小熊貓紫色色桿菌PCR檢測方法的建立及應用

劉 蓓,羅偉銘,王隆柏,徐素慧,周倫江,林 琳,何曉聰,修云芳*

(1.海峽(福州)大熊貓研究交流中心,福建福州 350025;2.福建省農業科學院畜牧獸醫研究所,福建福州 350013)

紫色色桿菌(Chromobacteriumviolaceum)是一種兼性厭氧革蘭氏陰性菌,主要存活于熱帶和亞熱帶地區水和土壤中,適宜生長溫度為30～35℃,菌落呈中等大小、圓形、光滑濕潤的紫羅蘭色,但有粗糙及無色變種[1]。紫色色桿菌是一種條件致病菌,雖然人類和動物感染較為少見,但一旦感染,病情進展迅速,常引起敗血癥和肝、肺等內臟膿腫,如不及時診斷治療,結果往往是致命的[2]。2020年7月因飼養環境變動,海峽(福州)大熊貓研究交流中心有6只小熊貓感染該菌,病情發展迅速,以呼吸衰竭為主要特征,來不及診斷和治療就已發展為敗血癥而亡[3]。2021年8月南京紫清湖野生動物世界有6只小熊貓因打斗出現外傷后感染紫色色桿菌,最終有5只臟器衰竭死亡,經細菌分離鑒定確定病因后及時調整治療方案,成功治愈1只[4]。因此,建立快速有效的檢測方法,能夠對紫色色桿菌病早期診斷,及時采取治療措施,控制該疫病的進一步發展。

目前,對于致病菌檢測主要為分子生物學和免疫學等方法,分子生物學技術尤其是PCR技術簡單快速、特異性強、靈敏度高,在疾病檢測方面有十分重要的地位[5]。本試驗用常規PCR技術,設計出紫色色桿菌的特異性引物,擴增出相應的目的片段,成功建立起小熊貓紫色色桿菌的PCR檢測方法,為防控小熊貓紫色色桿菌病疫情的發生奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及病料 紫色色桿菌菌株(CV20)為2020年因紫色色桿菌病死亡的小熊貓體內分離[3],紫色色桿菌模式株ATCC 12472購自廣東省微生物菌種保藏中心;其他非目標菌株為小熊貓飼養場所收集到的常見環境菌和從死亡小熊貓體內分離到的其他病菌,與2020年因紫色色桿菌病死亡的小熊貓病料一起保存于福建省農科院畜牧獸醫研究所。

1.1.2 試劑 細菌DNA提取試劑盒、土壤DNA小提試劑盒、水體DNA小提試劑盒,廣州美基生物科技有限公司產品;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司產品;血瓊脂平板,廣東環凱微生物科技有限公司產品;GoTaq?Green Master Mix,普洛麥格(北京)生物技術有限公司產品;DNA Marker DL 2 000、核酸染料、瓊脂糖,北京全式金生物科技有限公司產品;微孔濾膜,上海半島實業有限公司產品。

1.1.3 主要儀器 隔水式恒溫培養箱(GNP-9070),上海精宏實驗設備有限公司產品;梯度PCR儀(VeritiPro),賽默飛世爾科技公司產品;核酸電泳儀(DYY-6C),北京六一生物科技有限公司產品;凝膠成像儀(G:BOX),Syngene公司產品;微量紫外分光光度計(Nanodrop 2000),賽默飛世爾科技公司產品。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取出保存的CV20菌種于37℃水浴解凍,劃線接種于血瓊脂平板,恒溫培養箱培養24 h后取出,挑取單菌落接種于TSB液體培養基,置于恒溫搖床過夜培養。取出培養好的菌液3 000 r/min離心10 min,棄上清,取其沉淀用生理鹽水洗滌3次后按照細菌DNA提取試劑盒說明書提取DNA,用微量分光光度計測量其濃度,重復測定3次,計算取其平均值,分裝后保存于-20℃備用。紫色色桿菌模式株及其他雜菌接種于血瓊脂平板,恒溫培養箱過夜培養,挑取幾個菌落于無菌水中混勻,沸水中煮10 min,12 000 r/min離心5 min,取上清保存于-20℃備用。

1.2.2 引物設計 根據與紫色色桿菌毒力相關的Ⅲ型分泌系統(type Ⅲ secretion system,T3SS)效應因子OspC家族蛋白的基因序列(RefSeq:GCF-000007705.1,selected region:from 2221396 to 2222859)[6-7],應用Primer Premier 5.0軟件設計特異性引物,用NCBI的Blast檢驗引物特異性后,篩選出的引物上、下游序列分別為5′-ATTTCCGCCACCAGTCCAAT-3′和5′-GATCGGTCAGCGTCAGGTAG-3′,可擴增的片段長度約291 bp,引物由福州尚亞生物技術有限公司合成。

1.2.3 PCR反應條件優化 根據Promega的GoTaq?Green master mix使用說明,初步建立PCR反應體系:2×GoTaq?Green master mix 12.5 μL,上、下引物(10 μmol/L)各1 μL,DNA模板1 μL,加無核酸酶水至25 μL。在冰盒上將該反應體系各成分加入到離心管中并混勻。

