4株不同基因型新城疫病毒毒力測定及與商品疫苗株抗原性比較

黃青紅,華 俊,謝麗基,謝芝勛,曾婷婷,李 孟,羅思思,李 丹,謝志勤

(1.廣西大學動物科學技術學院,廣西南寧 530001;2.廣西壯族自治區獸醫研究所農業農村部中國(廣西)-東盟跨境動物疫病防控重點實驗室,廣西獸醫生物技術重點實驗室,廣西南寧 530001)

我國常用的新城疫(Newcastle disease virus,NDV)商品疫苗毒為基因Ⅱ型La Sota株和基因Ⅶ型重組毒株A-Ⅶ。商品疫苗可降低ND的發病率,但無法控制NDV毒株的復制[1-3]。隨著NDV不同基因型的發現,需要對NDV疫苗株的預防能力進行重新評估[4-7]。疫苗保護力與抗原同源性有關。為了研究不同基因型NDV疫苗及與現有商品疫苗株之間的抗原性差異,本研究從廣西活禽市場、野鳥和病禽分離到數十株不同基因型NDV,包括基因Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅻ型。用4種不同基因型NDV代表毒株制作成油乳苗和2種商品油乳苗分別免疫SPF雞,采血收集單因子血清,進行HI交叉試驗和細胞交叉中和試驗,分析抗原性差異,為后續篩選NDV疫苗株提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株及疫苗 基因Ⅵ型NDV B27、基因Ⅶ型NDV B9、基因Ⅸ型NDV B14、基因Ⅻ型NDV GX01由廣西獸醫生物技術重點實驗室分離純化,分別來自鴿、雞、鵝、鷓鴣;La Sota毒株購自中國獸醫藥品監察所,未獲得重組毒株A-Ⅶ活病毒;La Sota滅活抗原和商品疫苗La Sota滅活油乳苗購自法國詩華動物保健公司;重組毒株A-Ⅶ滅活油乳苗和A-Ⅶ滅活抗原購自乾元浩生物股份有限公司。

1.1.2 雞胚及試驗用動物 SPF雞胚購自北京梅里亞公司;自行孵化至9～10日齡SPF雞胚和雛雞,雛雞孵化后于隔離器中飼養。

1.1.3 主要試劑和儀器 Tween-80,上海高維化學有限責任公司產品;Span-80,上海生工生物工程股份有限公司產品;白油,中國石化集團杭州煉油廠產品;β-丙內酯病毒滅活劑,寶柏(香港)貿易有限公司產品;DF-1細胞,由廣西獸醫生物技術重點實驗室保存;胎牛血清和DMEM/F12細胞培養液,Gibco公司產品;抗生素和胰酶,碧云天試劑公司產品;ATS高壓均質機,上海ATS工業系統有限公司產品;負壓SPF雞隔離器,江蘇馮氏動物設備有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 4株不同基因型NDV毒株的致病指數測定 參照文獻[8]推薦的方法,進行1日齡雛雞腦內注射致病指數(ICPI)和最小致死量致死雞胚的平均時間(MDT)的測定。

1.2.1.1 ICPI測定 用無菌生理鹽水對分離提純化后的新鮮尿囊液(滴度大于1/16,不超過1～2 d,細菌檢測為陰性)進行10倍稀釋;腦內接種10只剛出殼24～40 h的SPF雛雞,每只0.05 mL;每天1次,總共觀察8 d,每天觀察并給雞打分,無異常雞記0分,發病雞記1分,死雞記2分(雞死后每天仍記2分)。ICPI是每只雞8 d內觀察數值的平均數。計算公式ICPI=(8 d累計發病數×1+8 d累計死亡數×2)/8 d累計觀察雞的總數。1.6

