β2-腎上腺素能受體與神經(jīng)絲在山羊脾中的分布和共定位研究

李曉萌,竇體馨,李志偉,葉守沖,楊松樺,徐永平,武永杰

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

淋巴器官中脾、胸腺和淋巴結(jié)中均存在神經(jīng)纖維。在大鼠去神經(jīng)支配脾內(nèi)淋巴細(xì)胞絲/蘇氨酸(ERK)表達變化研究中,建立去神經(jīng)支配脾的大鼠模型,研究大鼠脾在無交感神經(jīng)支配下脾內(nèi)淋巴細(xì)胞ERK的變化,發(fā)現(xiàn)在去除交感神經(jīng)支配后,脾中淋巴細(xì)胞增殖活動明顯減弱,證實神經(jīng)與免疫聯(lián)系密切[1]。神經(jīng)系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)的相互調(diào)控關(guān)系是神經(jīng)免疫學(xué)的研究熱點,神經(jīng)系統(tǒng)通過內(nèi)分泌系統(tǒng)實現(xiàn)間接調(diào)控免疫系統(tǒng),還能通過神經(jīng)纖維實現(xiàn)免疫調(diào)控功能。腎上腺素(adrenaline,AD)是哺乳動物腎上腺髓質(zhì)所分泌的重要激素,參與細(xì)胞的各種調(diào)控,腎上腺素能受體是G蛋白偶聯(lián)受體的一種,通過G蛋白實現(xiàn)對細(xì)胞新陳代謝及功能調(diào)控[2]。激素與G蛋白相偶聯(lián)后,通過環(huán)磷酸腺苷(cAMP)信號通路介導(dǎo)細(xì)胞外信號傳遞至細(xì)胞內(nèi),實現(xiàn)對細(xì)胞的調(diào)節(jié)。腎上腺素能受體還有α和β受體,α受體亞型為α1和α2,β受體亞型為β1、β2、β3。α受體分布在大腦皮質(zhì)、海馬以及泌尿生殖器官中。β受體在機體的廣泛部位所分布,其中β1受體在心臟富集,其占總β腎上腺素能受體的75%～80%,而肺、肝、腎、脾、外周血管和子宮等部位存在著大量的β2受體。

神經(jīng)絲是由4個亞基單位所組成的雜聚物,根據(jù)分子質(zhì)量的不同可分為輕鏈神經(jīng)絲、中間神經(jīng)絲、重鏈神經(jīng)絲和外周蛋白。神經(jīng)絲可作為多種淋巴器官中神經(jīng)纖維的標(biāo)識物,可以跨越多種物種,如人和大鼠[3]。本文用免疫組織化學(xué)染色研究β2-AR(β2-adrenergic receptor,β2-AR)與神經(jīng)絲(neurofilaments,NFs)在山羊脾中表達分布和形態(tài),用免疫熒光雙重標(biāo)記染色技術(shù)研究β2-AR與NFs山羊脾中的分布特點及共定位,以探討神經(jīng)纖維作用于脾淋巴細(xì)胞的機制,為闡明神經(jīng)免疫調(diào)控提供形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 健康成年山羊6只,雌、雄各半,均購自楊凌某羊場,依照動物福利在實驗室飼養(yǎng)至少1周后開展試驗。

1.1.2 主要試劑 β2-AR多克隆抗體、NF多克隆抗體,美國Invitrogen公司產(chǎn)品;驢抗小鼠IgG H&L(FITC)、驢抗兔IgG H&L(TRITC)預(yù)吸附二抗,美國Abcam公司產(chǎn)品;即用型快捷免疫組化MaxVisionTMHRP試劑盒(兔、鼠)和粉劑型抗原修復(fù)液,福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司產(chǎn)品;DAB(四鹽酸3,3-二氨基聯(lián)苯胺)顯色試劑盒,武漢博士德生物公司產(chǎn)品;免疫染色一抗和二抗稀釋液、DAPI,上海碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品;30%過氧化氫,廣州光華科技有限公司產(chǎn)品;TritonX-100,北京Solarbio公司產(chǎn)品;驢血清封閉液,美國Jackson公司產(chǎn)品;DAKO抗熒光淬滅封片劑,美國DAKO公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 CM2235輪轉(zhuǎn)式切片機、CM-1905型冰凍切片機,德國Leica公司產(chǎn)品; 0.5 μL-1000 μL微量加樣器,德國Eppendorf公司產(chǎn)品;正置顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡,日本尼康公司產(chǎn)品。

