6株禽源滑液囊支原體分離株的分子生物學鑒定及MSPB蛋白原核表達

孫佳琳,司朵朵,王建東,李繼東,李生虎,何生虎*

(1.寧夏大學動物科技學院,寧夏銀川 750021;2.寧夏農林科學院動物科學研究所,寧夏銀川 750002;3.寧夏職業技術學院,寧夏銀川 750000)

支原體屬于柔膜綱,缺少細胞壁,現已發現120余種支原體,其中有20種的宿主是禽類和鳥類,其禽滑液囊支原體(Mycoplasmasynoviae,MS)是重要的禽類病原體之一,能引起家禽呼吸道疾病,滑膜炎和氣囊炎[1]。盡管MS的基因組和蛋白質組較小,但可保留在高度進化的宿主中并引起慢性感染,這與其膜蛋白與宿主的相互作用密不可分,其中一些蛋白能黏附宿主細胞,是宿主免疫反應的主要靶標[2]。

MS蛋白質組的主要蛋白質是參與新陳代謝和蛋白質加工,如磷酸丙酮酸水合酶,伴侶蛋白(DnaK和觸發器因子,伸長因子(EF-Tu/EF-G)以及脂蛋白[3]。對MS的分泌蛋白進行分析,發現了包含6-磷酸果糖激酶和轉錄延伸因子GreA在內的8種未鑒定過的分泌蛋白[4]。有研究對ULB 02/P4和ULB 02/OV6株的免疫原性蛋白進行鑒定,得出N-末端測序鑒定出17個滑液囊支原體蛋白,其中有14種是以前未鑒定的主要的高表達蛋白質,包括一些酶,伴侶蛋白和推定的脂蛋白[5]。其中鑒定出的vlhA基因,在翻譯后裂解產生一個氨基末端部分(MSPB)和一個羧基末端部(MSPA),兩種產物都是抗原可變,但只有MSPA能介導MS與紅細胞的結合[6]。MSPB富含編碼PRR的串聯重復序列,且不同菌株的MSPB蛋白的分子質量大小不同,可以誘導雞巨噬細胞產生NO、IL-6和IL-1 β[7]。有研究對比了以MS-H MSPB與WVU-MSPB為研究對象,對其反應原性進行測定,發現MS-H MSPB具有抗原變異性,在檢測針對MS-H疫苗株的抗體時比WVU-MSPB 更為敏感[8]。本研究對6株MS分離株進行同源性分析,分析MS分離株與相關滑液囊支原體參考株的親緣關系;MSPB基因測序后,對其蛋白序列進行生物信息學分析,對MSPB進行功能預測;隨后,對MSPB進行表達,鑒定其反應原性。為禽滑液囊支原體感染的診斷和治療提供靶標蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體和主要試劑 NX-3、NX-4,NX-5、NX-6 、NX-7、NX-10 滑液囊支原體菌株,來自寧夏不同雞場疑似MS感染雞,NX-10株來自陜西省某雞場疑似MS感染雞,MS菌株經寧夏大學動物科技學院臨床獸醫實驗室分離培養,并進行細菌學鑒定和動物感染試驗,表明病原特性穩定。

1.1.2 主要試劑 原核表達載體pET-30a(+)質粒由寧夏大學動物科技學院臨床獸醫實驗室保存;大腸埃希氏菌BL21(DE3)、細菌基因組 DNA 抽提試劑盒、PCR 相關反應試劑,均為天根生化科技(北京)有限公司產品;電泳試劑,北京索萊寶科技有限公司產品;改良Frey培養基,北京中海生物科技有限公司產品;核酸內切酶和T4 DNA連接酶,美國NEB公司產品;DNA聚合酶、蛋白電泳所需溶液及PBS緩沖液,均為上海索萊寶生物科技有限公司產品; MS陽性血清抗體從MS感染病雞采集分離,經ELISA試劑盒檢測鑒定并保存;辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗雞IgG,生工生物工程(上海)股份有限公司產品;蛋白純化試劑盒,康為世紀生物科技有限公司產品;BCA定量試劑盒,賽默飛世爾科技有限公司產品;AEC顯色試劑盒和PVDF膜,上海索萊寶生物科技有限公司產品。

1.1.3 儀器 高速冷凍離心機,德國Beckman公司產品;PCR儀,杭州博日公司產品;電泳儀,北京六一生物科技有限公司產品;全自動凝膠成像系統,美國UVI公司產品。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據MS 1853WVU參考株16S rRNA以及寧夏本地株的MSPB基因序列,用引物設計軟件Primer 5設計PCR引物,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 引物序列

1.2.2 MS的培養 將凍存的菌液經0.22 μm的無菌濾膜過濾除去雜菌、再接入改良Frey液體培養基中,37℃搖床振蕩培養1周后進行基因組提取。

1.2.3 MS基因組的提取 分別取MS菌液3 mL,12 000 r/min離心1 min,棄上清,取沉淀用細菌基因組試劑盒提取目的基因組,-20℃凍存備用。

1.2.4 16S rRNA和MSPB基因的PCR擴增 以提取的MS基因組DNA為模板,分別擴增16S rRNA和MSPB基因序列:16SrRNA基因PCR反應體系為:2×TaqMix 25 μL,上、下游引物各1 μL(10 mmol/L),DNA模板3 μL,dd H2O 20 μL。16SrRNA基因PCR反應條件:95℃ 2 min;95℃ 30 s,49℃ 20 s,72℃ 2 min,30個循環;72℃ 8 mim。

