牛冠狀病毒TaqMan熒光定量PCR檢測方法的建立及應用

蒲 鵬,李晨露,張 琪,吳發興,許信剛*

(1.西北農林科技大學動物醫學院,陜西楊凌 712100;2.中國動物衛生與流行病學中心,山東青島 266032)

牛冠狀病毒(Bovine coronavirus,BCoV)是單股正鏈RNA病毒,屬冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus)。BCoV主要由糞-口、氣溶膠和呼吸道飛沫傳播,通過呼吸道和胃腸道感染不同年齡牛,導致嚴重的犢牛腹瀉,成年牛冬季下痢[1-2]。成年牛中該病毒與其他呼吸道病原體合并感染,可引起呼吸道疾病[3]。BCoV感染成年牛后雖然病死率較低,但會造成奶牛產奶量和體重顯著下降,感染犢牛后會有較高的病死率[4-5]。聚合酶鏈反應(PCR)技術已普遍應用于病原微生物的核酸檢測,熒光定量PCR檢測技術是在普通PCR技術上發展而來,其特異性和敏感性更高,而且可對樣品進行定量分析[6-7]。近年對牛冠狀病毒熒光定量PCR檢測研究較少,本試驗參照GenBank收錄的牛冠狀病毒AKS-01株N基因保守序列設計特異性引物和探針,建立一種BCoV的TaqMan熒光定量PCR檢測方法,為其流行病學調查及臨場樣本檢測提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及樣品 牛冠狀病毒、牛輪狀病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛副流感病毒3型由中國動物衛生與流行病學中心國家動物血清庫鑒定并保存;用于臨床檢測的132份糞便樣品采集自云南省不同地區奶牛場。

1.1.2 主要試劑 pGM-T載體試劑盒、氨芐青霉素、膠回收試劑盒、病毒DNA基因組提取試劑盒、LB培養基、DNA Marker、快速質粒小提試劑盒、Premix ExTaq(Probe qPCR),天根生化科技有限公司產品;感受態細胞DH5α、2×AccurateTaqMaster Mix,艾科瑞生物工程有限公司產品。

1.1.3 主要儀器 梯度PCR儀、凝膠成像系統,莫納生物科技有限公司產品;恒溫振蕩器,蘇州培英實驗設備有限公司產品;低溫高速離心機,曦瑪離心機(揚州)有限公司產品;實時熒光定量PCR儀,西安天隆科技有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針 根據GenBank收錄的BcoV AKS-01株N基因序列(KU886219)選擇保守區設計引物, BCoVF:CAATCCAGTAGTAGAGCGT CCT;BCoVR:CTGGTTGCTGAGAAGTGACAG T;BCoV-Probe:FAM-TGCCAAAGACCAGTATGGCACCGA-BHQ1,片段大小為142 bp。

1.2.2 重組質粒的構建 按DNA組提取試劑盒說明書對保存毒株BcoV進行核酸提取,用特異性引物對反轉錄得到的cDNA模板進行PCR擴增。擴增產物用1%凝膠電泳確定目標基因片段大小與預期相符后,目標片段膠回收產物與pGM-T載體在16℃金屬浴中連接16 h并轉化至DH5α,轉化成功后涂布至Amp+抗性瓊脂平板進行篩選,經PCR鑒定為陽性后送至西安熱默爾生物有限公司測序,用酶標儀測定濃度計算拷貝數。

1.2.3 反應體系和反應條件的優化 熒光定量PCR反應體系為20 μL,分別以10 μmol/L探針濃度對0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 μL等5個梯度進行優化,以20 μmol/L引物濃度對0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μL等6個梯度進行優化,以56～60℃溫度梯度進行退火溫度的優化。

1.2.4 標準曲線的建立 在熒光定量PCR最佳反應體系和反應條件下,將重組質粒用無DNA/RNA酶水10倍稀釋,以5.75×107～5.75×103copies/μL為模板進行擴增,同時設置陰性對照,建立標準曲線。

1.2.5 特異性試驗 使用病毒提取試劑盒分別提取BCoV、BRV、IBRV、BVDV、BPIV3基因組核酸,以BCoV、BRV、BVDV、BPIV3反轉錄后得到的cDNA以及IBRV的基因組DNA為模板在1.2.3中反應體系和反應條件下進行擴增,同時設置陰性對照,評價該方法的特異性。