反應程序:95℃ 5 min;95℃ 30 s,退火溫度50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60.0℃、62℃、64℃、66℃,9個梯度30 s,72℃延伸40 s,循環次數設25、30、35、40、45次5個梯度;最后72℃延伸10 min,4℃保存結束反應。

反應結束后,取5 μL PCR擴增產物用添加了核酸染料的1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測,DNA Marker DL 2 000作為對照,120 V電壓下電泳20 min,凝膠成像系統下紫外觀察,并拍照保存。

1.2.4 特異性試驗 紫色色桿菌模式株ATCC 12472作為陽性對照,無核酸酶水作為陰性對照,以小熊貓飼養場所和從死亡小熊貓體內分離到的醋酸鈣不動桿菌、糞腸球菌、停乳鏈球菌、葡萄球菌、奇異變形桿菌、大腸埃希氏菌、魏斯氏乳酸菌、嗜水氣單胞菌、霍氏腸桿菌、微小桿菌、吉氏庫特菌、蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌這13株菌作為特異性對照,在之前已建立的最佳反應體系下,對小熊貓紫色色桿菌CV20進行特異性檢測。

1.2.5 靈敏度及其重復性 將CV20的DNA樣本用無菌水進行10倍梯度稀釋(10-1～10-10),稀釋好的DNA溶液保存在-20℃備用。用無核酸酶水作為陰性對照,在已建立的最佳反應程序下,對不同濃度的DNA樣本進行PCR擴增,1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,檢驗引物的靈敏度。根據靈敏度試驗所能檢測到的最低樣本濃度稀釋10份CV20樣品,在最佳反應程序下進行PCR擴增,1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,觀察靈敏度在最低檢測濃度下是否穩定。

1.2.6 環境樣本檢測 采集小熊貓獸舍內部3處水源和3個排水口的水樣,在獸舍外圍隨機選取4處采集土壤樣品,這10處采集的樣品分別使用兩種不同的方法進行檢測,即分離培養法和直接PCR檢測法。

①分離培養法:每份水樣取100 mL加入80 μL滅菌后的10%硫代硫酸鈉溶液[8],以中和水樣中可能存在的氯氣及其他氧化性殺菌劑;每份土壤樣品取10 g,加入到90 mL無菌水中混勻,將其懸浮液吸出。處理后的水樣和土壤懸浮液均以倍比稀釋法進行梯度稀釋,取3個適宜濃度的稀釋液,各吸取100 μL均勻涂布于血瓊脂平板上,重復兩次。于恒溫培養箱過夜培養后,挑取平板上形態類似紫色色桿菌及其無色株的單菌落進行分離純化。純化后的菌株以1.2.1中水煮法提取模板進行PCR擴增,紫色色桿菌模式株作為陽性對照,無核酸酶水作陰性對照,電泳檢測。同時對分離純化的菌落作革蘭氏染色鏡檢和生化試驗鑒定,判定其結果。

②直接PCR檢測法:用0.45 μm濾膜過濾水樣,之后用無菌鑷子取下濾膜,剪碎放入離心管中,按照水體DNA小提試劑盒的說明書提取DNA;土壤樣品按照土壤DNA小提試劑盒說明書提取DNA。提取的DNA樣品根據已建立的PCR體系進行擴增和電泳檢測。

1.2.7 病料檢驗 取保存于-70℃的2020年因紫色色桿菌病死亡的小熊貓病料,剪取部分組織樣品,加入生理鹽水充分勻漿,按照細菌DNA提取試劑盒說明書從組織樣品中提取細菌DNA,以優化后的條件對其進行PCR擴增和凝膠電泳檢測。

2 結果

2.1 PCR擴增的優化結果

以相同的DNA樣本為模板,設定退火溫度在50～66℃之間,重復試驗3次(圖1),50～62℃條帶均較為明亮,最終選取58℃為最佳退火溫度。在最佳退火溫度條件下,分別進行25、30、35、40、45個循環的PCR擴增,重復試驗3次。從圖2可以看出,5個循環次數時均可擴增出明亮的條帶,而以40和45個循環時擴增出的條帶最為清晰,為減少非特異性條帶的產生,本試驗選取次數較少的40個循環設定為PCR反應的最佳循環參數。最終確定反應程序為:95℃ 5 min;95℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 40 s,40個循環;72℃延伸10 min。

M.DNA 標準DL 2 000;1.50℃;2.52℃;3.54℃;4.56℃;5.58℃;6.60℃;7.62℃;8.64℃;9.66℃

2.2 特異性試驗結果

13個非目標菌株和陰性對照均未擴增出條帶,僅有CV20和紫色色桿菌模式株可擴增出清晰明亮的條帶,大小與預期(291 bp)相符(圖3),用膠回收試劑盒回收該PCR產物,并送至鉑尚生物技術有限公司測序,結果在GenBank上Blast確定為紫色色桿菌,由此可見該引物對小熊貓紫色色桿菌的特異性較強。