1.2.1.2 MDT測定 用無菌生理鹽水連續10倍稀釋新鮮尿囊液至10-6～10-9共4個濃度梯度,每個梯度接種5枚雞胚,每枚接種0.1 mL,置于37℃恒溫培養;每日照蛋2次,連續觀察1周,并記錄雞胚死亡時間;MDT指最小致死量引起所有雞胚死亡的平均時間;計算公式MDT=(X胚死亡時間×X小時死亡胚數+Y胚死亡時間×Y小時死亡胚數+ ……)/死亡總雞胚,X、Y單位為小時(h)。40 h

1.2.2 4種不同基因型NDV油乳苗制備及免疫后抗體檢測

1.2.2.1 油乳疫苗的制備 先把毒株的病毒濃度調整為HA滴度28;按照1∶2 000加入β-丙內酯滅活病毒,置4℃作用48 h;滅活完成后37℃作用2 h使β-丙內酯水解。滅活病毒連續接種雞胚驗證滅活效果,每個毒株接種5枚雞胚,0.2 mL/枚;37℃孵育并每天照胚觀察,連續觀察4 d。如不死胚,則收取尿囊液檢測HA和繼續傳代。連續傳代3次不死胚及HA滴度為0則證明滅活成功;參照文獻[9],試驗使用油相∶水相為4∶1,乳化劑是油相的1/10,Span-80與Tween-80的體積配比為3∶1,親水親油平衡值為7;每個毒株油乳疫苗制備量為100 mL。配置之前,先將白油、Span-80和Tween-80高壓滅菌;然后分別配置水相和油相。水相配置方法為:按配比將滅活后的尿囊液與Tween-80混合;油相配置方法為:將白油與Span-80混為油相;最后用均質器把油相與水相進行3次切割混合。

1.2.2.2 分組與免疫 將雞分成7組,分別編號為1～7組,第1組疫苗用Ⅵ型NDV B27,第2組疫苗用Ⅶ型NDV B9,第3組疫苗用Ⅸ型NDV B14,第4組疫苗用Ⅻ型NDV GX01,第5號組疫苗用Ⅱ型NDV La Sota,第6組疫苗用Ⅱ型NDV重組毒株疫苗A-Ⅶ,第7組為PBS替代病毒液制成油乳苗對照,所有組SPF雞分別在4周齡和6周齡頸部皮下各免疫1次,每次0.3 mL。第1～4組為試驗組,第5～6組為商品疫苗組,第7組為空白對照組。

1.2.2.3 抗體監測 SPF雞從第4周開始每周無菌采集翅靜脈血,靜置血液待凝固析出血清后,抽取上層血清,即得到6個NDV毒株的單因子陽性血清,于-20℃保存。參照文獻[8]的方法進行抗原檢測,根據HA試驗結果配置4單位病毒;再將4單位病毒與本試驗采集的單因子陽性血清進行HI試驗,以被檢血清出現完全不凝集的血清最高稀釋度為血清HI效價。

1.2.3 4株不同基因型NDV分離株和疫苗株的抗原性分析

1.2.3.1 HI交叉抑制試驗 參照文獻[10],把6種四單位病毒分別與6種單因子陽性血清進行交叉HI試驗,重復做5個平行試驗,最后取平均值;同時設對照,即SPF雞陰性血清對照組。HI抗原同源性用抗原相關系數R表示,計算方法參照文獻[11]進行,計算公式為R=(r1×r2)-1/2×100%(r1=異源血清效價1/同源血清效價1,r2=異源血清效價2/同源血清效價2)。R的結果判定:0.67≤R≤1.5,抗原性差異不大;0.5≤R≤0.67,抗原差異微小;R<0.5,抗原性存在較大差異。