1.2 方法

對6只山羊肌肉注射0.2 mL/kg陸眠寧Ⅱ,待其完全麻醉后,仰臥固定于手術(shù)臺上,放血處死,迅速取出脾,用生理鹽水沖洗后放置于4%多聚甲醛液中固定24 h,用于免疫組織化學(xué)SP法染色和免疫熒光染色。

1.2.1 免疫組化SP法染色 將固定好的脾流水沖洗12 h,取出后依次經(jīng)過梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋等常規(guī)操作處理后,制片,切片厚度為6 μm。切片分6套,第1套進行β2-AR免疫組織化學(xué)SP法染色:切片脫蠟復(fù)水。檸檬酸鹽抗原熱修復(fù)8 min,修復(fù)之后冷卻至室溫。3%H2O2過氧化物酶清除10 min,0.3% TritonX-100室溫孵育10 min。驢血清封閉液室溫孵育40 min,之后滴加兔抗β2-AR多克隆抗體(1∶100稀釋),4℃過夜,滴加二抗即用型快捷免疫組化試劑盒(兔)孵育30 min、每步完成之后均用0.01 mol/L PBS漂洗3次,每次5 min,將驢血清輕輕甩去。DAB顯色,顯微鏡下觀察控制顯色反應(yīng)時間,蒸餾水終止反應(yīng);蘇木精復(fù)染、梯度酒精脫水、透明和封片。第2套SP法染色后未經(jīng)蘇木精復(fù)染。第3套為陰性對照,用0.01 mol/L PBS替代兔抗β2-AR抗體,其他步驟同SP法染色。第4套切片用于NF免疫組織化學(xué)SP法染色:除一抗和二抗不同,其余步驟同第1套切片,一抗用鼠抗NF多克隆抗體(1∶100稀釋),二抗用即用型快捷免疫組化試劑盒(鼠)。第5套切片未蘇木精復(fù)染,其余步驟同第4套。第6套切片為陰性對照,用0.01 mol/L PBS替代鼠抗NF抗體,其他步驟同第4套切片。

1.2.2 免疫熒光染色 將固定好的脾組織流水沖洗12 h,取出后依次經(jīng)過15%和30%的蔗糖溶液脫水。冰凍切片機進行包埋與切片:冰凍切片機使用之前預(yù)冷,待箱體和凍頭溫度降低至-20℃時可用,將脫水后組織修剪成合適大小后,直立放置于凍頭上,快速滴加冰凍切片包埋劑,待包埋劑將整塊組織塊覆蓋后,將凍頭放入箱體,待覆蓋有組織塊的包埋劑呈固體后,進行冰凍切片,切片厚度10 μm。切片分2套。第1套切片進行免疫熒光染色:冰凍切片抗原修復(fù)液進行抗原修復(fù),室溫孵育5 min,3 mL/L TritonX-100室溫孵育10 min,每步完成之后均用0.01 mol/L PBS漂洗3次,每次5 min。非免疫驢血清封閉1 h,甩去血清后,滴加混合一抗(β2-腎上腺素受體多克隆抗體、神經(jīng)絲多克隆抗體,單個抗體工作濃度為1∶200),4℃過夜。復(fù)溫15 min后,用0.01 mol/L PBS漂洗3次,每次5 min,滴加混合二抗(單個抗體工作濃度1∶200)孵育2 h,滴加熒光二抗之后的步驟在避光條件下完成。0.01 mol/L PBS漂洗3次,每次5 min,滴加濃度為4 μg/mL的DAPI的染色液,孵育10 min。用0.01 mol/L PBS漂洗3次,每次5 min,抗熒光淬滅封片劑封片。第2套切片0.01 mol/L PBS代替混合一抗,其余步驟與第1套切片同。