MSPB基因各片段序列PCR反應體系均為:Prime STAR HS DNA Polymerase 0.5 μL,5×Prime STAR buffer 10 μL,上、下游引物各1 μL(10 mmol/L),dNTPS mixture 4 μL ,DNA模板2 μL,dd H2O 32.5 μL。MSPB基因全長序列PCR反應體系為:Prime STAR HS DNA Polymerase 0.5 μL,5×Prime STAR buffer 10 μL,上、下游引物各1 μL(10 mmol/L),dNTPS mixture 4 μL ,DNA模板:片段12 μL、片段24 μL、片段32 μL、片段43 μL,dd H2O 32.5 μL。MSPB基因PCR反應條件:95℃ 2 min;95℃ 30 s,56℃ 20 s,72℃ 2 min,30個循環;72℃ 8 min。PCR產物送北京中美泰和生物技術公司測序。

1.2.5 分子進化樹構建 從NCBI上獲取滑液囊支原體標準株及其他支原體的16SrRNA基因序列,用MEGA7.0軟件中的鄰接法(neighbor-joining,NJ)程序構建系統進化樹。將6株MS的16SrRNA基因序列利用進行Blast在線比對,然后選取序列一致性較高部分禽類或鳥類易感的支原體16SrRNA基因序列,按照上述方法構建分子進化樹,進行遺傳進化分析。

1.2.6 MSPB功能預測分析 將測序所得的MSPB序列用軟件DNA Star分析氨基酸序列的氨基酸組成、疏水性等理化性質;用NetPhos3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)在線進行磷酸化位點的預測分析;用EMBOSS中Octanol、Tmap軟件對其疏水區、跨膜區進行分析;用SignalP-5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對該蛋白的信號肽進行預測;用PSORTb(https://www.psort.org/psortb/)對其亞細胞定位進行預測;用NetNGlyc 1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/)對其潛在糖基化位點進行分析。

1.2.7 MSPB重組蛋白的原核表達 通過PCR技術擴增MSPB基因,并突變其中的TGA密碼子以適應大腸埃希氏菌表達系統的密碼子使用規律。將目的基因克隆至原核表達載體pET-30a(+),構建重組質粒,導入大腸埃希氏菌表達菌株BL21(DE3)中進行誘導表達和鑒定。誘導表達過程,首先采用1、0.8、0.5 mmol/L的IPTG后,再用合適濃度的IPTG進行后續試驗

1.2.8 重組蛋白的純化及鑒定 用含有0.1 mmol/L的PMSF的裂解酶對菌體進行裂解,低溫高速離心后,棄上清,收集沉淀,超聲破碎,待包涵體釋放蛋白后,再用鎳柱純化系統對MS MSPB重組蛋白進行純化。純化產物進行Western blot分析(一抗采自MS陽性雞血清,二抗為Abbkine公司的HRP,Goat Anti-Chicken IgG),檢測其與MS特異性抗體的反應性。

2 結果

2.1 16S rRNA序列PCR 擴增結果

以6株MS分離株基因組DNA為模板,以16SrRNA的引物進行PCR擴增,核酸凝膠結果顯示產物大小為1 479 bp(圖1),和預期相符。

M.DNA標準DL 2 000;1.NX-3; 2.NX-4; 3.NX-5; 4.NX-6; 5.NX-7; 6.NX-10; 7.對照

2.2 MSPB序列PCR擴增結果

用 TaKaRa的高保真酶擴增獲得含突變點的MSPB基因片段,分別擴增出與預期大小959、93、334、102 bp相一致的4條片段(圖2)。將最終產物回收后得到與預期大小1 419 bp相一致的片段(圖3)。送上海生工生物工程技術服務有限公司測序,結果顯示測序正確,并且各個點突變也均正確。

A.各區段PCR結果; M.DNA標準DL 2 000; 1.MSPB-F1/MSPB-R1引物擴增產物; 2.MSPB-F2/MSPB-R2引物擴增產物; 3.MSPB-F3/MSPB-R3引物擴增產物;4.MSPB-F4/MSPB-R4引物擴增產物。 B.Overlap PCR擴增結果;M.DNA標準DL 2 000;1.PCR產物

圖3 16S rRNA系統進化樹

2.3 分子進化樹構建結果

以16SrRNA基因序列構建的分子進化樹顯示(圖3), NX-3、NX-4、NX-5、NX-6、NX-7、NX-10屬于同一亞群位于同一分支上,與MS標準株同在一大分支上,屬于同一群,親緣關系較近,與參考株WVU 1853及改造后的疫苗株MS-H親緣較遠。

