

王祈帆,買占海,張曉松,紀 鵬,魏彥明*

(1.甘肅農業大學動物醫學院,甘肅蘭州 730070;2.新疆農業大學動物醫學院,新疆烏魯木齊 830052)

自然流產(spontaneous abortion,SA)是指非人為因素引發的流產,其發病因素繁多,主要包括母胎免疫失衡、內分泌失調、性激素分泌不足等[1]。其中Th1/Th2失衡使母胎免疫功能紊亂,是導致流產的主要因素之一[2],而外源性雌激素、孕酮、促乳素等在妊娠期間可調節母胎免疫失衡問題,隨著激素的增加,Th1細胞的活性降低、炎性細胞因子分泌減少[3]。米非司酮是一種孕激素受體拮抗劑,憑借對孕酮受體的高親和力和孕酮競爭結合受體,使孕酮失活引起流產[4];溴隱亭是通過降低促乳素的濃度,間接引起孕激素降低,增強Th1型細胞因子的亢進,使Th1/Th2平衡偏向Th1型,最后引起流產[5];脂多糖則是通過誘發子宮內膜炎癥引起流產或胚胎吸收[6]。

建立穩定、可控的動物流產模型,有助于研究自然流產發病機制。本研究選用米非司酮、溴隱亭和脂多糖分別建立動物流產模型,對妊娠大鼠的生殖生理、肝、腎功能的變化進行研究,比較不同流產劑對SD大鼠妊娠的干預及肝腎損傷,為探究流產疾病發病機制及藥物對后代生長發育的影響和中藥方劑防治妊娠母畜流產的臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級SD雌性大鼠24只,180 g左右;SD雄性大鼠12只,250 g左右;[生產批號SCXK(甘)2021-0001],由中國農業科學院蘭州獸醫研究所實驗動物中心提供。晝夜各半循環照明,自由采食飲水7 d后開始試驗,試驗獲甘肅農業大學實驗動物倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑 米非司酮片(國藥準字:H10950003),紫竹公司產品;甲磺酸溴隱亭片(國藥準字:HJ20160170),佰莫亭公司產品;脂多糖,北京索萊寶科技有限公司產品;雌二醇(estradiol,E2)、白細胞介素-1β(interleukin-1 beta,IL-1β)、白細胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白細胞介素-12(interleukin-12,IL-12)、孕酮(progesterone,P)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor- alpha,TNF-α)、ELISA試劑盒,上海酶聯生物科技有限公司產品;山羊抗兔二抗試劑盒、免疫組化抗原修復緩沖液、DAB顯色液,中杉金橋生物技術有限公司產品;兔源抗大鼠NF-κB p65一抗,博奧森生物技術有限公司產品;兔源抗大鼠ER一抗,武漢三鷹公司產品。

1.1.3 主要儀器 Olympus DP-71顯微照相系統(BX51+DP71),日本Olympus公司產品;正置顯微鏡(13395H2X),德國徠卡公司產品;全自動生化分析儀(Chemray 800),深圳雷杜生命科技有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 孕鼠檢測 SD大鼠適應性飼養7 d后,于第7 d下午18時雌雄比例2∶1合籠,次日上午9時左右開始孕檢。將有陰栓或陰道分泌物涂片有大量無核片狀角質化上皮細胞和精子者判定為妊娠第1天。

1.2.2 試驗分組 妊娠大鼠隨機分組,分別設立空白對照組、米非司酮組、溴隱亭組和脂多糖組,每組6只。空白對照組按0.8 mL/kg注射生理鹽水外,其余各組均于妊娠第6～8天上午8:30進行背部皮下注射藥物,米非司酮組3.75 mg/kg(1 mg/mL),溴隱亭組0.4 mg/kg(0.4 mg/mL)注射75%無水乙醇溶解的溴隱亭,脂多糖組0.8 mg/kg(0.5 μg/mL)注射脂多糖溶液,每日下午18:00觀察孕鼠狀態。若陰道有少量出血,且孕鼠狀態煩躁易怒,則表明流產模型建立成功[7]。

1.2.3 血液生化指標測定 腹主動脈采血后于室溫放置2 h,3 000 r/min離心15 min,取上清,用全自動生化分析儀測定各組大鼠血清中堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase,AST)、血尿素(UREA)以及血肌酐(creatinine,CREA)等血液生化指標。血液生化指標。

1.2.4 血清中炎性細胞因子和孕激素水平測定 酶聯免疫試劑盒檢測血清中TNF-α、IL-2、IL-12、IL-6、IL-1β、雌激素、孕酮和促乳素等,具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.2.5 病理組織學觀察 取固定于40 mL/L甲醛溶液中的子宮、肝臟組織,流水沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色、封片。

