豬肺炎支原體和豬鼻支原體TaqMan雙重?zé)晒釶CR檢測方法的建立及應(yīng)用

周 穎,趙 碩,覃國喜,梁龍華,肖 婷,陳忠偉,盧冰霞,秦毅斌,林昌華,張勝斌,段群棚,胡庭俊*,何 穎*

(1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣西南寧 530004;2.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部中國(廣西)-東盟跨境動物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530001;3.廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)金光公司,廣西南寧 530042;4.廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)西江公司,廣西貴港 537100)

豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)是引起豬支原體肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine,MPS)的主要病原體[1]。MPS在全球范圍內(nèi)流行,該病具有地方性[2]、慢性消耗、平均日增重減少[3]、飼料轉(zhuǎn)化率差等特點(diǎn)。Mhp可以引起豬呼吸道綜合征(Porcine respiratory complex,PRDC),并引起豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒(PCV)等繼發(fā)感染[4]。豬鼻支原體(Mycoplasmahyorhinis,Mhr)是豬上呼吸道的一種常見病原體,相較于哺乳仔豬,育肥豬和種豬的檢出率更高[5]。Mhr可引起豬肺炎、關(guān)節(jié)炎、漿膜炎、結(jié)膜炎等臨床癥狀[6-7]。豬鼻支原體可加快豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)在豬體內(nèi)增殖和傳播,PCV2也可以加重豬鼻支原體感染引起的臨床癥狀和病理變化[8]。豬鼻支原體還是細(xì)胞培養(yǎng)過程中很常見的污染物,且一旦污染很難根除[9]。Mhp和Mhr的檢測主要靠病原分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測及分子水平檢測[10-11]。雖然Mhp的分離培養(yǎng)被稱為Mhp檢測的金標(biāo)準(zhǔn),但由于其培養(yǎng)條件及其苛刻、培養(yǎng)時間長且無法與Mhr分別培養(yǎng),給Mhp的分離鑒別造成了巨大挑戰(zhàn)。熒光定量PCR因其敏感度高、特異性強(qiáng)、定量精準(zhǔn)、快速等優(yōu)點(diǎn),已成為病原檢測的最優(yōu)選擇。本研究建立了一種可在1 h內(nèi)完成同時檢測Mhp和Mhr的雙重?zé)晒舛縋CR方法,給臨床Mhp和Mhr的檢測提供了方便,同時也為實(shí)驗(yàn)室鑒定Mhp提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、毒株及臨床樣品 Mhp(J株)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所邵國青老師團(tuán)隊惠贈。Mhr、雞毒支原體(Mycoplasmagallisepticum,MG)、豬流感病毒(Swine influenza virus,SIV)、 PCV2、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,APP)、副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis,HPS)、豬細(xì)小病毒病(Porcine parvovirus infection,PPI)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,SA)、大腸埃希氏菌(E.coli)及屠宰場采集的豬肺臟樣品均由廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所病毒室于-80℃保存。

1.1.2 主要試劑 大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pMD18-T Vector、2×TaqMan Fast qPCR預(yù)混液,生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品;核酸提取試劑盒(磁珠法),中元匯吉生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品;pMD-18T載體、DNA Marker DL 2 000,Takara生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒,OMEGA廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司產(chǎn)品;其他試劑均為分析純級別試劑。

1.1.3 主要儀器 EXM 3000全自動核酸提取儀,中元匯吉生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品;Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)、CFX Opus 96實(shí)時熒光定量PCR儀、T100TMThermal Cycler PCR儀,美國Bio-Rad公司產(chǎn)品;DYY-6C型電泳儀,北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品;D-37520 Osterode am Harz 臺式高速離心機(jī),德國Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針合成 根據(jù)GenBank收錄的Mhp的183基因(Mhp-183)和Mhr的p37基因(Mhr-P37)序列,應(yīng)用Primer-BLAST針對保守區(qū)設(shè)計特異性引物及探針(表1)。引物及探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品模板的制備 根據(jù)GenBank收錄的Mhp-183和Mhr-P37的基因序列,用Promer-Blast對保守區(qū)進(jìn)行普通PCR引物設(shè)計并擴(kuò)增。Mhp-183(F:5′-CGGTCATCATTGGGTGGCTA-3′ R:5′-GAAGGCAAAAATGAGGCGCA-3′),Mhr-P37(F:5′-GTAGTCAAGCAAGAGGATGT-3′ R:5′-GCGCTTCTGTCTTCATTTAG-3′)。反應(yīng)條件:94℃ 2 min;94℃ 30 s;57℃ 30 s;72℃ 1 min;30個循環(huán),72℃終延伸7 min。瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證條帶大小正確后,將產(chǎn)物膠回收進(jìn)行純化,連接pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞大腸埃希氏菌DH5α,用含氨芐平板培養(yǎng)后,挑選菌落進(jìn)行單克隆,篩選陽性重組質(zhì)粒并測序。測序正確的陽性重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品,分別命名為pMD18-T-Mhp-183(4.52×1011copies/μL)、pMD18-T-Mhr-P37(2.97×1010copies/μL),于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)條件的優(yōu)化 為篩選雙重TaqMan 熒光定量PCR最優(yōu)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,采用矩陣法優(yōu)化引物、探針終濃度,上、下游引物(10 μmol/L)各0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 μL,探針(10 μmol/L)各0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μL。用優(yōu)化好的反應(yīng)體系進(jìn)行退火溫度的優(yōu)化,退火溫度優(yōu)化范圍為55～62℃。