2.4 MSPB序列分析結果

根據結果可知MSPB共有466個氨基酸,其中強堿性氨基酸47個,占10.09%;強酸性氨基酸62個,占13.30%;疏水性氨基酸168個,占36.05%,極性氨基酸133個,占36.05%。分子質量大小約為50 ku,等電點為4.739。MSPB含有的Thr磷酸化位點最多,大約23個,其次是ser磷酸化位點,大約16個,Tyr磷酸化位點最少,為4個(圖4)。對其信號肽分析結果可知,預測在MSPB N端含有一段含25個氨基酸脂蛋白信號肽(Sec/SPII)序列(圖5),概率為0.9711。MSPB糖基化位點分析,得到T36、T73、T359、T361可能為糖基化位點(圖6)。MSPB亞細胞定位及跨膜螺旋區分析顯示,MSPB無跨膜螺旋區域,定位在細胞內膜上。

圖4 磷酸化位點分析

圖5 信號肽分析

圖6 糖基化位點分析

2.5 重組表達質粒pET30a-MSPB鑒定結果

重組質粒菌落PCR法鑒定,以培養過夜的菌液基因組為模板,能擴增出一條與符合大小的條帶(圖7),初步對菌落進行了篩選。對鑒定陽性的菌落培養后提取質粒,并進行雙酶切鑒定,經核酸電泳分析為陽性并測序正確的命名為pET30a-MSPB(圖8)。

M.DNA標準DL 2 000;1～6.不同標號的菌液PCR鑒定結果

2.6 MSPB重組蛋白純化及Western blot鑒定結果

1、0.8、0.5 mmol/L的IPTG對MSPB蛋白的表達量影響不大(圖9),用0.5 mmol/L的IPTG進行后續試驗(圖10)。通過對表達的MSPB重組蛋白進行分離純化,得到一條大小約為70 ku的蛋白(圖11)。純化后MSPB蛋白經轉膜、一抗、二抗雜交后,避光顯色。結果顯示MSPB重組蛋白能與一抗發生特異性結合(圖12)。

M.蛋白分子質量標準;1～6.分別為1、0.8、0.5、0.3、0.1 mmol/L的IPTG誘導表達產物;6.空白對照

3 討論

禽滑液囊支原體感染后無法治愈,且我國近幾年感染率逐年攀升,所以免疫接種是禽滑液囊支原體病的主要防控措施。要研制高效疫苗,必須弄清其流行菌株的血清型或主要保護性抗原蛋白的基因類型。MSPB是滑液囊支原體主要的免疫原性膜蛋白,并且不同菌株的MSPB針對不同菌株感染的陽性血清的敏感性不一樣[9]。因此對滑液囊支原體本地株外膜蛋白MSPB結構功能分析以及免疫原性進行研究,可進一步增加針對該病原體免疫診斷和疫苗候選抗原的認識。

基于16SrRNA基因序列所構建的分子進化樹表明,6株病原分離株與數據庫中登錄的MS菌株親緣關系較近,具有同源性,因此可以從分子水平確定6株分離菌株為MS菌株。對MSPB蛋白序列的生物信息學分析表明,MS的MSPB屬于酸性蛋白質,富含磷酸化位點,其中Ser磷酸化位點最多,Tyr磷酸化位點最少,含有一個Sec/SpⅡ信號肽和四個潛在性糖基化位點定位于膜上,與MSPB是MS的一個膜蛋白這一結果相符合;以默認的閾值(0.4)對其進行保護性抗原預測,得分為0.764 8,這些均與MSPB作為主要膜抗原且具有免疫原性的性質相吻合[10]。成功表達出MSPB重組蛋白,但實際表達出來的大小較預測大,為約70 ku。導致重組蛋白實際大小與預測大小有出入的原因很多,如重組蛋白是否需要剪切活化,剪切活化造成蛋白變小;蛋白質形成二聚體或多聚體以及蛋白質表達后有修飾也會導致蛋白質增大;除上述原因外,SDS-PAGE時蛋白的凈電荷也會影響遷移率,如富含酸性氨基酸在電泳液的pH下帶正電荷,SDS不能消除正電荷的影響,阻礙蛋白的泳動;以及富含脯氨酸的蛋白會在SDS-PAGE膠中移動得特別慢,兩者均會使蛋白質變大。但因本試驗使用原核表達系統,上述前三種情況存在的可能性很小,并且經查驗在該蛋白序列中,酸性氨基酸約占總氨基酸的13.3%,堿性氨基酸較酸性氨基酸少,約占10.3%,等電點為4.8;所以猜測蛋白質變大可能是由于富含脯氨酸造成的,并且MSPB重組蛋白其中一段富含脯氨酸,這與其他研究給出的MSPB是包含一段富含脯氨酸的蛋白質結論一致,并且這種差異,可能解釋了表觀分子質量和預測分子質量之間的差異[11-12]。此外,研究使用SDS-PAGE凝膠電泳和免疫印跡成功地對MSPB的性質進行了測定,與MSPB是滑液囊支原體最具抗原性的區域特異性表面蛋白之一理論相符[11-12]。本研究對MS分離株進行了分子水平的鑒定,并分析了重要膜蛋白MSPB,同時預測MS編碼的主要膜抗原相關功能,并對其進行鑒定,為地方MS ELISA檢測抗原的制備提供了參考。