M.DNA標準DL 2 000;1.紫色色桿菌菌株;P.陽性對照;N.陰性對照;2.醋酸鈣不動桿菌;3.糞腸球菌;4.停乳鏈球菌;5.金黃色葡萄球菌;6.奇異變形桿菌;7.大腸埃希氏菌;8.魏斯氏乳酸菌;9.嗜水氣單胞菌;10.霍氏腸桿菌;11.微小桿菌;12.吉氏庫特菌;13.蠟樣芽孢桿菌;14.蘇云金芽孢桿菌

2.3 靈敏度及重復性試驗結果

用微量紫外分光光度計對CV20的DNA樣本濃度進行檢測,重復測定3次,其濃度均值為98.4 ng/μL,在已優化的PCR反應條件下,用其進行引物的靈敏度試驗。從圖4可以看出,陽性樣品從100到10-5稀釋均可擴增出條帶,且條帶亮度依次減弱,10-5稀釋下條帶最弱,而陰性對照無目的條帶。因此可知所建立的PCR檢測方法,其靈敏度可達到10-5的模板稀釋度,對應于原檢測樣本的濃度為98.4 ng/μL,所以該PCR方法的檢測靈敏度為0.98 pg/μL。

因本試驗建立的PCR檢測方法最低檢測濃度為10-5,且條帶較弱,為驗證其可靠性,取10份CV20的DNA樣品稀釋到該濃度作為模板,進行最低檢測濃度的重復性試驗。由圖5可見,泳道1～10均可見目的條帶,說明該PCR方法重復性良好,其最低檢測濃度重復率為100%。

2.4 環境樣本的檢測

小熊貓飼養場所水源、排水口的水樣及獸舍外土壤樣本,經處理后分離培養出的菌株進行PCR檢測篩查,結果均為陰性,與革蘭氏染色和生化鑒定結果一致(圖6)。另一份水樣和土壤樣本直接進行DNA提取和PCR檢測(圖7),在獸舍外土壤樣品中擴增出了條帶,大小與目的條帶一致,經切膠回收和送樣測序后,得到的序列經比對為紫色色桿菌。

M.DNA標準DL 2 000;N.陰性對照;P.陽性對照;1～12.水樣分離菌;13～18.土壤樣品分離菌

2.5 小熊貓病料的PCR檢驗

因保存時間較久,3份病料已無法分離出紫色色桿菌,但提取病料DNA后,均可檢測到條帶,大小和目的條帶一致,經切膠回收和送樣測序,比對結果顯示均為紫色色桿菌(圖8)。

3 討論

本文所建立的PCR檢測方法特異性較強,能準確的擴增紫色色桿菌,與其他常見菌無反應,對目的菌株的最低檢測濃度為0.98 pg/μL。本文建立的PCR檢測方法可特異性檢測小熊貓紫色色桿菌,對小熊貓紫色色桿菌的早期診斷具有重要意義。紫色色桿菌是環境常見菌,多存在于熱帶和亞熱帶地區的水和土壤中,且其無色變種與大腸埃希氏菌等常見菌形態相似,傳統的分離培養方式較難分辨,多起群體事件表明,紫色色桿菌多通過傷口感染到圈養小熊貓種群,且小熊貓毛發濃密,外傷不易發現,亟需快速準確的早期診斷方法。對于紫色色桿菌病的診斷,臨床上常用的實驗室診斷方法多為采集血液、尿液或病灶處膿液等進行致病菌的分離培養和生化鑒定[9-12],操作繁瑣且檢測時間較長,不能快速檢測出致病菌;通過穿刺病灶進行分離培養,以通用引物對16S rRNA區域進行測序證實紫色色桿菌,需要時間較長[13];NGS技術不用經過分離培養就可直接測定病原微生物的核酸序列[14],但與PCR技術相比需要更專業的設備和對大量數據的深入分析,成本高不易普及。

本文對2020年保存的小熊貓病料進行了DNA提取和PCR檢測,全程只需要數小時就可得到檢測結果,如有疑似紫色色桿菌病時,可采集小熊貓的分泌物或血液等樣本,用細菌DNA試劑盒從組織/液體樣品中提取細菌DNA進行PCR檢測,即可進行臨床病例的快速診斷,及時采取有效防控措施。因2020年群體感染事件暴發后,海峽(福州)大熊貓研究交流中心對小熊貓獸舍內的不流動水池進行了硬化處理,清除了積水,并進行了全面消毒,加強了飼養管理,此次試驗中采集了小熊貓現有飼養環境中的水樣和獸舍外土壤樣品,經分離培養后用該PCR方法對其進行測定,且與常規生化鑒定方法進行了對比,均未檢測到紫色色桿菌;但以水體DNA小提試劑盒和土壤DNA小提試劑盒直接從水樣和土壤樣品中提取DNA后,從獸舍外土壤樣品擴增出了條帶,測序鑒定為紫色色桿菌,但此份樣品中無法分離出紫色色桿菌,可能是因為檢測出的是死亡的紫色色桿菌,或因此時氣溫較低,紫色色桿菌處于活的非可培養狀態(viable but non-culturable state,VBNC),以平板培養法無法進行分離培養,待條件適宜時,可能會復蘇具有一定的致病性,在小熊貓個體出現創傷或免疫力低下時,仍有可能對其造成威脅。