1.2.3 圖像分析 將同批次染色的切片置于顯微鏡下觀察,相同條件下顯微拍照。圖像用IamgeJ分析標(biāo)注。進行圖像半定量分析,檢測每張圖片的平均光密度值(average optical density,AOD),計算總AOD平均值。通過軟件GraphPad Prism對數(shù)據(jù)差異分析和作圖,P<0.05為差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。經(jīng)過熒光染色的切片在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照,用NIS-Elements Analysis軟件進行分析。

2 結(jié)果

2.1 山羊脾β2-AR免疫組織化學(xué)SP法染色結(jié)果

脾中不同部位染色強度不一對照組切片(圖1E)可見脾組織中無β2-AR免疫反應(yīng)產(chǎn)物,細(xì)胞核為藍色。試驗組切片(圖1A、圖1B、圖1C)組織內(nèi)可見棕褐色、棕黃色或淡黃色的β2-AR免疫反應(yīng)產(chǎn)物。如在白髓(圖1B),細(xì)胞核呈現(xiàn)藍色,表明β2-AR的免疫反應(yīng)產(chǎn)物主要分布在細(xì)胞膜,呈點狀或者圓形狀分布(圖1)。胞核為陰性,SP免疫組織化學(xué)染色沒有非特異性著色。試驗組SP染色結(jié)果顯示,β2-AR免疫陽性產(chǎn)物在山羊脾中分布廣泛,白髓、邊緣區(qū)、紅髓、小梁和血管等結(jié)構(gòu)均呈不同程度著色。其中在含淋巴細(xì)胞的白髓中β2-AR免疫組化顯色最強,為棕褐色,胞核為空泡,為陰性無著色(圖1D)。蘇木精復(fù)染之后(圖1A、圖1B、圖1C),可見藍色細(xì)胞核。在平滑肌組成的小梁(圖1A)、血管(圖1B)(中央動脈)、在含血紅髓(圖1A)和邊緣區(qū)(圖1C)中β2-AR中有棕黃色陽性顆粒分布。免疫組化AOD統(tǒng)計分析,脾中兩兩組織間比較發(fā)現(xiàn),白髓中免疫組化染色陽性相對表達量極顯著高于紅髓(P<0.01),極極顯著高于邊緣區(qū)和被膜(P<0.001);紅髓中免疫組化染色陽性相對表達量極顯著高于邊緣區(qū)和被膜(P<0.01)。

A～C.SP法染色(蘇木精復(fù)染);D.SP法染色(蘇木精未復(fù)染);E.陰性對照;F.β2-AR在脾各組織的相對表達量;WP.白髓;RP.紅髓;MZ.邊緣區(qū);CP.被膜;黑色箭頭為β2-AR的陽性信號;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

2.2 山羊脾NFs免疫組織化學(xué)SP法染色結(jié)果

脾中不同部位的染色強度不一,對照組切片(圖2E)經(jīng)蘇木精復(fù)染后,可見脾中無NFs免疫反應(yīng)產(chǎn)物,細(xì)胞核為藍色。試驗組切片經(jīng)蘇木精復(fù)染后(圖2A、圖2B、圖2C)組織內(nèi)可見棕黃色的NFs免疫反應(yīng)產(chǎn)物。試驗組SP染色結(jié)果顯示,NFs在免疫組織化學(xué)中陽性信號為點狀、絲狀或串珠絲狀。其中被膜及小梁內(nèi),有棕褐色的免疫陽性反應(yīng)產(chǎn)物的存在,陽性產(chǎn)物呈絲狀和串珠樣排列(圖2A),在紅髓、白髓以及邊緣區(qū)呈現(xiàn)點狀陽性顆粒。免疫組化AOD統(tǒng)計分析,紅髓中免疫組化染色陽性相對表達量顯著高于白髓(P<0.05),極顯著高于邊緣區(qū)(P<0.01);被膜中免疫組化染色陽性相對表達量極顯著高于邊緣區(qū)和白髓(P<0.01)。

A～C.SP法染色(蘇木精復(fù)染);D.SP法染色(蘇木精未復(fù)染);E.陰性對照;F.NFs在脾組織中的相對表達量;WP.白髓;RP.紅髓;T.小梁;MZ.邊緣區(qū);CP.被膜;黑色箭頭為NFs的陽性信號;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