1.2.3.2 細胞中和試驗 ①DF-1單層細胞的制備。將DF-1單層細胞在培養瓶中培養至密度達到100%時,用胰酶消化直到細胞與培養瓶壁分離,再加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養液終止消化。輕柔吹打混勻后加入15 mL離心管,4 000 r/min離心1 min后棄去上清液。加入10%胎牛血清的DMEM/F12培養液重懸細胞,分裝到48孔細胞培養板每孔0.3 mL。每天觀察2次,細胞生長至鋪滿培養板底部95%～100%時用于TCID50和細胞交叉中和試驗。②細胞半數感染量(TCID50)測定。取5個毒株新鮮病毒液(由于未獲得A-Ⅶ活病毒,故TCID50和細胞交叉中和試驗用5個毒株),分別連續10倍稀釋,取10-1～10-8共8個稀釋度。再分別接種細胞,由最高稀釋度開始,每稀釋度接種48孔細胞板的5孔,每孔0.05 mL。于37℃培養箱中作用60 min。作用完畢后,再加DMEM/F12維持液,每孔0.25 mL,培養5 d后觀察細胞病變,并測定HA效價,計算各稀釋度HA效價≥2log2的百分率。按Reed和Mchen法計算TCID50,距離比=(高于50%病變的百分數-50%)/(高于50%病變率百分數-低于50%病變率的百分數),lgTCID50=高于50%血清稀釋度的對數+距離比例×稀釋系數的對數。

③細胞交叉中和試驗。本試驗采用的是固定病毒稀釋血清的方法。操作方法如下:將病毒稀釋成每0.05 mL含200 TCID50;將待測血清等量稀釋成1∶2,1∶4,1∶8,1∶16,1∶32,1∶64;1∶128;1∶256共8個稀釋度,再將待檢血清和病毒懸液等量混合,37℃孵育60 min;每稀釋度血清和病毒混合接種48孔板5孔,同時設置SPF雞血清對照、空白細胞對照各5孔。最后每孔添加維持液0.2 mL,CO2培養箱37℃培養5 d,每天觀察2次CPE,8 d后測定HA效價,計算各稀釋度HA效價≥2log2的百分率。按Reed和Mchen法計算半數保護量能使半數細胞孔保護的最高血清稀釋度即為該血清的中和效價。

2 結果

2.1 病毒致病指數測定結果

結果顯示,基因Ⅵ型NDV B27 MDT為60～90 h,ICPI為0.6～1.5,屬于中等毒力毒株。基因Ⅶ型NDV B9、Ⅸ型NDVB 14、Ⅻ型NDV GX01 MDT為40～60 h,ICPI為1.6～2.0(表1),屬于強毒株。

表1 4株NDV的致病指數測定結果

2.2 病毒滅活及油乳苗制備

病毒經滅活后接種雞胚,雞胚孵育4 d未死亡,檢測尿囊液HA效價為0。連續傳代2代雞胚仍不死亡,檢測尿囊液HA效價為0。病毒滅活成功,可進行下一步油乳苗制備。制備完成的油乳苗用血平板檢測細菌,無細菌生長。

2.3 抗體檢測結果

隨著免疫后時間延長,每組雞抗體水平逐漸上升,但上升幅度不同。免疫后第5周,免疫Ⅵ-B27、Ⅻ-GX01、Ⅱ-LaSoTa、Ⅶ-A-Ⅶ組抗體水平均值達到28以上,而免疫Ⅶ-B9和Ⅸ-B14組抗體水平均為24～25(表2)。

表2 免疫SPF雞抗體監測結果[平均值(log2)]

2.4 HI交叉試驗結果和HI抗原同源性

6株NDV HI交叉試驗平均結果見表3,根據公式計算出抗原同源性(表4)。根據HI交叉試驗結果顯示,不同毒株之間的抗原同源性除基因Ⅵ型的B27和基因Ⅸ型的B14為0.64,抗原差異微小,其他毒株抗原同源性為0.69～0.99,抗原性差異不大。

表3 不同毒株之間的HI交叉試驗結果(log2)