1.2.4TaqMan熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將pMD18-T-Mhp-183和pMD18-T-Mhr-P37分別用DEPC水做10倍梯度稀釋,選取8個稀釋度標(biāo)準(zhǔn)品為模板,每個稀釋度設(shè)置3個技術(shù)重復(fù),進(jìn)行熒光定量擴(kuò)增、分析并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 特異性試驗(yàn) 以MG、SIV、PCV2、PRRSV、APP、HPS、PPI、SA、E.coli的核酸為模板,以pMD18-T-Mhp-183和pMD18-T-Mhr-P37為陽性對照,ddH2O為陰性對照,應(yīng)用優(yōu)化后的雙重?zé)晒舛縋CR方法進(jìn)行特異性試驗(yàn)。

1.2.6 敏感性試驗(yàn) 將pMD18-T-Mhp-183和pMD18-T-Mhr-P37分別用DEPC水做10倍梯度稀釋,分別選取拷貝數(shù)為4.52×101～4.52×108copies/μL和2.97×101～2.97×108copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品為模板,ddH2O為陰性對照,應(yīng)用優(yōu)化后的雙重?zé)晒舛縋CR方法進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 分別選取pMD18-T-Mhp-183的4.52×103～4.52×107copies/μL和pMD18-T-Mhr-P37的2.97×103～2.97×107copies/μL 5個稀釋濃度標(biāo)準(zhǔn)品混合后作為模板。應(yīng)用優(yōu)化后的雙重?zé)晒舛縋CR方法進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn),每個濃度進(jìn)行3個平行試驗(yàn),進(jìn)行批間和批內(nèi)重復(fù)性分析,計算變異系數(shù)(CV),評估該方法的重復(fù)性。

1.2.8 臨床樣品檢測 用建立的雙重?zé)晒舛縋CR檢測方法和普通PCR方法對本實(shí)驗(yàn)室收集的145份豬肺臟樣本和9份支原體分離培養(yǎng)物進(jìn)行Mhp及Mhr檢測,設(shè)置pMD18-T-Mhp-183和pMD18-T-Mhr-P37為陽性對照,ddH2O為陰性對照,計算兩種方法的符合率。

2 結(jié)果

2.1 雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)條件的優(yōu)化

經(jīng)過優(yōu)化試驗(yàn),確定該方法的最優(yōu)體系(20μL)為2×TaqMan Fast qPCR預(yù)混液10 μL,Mhp-183-F(10 μmol/L)0.4 μL,Mhp-183-R(10 μmol/L)0.4 μL,Mhp-183-P(10 μmol/L)0.3 μL,Mhr-P37-F(10 μmol/L)0.4 μL,Mhr-P37-R(10 μmol/L)0.4 μL,Mhr-P37-P(10 μmol/L)0.3 μL,模板2 μL,ddH2O補(bǔ)足至20 μL。優(yōu)化后反應(yīng)條件為:94℃ 3 min;94℃ 15 s,57℃ 30 s,40個循環(huán)。

2.2 TaqMan熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將4.52×101～4.52×108copies/μL的pMD18-T-Mhp-183和2.97×101～2.97×108copies/μL的pMD18-T-Mhr-P37為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。以重組質(zhì)粒濃度對數(shù)值為橫坐標(biāo),對應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo),得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1);所得的Mhp標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.306 7,線性相關(guān)系數(shù)R2為0.999 6;Mhr標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.322 5,線性相關(guān)系數(shù)R2為0.999 4;擴(kuò)增產(chǎn)物的Ct值與濃度之間存在良好的線性關(guān)系。

A.pMD18-T-Mhp-183(4.52×101～4.52×108 copies/μL)標(biāo)準(zhǔn)曲線;B.pMD18-T-Mhr-P37(2.97×101～2.97×108 copies/μL)標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果

用本研究建立的雙重TaqMan熒光定量PCR方法對MG、SIV、PCV2、PRRSV、APP、HPS、PPI、SA、E.coli陽性樣本的核酸進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示,Mhp及Mhr核酸均出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線(圖2),其余病原核酸和陰性對照未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線,表明該方法特異性強(qiáng)。

圖2 熒光定量PCR體系特異性試驗(yàn)

2.4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示(圖3和圖4),本研究建立的方法Mhp和Mhr的最低檢出量分別為45.2 copies/μL和29.7 copies/μL,與常規(guī)PCR相比敏感性分別提高了10 000倍和1 000倍,表明該方法敏感性高。