2.3 山羊脾β2-AR與NFs的共存結(jié)果

染色后組織切片經(jīng)激光共聚焦顯微鏡掃描成像,經(jīng)綠色、紅色和藍色3種免疫熒光染色,紅色標(biāo)記的是β2-AR,綠色標(biāo)記的是NFs,藍色標(biāo)記的是細(xì)胞核。2種受體共存的判斷標(biāo)準(zhǔn)是細(xì)胞的胞質(zhì)或全細(xì)胞為黃色或者橙色。3種熒光圖像經(jīng)NIS-Viewer 5.21.00作圖像合成處理,根據(jù)圖像重疊情況分析2種受體的組織或細(xì)胞內(nèi)共定位情況(圖3)。在激光共聚焦顯微鏡觀察,紅色熒光標(biāo)記的 β2-AR主要分布于白髓和紅髓,在邊緣區(qū)和被膜中也有少量分布;綠色熒光標(biāo)記的NFs主要分布于紅髓和被膜,在白髓和邊緣區(qū)中也有少量分布,與免疫組化染色結(jié)果一致。2種不同的熒光標(biāo)記受體染色疊加后呈黃色,2種受體主要在紅髓、白髓內(nèi)共存,在被膜和邊緣區(qū)內(nèi)也有一定量細(xì)胞雙標(biāo)陽性著色(圖3A、圖3B)。

A～B.β2-AR,NFs和細(xì)胞核的熒光三標(biāo);A1～B1.細(xì)胞核的熒光單標(biāo);A2～B2.NFs的熒光單標(biāo);A3～B3.β2-AR熒光單標(biāo);白色箭頭表示β2-AR和NFs的熒光雙標(biāo);WP.白髓;MZ.邊緣區(qū);RP.紅髓;SP.被膜;T.小梁

3 討論

腎上腺素是一種激素和神經(jīng)傳遞體,由腎上腺釋放,可參與調(diào)節(jié)心臟收縮[4]。腎上腺素受體分為α和β,α受體亞型為α1和α2,β受體亞型為β1、β2、β3。β1、β2、β3受體同源性為65%～70%,分別在心臟、氣道平滑肌和脂肪組織中被鑒定。β-AR是交感神經(jīng)的重要組成部分,屬于G蛋白偶聯(lián)受體,其信號通路受到內(nèi)源性兒茶酚胺、去甲腎上腺素以及腎上腺素的調(diào)控[5]。腎上腺素能受體在單核巨噬細(xì)胞中廣泛存在,可作用于單核巨噬細(xì)胞表面的受體產(chǎn)生免疫活性,β-AR的活化可促炎因子表達減少,抗炎因子表達增加。脾組織原位檢測淋巴細(xì)胞的腎上腺素能受體mRNA的研究,從基因水平證明免疫細(xì)胞表面存在β-AR。分布位置主要是白髓,與本試驗結(jié)果一致。淋巴細(xì)胞主要表達β2-AR,淋巴細(xì)胞表面存在β2-AR,幾種淋巴細(xì)胞分別表達不同的β2-AR。β2-AR是交感神經(jīng)纖維支配脾免疫功能和實現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)與內(nèi)分泌系統(tǒng)的信息交流的橋梁。