1.2.6 子宮組織中NF-κB p65、ER蛋白表達 取子宮組織石蠟切片,脫蠟后用檸檬酸鹽修復液進行抗原熱修復,一抗NF-κB p65(1∶150)、ER(1∶200)37℃孵育1 h,山羊抗兔二抗試劑盒孵育二抗,DAB顯色,蘇木素復染,梯度酒精脫水、二甲苯透明,封片。

1.2.7 數據處理與分析 本試驗結果圖用GraphPad Prism5.0軟件制作,統計學分析用SPSS 22.0統計軟件對各組間數據進行單因素方差分析,比較采用LSD法,試驗數據以“平均值±標準差(Mean±SD)”表示,P<0.01表示差異極顯著,P<0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 不同流產劑引起大鼠流產率比較

不同流產劑引起大鼠流產模型的妊娠結局相關指標見表1。 米非司酮組和溴隱亭組的流產率明顯高于LPS組,超過50%;與空白對照組相比,其余各組大鼠子宮連胎重均顯著降低(P<0.05)。表明米非司酮和溴隱亭的致流產作用較強,優于脂多糖。

表1 各組孕鼠妊娠結局相關指標

2.2 各組大鼠血清中血液生化指標

與空白對照組相比,米非司酮組的ALT、AST和ALP水平顯著增加(P<0.05),溴隱亭組的AST和ALP水平顯著增加(P<0.05),脂多糖組的ALT和ALP水平顯著增加(P<0.05);脂多糖組的UREA和CREA顯著降低(P<0.05),其他各組無顯著性差異(P>0.05)。表明3種流產劑均會對SD大鼠的肝功能造成不同程度的損傷,其中米非司酮對SD大鼠肝功能損傷最嚴重,脂多糖還會對SD大鼠的腎功能造成嚴重損傷(圖1)。

K.空白對照組;MFST.米非司酮組;XYT.溴隱亭組;LPS.脂多糖組;*P<0.05

2.3 各組大鼠血清中炎性細胞因子水平

與空白對照組相比,米非司酮組大鼠血清中IL-2和各模型組大鼠血清中TNF-α、IL-12、IL-1β、IL-6均顯著增加(P<0.05)。表明不同流產劑均會導致炎性細胞因子水平升高,從而引發炎癥(圖2)。

圖2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-2、IL-12、IL-6和IL-1β的水平

2.4 各組大鼠血清中孕激素的水平

與空白對照組相比,米非司酮組和脂多糖組大鼠血清中的雌激素水平顯著降低(P<0.05),溴隱亭組大鼠血清中的雌激素水平極顯著降低(P<0.01);其余各組大鼠血清中孕酮水平均顯著降低(P<0.05),脂多糖組大鼠血清中的促乳素水平顯著降低(P<0.05),溴隱亭組大鼠血清中的促乳素水平極顯著降低(P<0.01),米非司酮組有所降低,但無顯著性差異(P>0.05)(圖3)。說明不同流產劑對孕激素的分泌均有抑制作用。

圖3 各組大鼠血清中E2、P和PRL的水平

2.5 各組大鼠子宮組織中NF-κB p65和ER的表達

空白對照組中有ER表達,且主要表達在子宮組織細胞核上,部分表達于胞漿中,其他各組的ER表達則不明顯;各組均有NF-κB p65的表達,主要表達在子宮組織的細胞核中,胞質中也有表達,且與空白對照組相比,各流產模型組的表達更為強烈。說明不同的流產劑均對ER表達有抑制作用,對NF-κB p65表達則有促進作用(圖4)。

A.空白對照組; B.米非司酮組; C.溴隱亭組; D.LPS組

2.6 各組大鼠病理組織形態學觀察

空白對照組中央靜脈血管周圍肝細胞索排列整齊,肝細胞核、肝竇清晰可見,且散落少許紅細胞;米非司酮組肝細胞索間肝竇變窄幾近消失,且布有紅細胞,肝細胞腫脹,有充血、淤血現象;溴隱亭組部分肝細胞索間間隙減小,散落有少量紅細胞,細胞核清晰可見;脂多糖組肝細胞腫脹、變圓,胞漿中有顆粒狀物質,存在顆粒變性現象,此外,肝竇變窄幾近消失,且散落有紅細胞。空白對照組的子宮內膜結構層次清晰完整,腺體豐富;米非司酮組的腺體數目顯著減少,腺腔變得狹長,子宮內膜變薄;溴隱亭組的子宮內膜顯著變薄,腺腔擴張;脂多糖組的腺體數目明顯減少,腺腔閉合(圖5)。表明不同流產劑均會對肝組織和子宮組織造成不同程度的病理學損傷,其中以溴隱亭組的肝損傷較輕。