表4 不同NDV毒株間的HI同源性

2.5 細胞交叉中和試驗

5個毒株的TCID50見表5,計算5個毒株之間血清的中和效價后,再計算細胞交叉中和的抗原同源性(表6和表7),5個毒株的抗原同源性為0.42～0.79。其中基因Ⅵ型NDV B27與基因Ⅸ型NDV B14的抗原同源性為0.42,基因Ⅵ型NDV B27與基因Ⅱ型NDV La Sota的抗原同源性為0.47,抗原相關性存在較大差異;基因Ⅶ型NDV B9與基因Ⅸ型NDV B14的抗原相關性為0.68,基因Ⅸ型NDV B14與基因Ⅱ型NDV La Sota的抗原同源性為0.79,抗原相關性差異不大;其余抗原相關性存在微小差異。

表5 5株NDV的TCID50

表6 不同NDV毒株之間的細胞中和試驗的中和指數

表7 不同NDV的毒株之間的細胞交叉中和抗原同源性

3 討論

不同NDV毒株之間的毒力強弱不一致,早期通過ICPI、MDT、IVPI等指數來確定NDV毒力,但研究發現僅憑其中一個指數去判定一個毒株的毒力不準確,需要測定2個或2個以上指數作為毒株毒力的憑據[12]。本研究測定了分離株的MDT和ICPI,結果顯示MDT與ICPI結果一致。

4個分離株制備油乳苗免疫SPF雞后第5周Ⅵ-B27、Ⅻ-GX01、La SoTa、A-Ⅶ組抗體水平均值達到28以上,而Ⅶ-B9和Ⅸ-B14組抗體水平均值為24～25。表明基因Ⅵ型B27和基因Ⅻ型GX01免疫原性較好,抗體水平和2個商品疫苗相當,而基因Ⅶ型B9和基因Ⅸ型B14的免疫原性相對較差。

4個毒株分屬不同的基因型,其中B27屬于基因Ⅵ型,分離自免疫了La Sota株的病鴿,證明La Sota株對基因Ⅵ型NDV的免疫保護能力不足。因此,即使B27對雞致病性僅為中等毒力,仍然有必要研究它和疫苗毒株的抗原性差異,以便為篩選針對鴿新城疫的疫苗株提供依據。基因Ⅻ型GX01為本實驗室從表現健康的鷓鴣分離得到,致病性試驗表明為強毒株。此基因型在我國南方地區的出現,是否會演變出對雞致病的毒株是未知數。需要對其與疫苗毒株的抗原性差異進行研究,為開發對應基因型疫苗提供參考。

近年來,由于廣泛使用基因Ⅶ重組毒株疫苗,我國的家禽新城疫發病率大大降低。而以基因Ⅵ型NDV為主的鴿新城疫日漸多發[13-14]。本研究的HI交叉試驗表明,不同基因型NDV之間以及和商品疫苗株之間,除基因Ⅵ型NDV B27和基因Ⅸ型NDV B14為0.64,抗原差異微小,其他毒株之間的抗原相關性均為0.69～0.99,抗原差異性不大。而細胞交叉中和試驗結果表明,基因Ⅵ型NDV B27和基因Ⅸ型NDV B14、基因Ⅱ型NDV La Sota疫苗株之間存在較大差異,其余基因型之間以及和基因Ⅱ型疫苗株La Sota之間存在微小差異。可能是鴿子用傳統弱毒疫苗La Sota,鴿新城疫仍然時有發生的原因。

實際生產中,HI抗體水平經常作為判定禽群ND保護力的標準。但是在近幾年這種方法受到了巨大挑戰:平均抗體水平高到滴度大于29的雞群仍然受到新城疫的危害。但由于流行株和疫苗株存在抗原差異,即使抗體達到一定水平,也不能準確預判對流行株的保護力。因此,在實際生產中,可考慮用近期流行毒株制備4單位抗原,進行HI試驗作為參考。

我國在防控新城疫方面具有復雜性,采取免疫措施為主,隔離消毒為輔,國外更傾向于直接撲殺消滅。對NDV抗原性變異的研究也刻不容緩,研制出針對性更強、保護性更好的疫苗,本研究結果為NDV疫苗株篩選提供了參考。