A.熒光定量PCR的Mhp敏感性試驗(yàn),1～8. 4.52×101～4.52×108 copies/μL;9.陰性對照;B.普通PCR的Mhp敏感性試驗(yàn),1～8. 4.52×101～4.52×108 copies/μL;9.陰性對照;M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

將4.52×103～4.52×107copies/μL不同濃度的pMD18-T-Mhp-183和2.97×103～2.97×107copies/μL 不同濃度的pMD18-T-Mhr-P37混合作為模板,進(jìn)行3次批內(nèi)和批間的平行試驗(yàn),計算CV,評價該方法的重復(fù)性。結(jié)果顯示(表2),該方法所得批間和批內(nèi)試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于2%。

表2 熒光定量PCR的批內(nèi)和批間檢測結(jié)果

2.6 臨床樣本檢測結(jié)果

對145份臨床豬肺臟組織樣品和8份支原體分離培養(yǎng)物進(jìn)行Mhp和Mhr檢測。結(jié)果顯示(圖5和表3),145份臨床豬肺臟組織樣品中,共檢出Mhp陽性82份,陽性率為57%(82/145),Mhr陽性9份,陽性率為6%(9/145),其中Mhp和Mhr混合感染陽性樣品7份,共感染率為5%(7/145)。普通PCR檢出的陽性樣品,熒光PCR檢出也均為陽性,并且熒光PCR檢出率遠(yuǎn)高于普通PCR。8份支原體分離培養(yǎng)物中,有3分培養(yǎng)物同時存在Mhp和Mhr,剩余5份培養(yǎng)物均只存在Mhr。

圖5 臨床檢測樣品的熒光PCR和普通PCR結(jié)果圖

表3 熒光定量PCR檢測8份支原體分離培養(yǎng)物結(jié)果

3 討論

Mhp是規(guī)模化養(yǎng)豬中造成MPS的一個重要原因,豬群在Mhp感染時常伴隨有Mhr感染,導(dǎo)致豬群飼料轉(zhuǎn)化率低、生長遲緩、炎癥反應(yīng)和免疫抑制等,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。Mhp分離培養(yǎng)對基層獸醫(yī)單位和人員的要求較高,Mhp體外培養(yǎng)時易混入生長速度更快而成為優(yōu)勢菌株的Mhr,導(dǎo)致Mhp鑒別難度加大,分離錯誤率增高;病料運(yùn)輸、儲存及操作不當(dāng)會導(dǎo)致Mhp菌株失活;Mhp血清抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽性往往在病原自然感染宿主一段時間后才能檢出,且Mhp與Mhr之間存在一定的交叉反應(yīng),限制了血清學(xué)抗體檢測在Mhp診斷上的應(yīng)用。Mhp的核酸檢測在該病的臨床檢測診斷中起到了重要的作用,在不同診斷鑒別方法中又以熒光定量PCR靈敏性好,耗時少和特異性高而受青睞。

本研究針對Mhp-183和Mhr-P37的保守區(qū)間進(jìn)行特異性引物、探針的設(shè)計,并且探針5′端標(biāo)記的發(fā)光基團(tuán)分別選用相互影響較小的FAM和ROX信號,3′端淬滅集團(tuán)選擇BHQ,具有更高的信噪比,提高了檢測的敏感性和準(zhǔn)確性。本研究建立的方法可在1 h內(nèi)同時檢測Mhp和Mhr,最低檢測限比普通PCR方法提高了103～104倍。雙重?zé)晒舛縋CR檢測Mhp和Mhr的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到0.999 6和0.999 4,呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,表明該方法具有較高的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

本試驗(yàn)建立的方法對收集的145份臨床豬肺臟組織樣本進(jìn)行Mhp和Mhr檢測,發(fā)現(xiàn)Mhp的感染率超過50%,遠(yuǎn)高于Mhr 的陽性率,可能由于本試驗(yàn)中的臨床樣本是豬的肺臟組織,與Mhr通常在鼻拭子中的檢出率較高有關(guān)[12],Mhp和Mhr雙重感染率高對臨床上Mhp的分離培養(yǎng)是一大挑戰(zhàn)。本試驗(yàn)針對8份支原體分離培養(yǎng)物進(jìn)行了Mhp和Mhr的PCR核酸鑒定,發(fā)現(xiàn)其中3份同時含有Mhp和Mhr,下一步將及時進(jìn)行Mhp的純化,有效避免由于Mhr快速增殖成為優(yōu)勢毒株而導(dǎo)致Mhp毒株丟失,增加Mhp的分離率。

本研究建立了一種TaqMan雙重?zé)晒舛縋CR檢測方法,該方法可以對組織樣本或血液、環(huán)境等樣品進(jìn)行Mhp和Mhr的實(shí)時定量PCR檢測,該方法特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好,方便快捷,可為臨床上用于豬群Mhp的早期診斷與監(jiān)測提供可靠的技術(shù)支撐。