高分子質(zhì)量神經(jīng)絲蛋白(neurofilament H,NF-H)抗體被用作標(biāo)記脾組織內(nèi)神經(jīng)纖維,能特異性識別NF-H。為了驗證該抗體,進行小鼠組織(腦、皮膚、小腸和肝)NFs的免疫熒光染色,觀察到明亮的染色纖維。NFs是神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞骨架蛋白,是一種組織特異性中間絲,在軸突中含量特別豐富,在軸突發(fā)育過程中,對軸突徑向生長、軸突口徑的維持和電脈沿軸突的傳遞很重要。它是由4個亞基單位所組成的雜聚物,根據(jù)分子質(zhì)量的不同可分為輕鏈神經(jīng)絲、中間神經(jīng)絲、重鏈神經(jīng)絲和外周蛋白。在小鼠脾白髓血管周圍和被膜下區(qū)域可觀察到神經(jīng)絲蛋白的陽性信號[6],根據(jù)體內(nèi)研究,在小鼠脾中觀察到少量神經(jīng)標(biāo)志陽性產(chǎn)物。平滑肌受自主神經(jīng)支配,是周圍神經(jīng)的靶細(xì)胞,受中樞神經(jīng)系統(tǒng)支配,研究表明[7],傳入神經(jīng)纖維沿著小梁在脾中廣泛分布,并與含平滑肌血管(如中央動脈及其分支動脈、其他小血管)分布密切相關(guān)。因此,在平滑肌豐富的被膜和小梁上廣泛分布有NFs,神經(jīng)纖維調(diào)控平滑肌細(xì)胞,實現(xiàn)脾神經(jīng)支配被膜及小梁平滑肌和血管平滑肌,達到對脾血流量的控制,神經(jīng)纖維對脾血流量和血管通透性的調(diào)控可能會影響免疫細(xì)胞的后續(xù)狀態(tài)以及導(dǎo)致血液攜帶外來抗原的清除。本研究中NFs存在于脾淋巴細(xì)胞中,在白髓的動脈周圍淋巴鞘與邊緣區(qū)的點狀神經(jīng)絲分布最為顯著。神經(jīng)纖維是一種與血管相對靜止的結(jié)構(gòu),而機體內(nèi)的免疫細(xì)胞是組織或者器官內(nèi)的游走性細(xì)胞[8],所以,這種可以形成神經(jīng)-免疫細(xì)胞通過神經(jīng)遞質(zhì)受體接觸或者結(jié)合可以稱為神經(jīng)免疫細(xì)胞單位或者是神經(jīng)免疫突觸[9],它是一種動態(tài)的結(jié)構(gòu),受機體免疫水平的調(diào)節(jié)。有研究探索了一種支配淋巴器官的新方法——神經(jīng)免疫交叉對話的“橋梁細(xì)胞”,在神經(jīng)系統(tǒng)向免疫系統(tǒng)傳遞信號方面發(fā)揮著重要作用[10-11]。研究表明[3],來自腹腔神經(jīng)叢、左側(cè)腹腔神經(jīng)節(jié)和右側(cè)迷走神經(jīng)的分支形成脾內(nèi)的神經(jīng)叢。本研究結(jié)果顯示,NFs廣泛分布于白髓與小梁中,脾作為淋巴系統(tǒng)器官,受豐富的交感神經(jīng)支配,脾動脈分支的神經(jīng)叢經(jīng)脾的被膜,經(jīng)小梁深入白髓,調(diào)控脾淋巴細(xì)胞。這與文獻[3]報道一致,腎上腺素能神經(jīng)纖維末梢釋放腎上腺素神經(jīng)遞質(zhì),通過直接的神經(jīng)遞質(zhì)-受體方式進行信息交流與免疫調(diào)控,但其具體機制還有待進一步研究。

β2-AR免疫陽性產(chǎn)物在脾的白髓、紅髓、血管、被膜和小梁均有不同程度的著色,且主要存在于白髓和紅髓淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜表面,被膜、小梁、血管和邊緣區(qū)也有少量分布。NFs陽性產(chǎn)物主要分布在脾中紅髓、被膜和小梁中,白髓和邊緣區(qū)有少量分布。共定位染色揭示:脾受到交感-腎上腺素能神經(jīng)的調(diào)控,交感神經(jīng)纖維通過釋放神經(jīng)遞質(zhì)-去甲腎上腺素,作用于脾上的腎上腺素能受體實現(xiàn)功能調(diào)控。神經(jīng)纖維釋放神經(jīng)遞質(zhì)作用于平滑肌細(xì)胞上的受體,影響脾的血流調(diào)節(jié)以及調(diào)控血液對外來異物的清除;白髓和紅髓中的淋巴細(xì)胞與交感神經(jīng)纖維形成神經(jīng)免疫細(xì)胞或者神經(jīng)免疫突觸,神經(jīng)纖維末梢釋放神經(jīng)遞質(zhì)通過直接的神經(jīng)遞質(zhì)-受體方式進行信息交流與免疫調(diào)控,有助于進一步從形態(tài)學(xué)上揭示脾中的神經(jīng)-免疫細(xì)胞間的信息通訊機制。