A1、B1、C1、D1.肝組織(400×);A2、B2、C2、D2.子宮組織(100×);A1～A2.空白對照組;B1～B2.米非司酮組;C1～C2.溴隱亭組;D1～D2.脂多糖組;灰色箭頭表示散落的紅細胞;綠色箭頭表示肝細胞腫脹;黑色箭頭表示肝細胞索間隙減小;橙色箭頭表示顆粒變性;藍色箭頭表示子宮內膜

3 討論

3.1 不同流產劑對大鼠流產率的影響

自然流產是妊娠母畜在妊娠期間由于某些因素引發的妊娠中斷[8]。不同流產劑導致大鼠流產率為:脂多糖的致流產率為33.3%,米非司酮和溴隱亭的致流產率為50%以上,表明米非司酮和溴隱亭對妊娠大鼠的致流產效果更好。

3.2 不同流產劑對大鼠血液生化指標的影響

血液生化檢測中ALT、AST和ALP均屬于肝功能變化的主要評定指標,ALT、AST和ALP升高則表明肝功能受到了損傷[9]。本試驗結果顯示,與空白對照組相比,各模型組的ALT、AST和ALP的水平均有不同程度的增加,病理組織學顯示溴隱亭組有輕微肝損傷,而米非司酮組和脂多糖組表現有嚴重肝損傷。UREA、CREA是檢測腎功能損傷的常用指標,UERA、CREA降低則表明腎功能受損[10]。本試驗結果顯示,與空白對照組相比較,脂多糖組的UREA和CREA顯著降低,說明脂多糖可引起嚴重的腎損傷。

3.3 不同流產劑對大鼠血清炎癥因子表達的影響

母體妊娠期間母胎界面處于促炎因子和抑炎因子動態平衡的免疫微環境,可建立起母體對半同種異體胚胎的耐受性,使胚胎免受母體的免疫排斥[11]。Th1型細胞分泌Th1促炎細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12等,介導細胞免疫、炎癥反應,促炎細胞因子的分泌增多,Th1/Th2平衡向Th1型偏移,抑制胚胎發育,危害胎兒生存,進而導致流產[12]。Th2型細胞分泌Th2抑炎細胞因子如IL-4、IL-10等,主要通過激活產生B細胞抗體以介導體液免疫,拮抗Th1促炎細胞因子,最后達到維持妊娠的目的[13]。本試驗結果顯示,與空白對照組相比,各模型組的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12和米非司酮組的IL-2水平顯著增加(P<0.05),表明各模型組中Th1型細胞細胞因子呈現不同程度的增加,Th1/Th2平衡向Th1型偏移,提示各流產劑可能是通過促進Th1促炎細胞因子的分泌以改變Th1/Th2平衡的途徑導致流產發生,這與獸醫臨床實踐中家畜流產的主要原因相一致[14]。

3.4 不同流產劑對大鼠血清激素水平表達的影響

孕酮和雌激素均為維持妊娠所需的重要激素,主要由妊娠黃體和胎盤分泌,維持妊娠的Th2型細胞因子的產生有關[15];催乳素可以促進卵泡發育成熟、提高子宮內膜容受性,還有助于促進胚胎著床、維持妊娠[16],常用于評估女性卵巢功能[17]。本研究發現各模型組的孕激素水平與空白對照組相比均呈現不同程度的降低,這與吳燕紅研究結果相一致[18],表明了孕激素對于妊娠成功和維持妊娠的重要性。

3.5 不同流產劑對大鼠子宮組織中NF-κB p65和ER表達的影響

雌激素通過結合激活ER,調節ER介導的NF-κB等炎癥相關通路[19-22],抑制IL-1β、IL-6和TNF-α分泌,促使Th1/Th2平衡向Th2偏移,以維持正常妊娠[23]。與雌激素相比,孕酮對Th1型細胞分泌的Th1促炎細胞因子的下調作用更加明顯[24]。催乳素可以通過抑制NF-κB通路活化,下調NF-κB水平,間接抑制TNF-α、IL-6、IL-1β的產生[25],使Th1/Th2平衡向Th2型偏離,從而維持妊娠。本試驗結果表明,各模型組與空白對照組相比ER表達不明顯,而NF-κB p65有較高的表達,與文獻[26]的研究結果一致。表明各流產劑可能通過降低孕激素,抑制ER表達,從而促進NF-κB p65磷酸化,促進TNF、IL-6、IL-1β的產生,引發炎癥反應,使Th1/Th2平衡向Th1型偏離,從而抑制胚胎發育,導致流產。

不同流產劑均可通過降低孕激素水平抑制ER激活,活化NF-κB通路,促進NF-κB p65磷酸化和TNF、IL-6、IL-1β的產生,使Th1/Th2平衡向Th1型偏離,從而引發炎癥反應,抑制胚胎發育導致流產。其中,米非司酮和溴隱亭的致流產作用更強,流產率超過50%,且溴隱亭對母體肝腎損傷小于米非司酮,更適用于建立流產模型進行相關研究。