1.2.6 敏感性試驗 在熒光定量PCR最佳反應體系和反應條件下,將重組質粒用無DNA/RNA酶水10倍稀釋,以終濃度為5.75×107～5.75×100copies/μL的重組質粒為檢測樣品較常規PCR擴增進行對比,同時設置陰性對照,評價兩種檢測方法的敏感性。

1.2.7 重復性試驗 在熒光定量PCR最佳反應體系和反應條件下,將重組質粒用無DNA/RNA酶水10倍倍比稀釋,以終濃度為5.75×106～5.75×104copies/μL的重組質粒為檢測樣品進行擴增,每組樣品重復3次,評價批內重復性;分別選取3個不同的時間進行擴增,評價批間重復性。

1.2.8 臨床樣品檢測 采用本試驗建立檢測方法以及常規PCR檢測方法對云南省不同地區收集的132份糞便樣品進行檢測,評價臨床應用效果。

2 結果

2.1 重組質粒的構建

將構建的重組質粒送至北京熱默爾生物有限公司進行測序,測序結果顯示重組質粒序列與預期序列完全一致。計算重組質?？截悢禐?.75×1010copies/μL。

2.2 反應體系和反應條件優化結果

熒光定量PCR的反應體系為20 μL:Premix ExTaq(Probe qPCR)10 μL,探針(10 μmol/L)及上、下游引物(20 μmol/L)各0.3 μL,模板1 μL,ddH2O補足到20 μL。反應條件為:95℃ 30 s;95℃ 5 s、60℃ 30 s,40個循環。

2.3 標準曲線的建立

將BCoV重組質粒用無DNA/RNA酶水10倍稀釋,分別以終濃度為5.75×107～5.75×103copies/μL重組質粒為檢測樣品進行擴增。結果顯示,當重組質粒所制備的標準品終濃度為5.75×107～5.75×103copies/μL時與Ct值線性關系良好,所建立標準曲線回歸方程為y=-3.207x+40.749,R2=0.999,E=105%(圖1)。

圖1 BCoV熒光定量PCR標準曲線

2.4 特異性試驗結果

用優化好的反應體系和反應條件分別對BCoV、BRV、IBRV、BVDV、BPIV3進行檢測。檢測結果顯示,BcoV檢測結果為陽性(圖2),其余均為陰性,表明該方法特異性良好。

1.BCoV擴增曲線;2～5.分別為BRV、IBRV、BVDV和BPIV3擴增曲線;N陰性對照

2.5 敏感性試驗結果

將BCoV重組質粒用DEPC水10倍稀釋,分別以終濃度為5.75×107～5.75×100copies/μL的重組質粒標準品為待檢樣品,ddH2O為陰性對照進行擴增。結果顯示,以BCoV終濃度為5.75×107～5.75×100copies/μL的重組質粒標準品為檢測樣本其最低檢測限為5.75×101copies/μL(圖3);較常規PCR最低檢測限為5.75×102copies/μL(圖4),說明該方法敏感性較常規PCR高,敏感性良好。

1～8.5.75×107～5.75×100 copies/μL標準模板TaqMan熒光定量PCR擴增曲線;N.陰性對照

M.DNA標準DL 2 000;1～8.5.75×107～5.75×100 copies/μL標準模板常規PCR擴增

2.6 重復性試驗結果

將BCoV重組質粒用無DNA/RNA酶水10倍稀釋,分別以終濃度為5.75×106～5.75×104copies/μL的重組質粒為模板分別進行批內和批間重復性試驗。擴增結果顯示,批內和批間重復性試驗結果穩定,重復性良好,變異系數均小于2%(表1)。

表1 BCoV熒光定量PCR重復性試驗結果

2.7 臨床樣品檢測結果

臨床對132份樣品檢測結果顯示,TaqMan熒光定量PCR檢測陽性數27份,陽性率為20.45%,常規PCR檢測陽性數22份,陽性率為16.67%,兩者符合率為96.21%。

3 討論

牛冠狀病毒病呈全球性分布,由牛冠狀病毒感染引起的新生犢牛腹瀉以及BRDC是阻礙我國養牛業發展的重大因素之一[8]。近年來,隨著養牛業的發展,牛冠狀病毒的流行給養殖戶造成了一定的經濟損失。由于引起犢牛腹瀉的病原體較多且癥狀較相似,因此,必須通過實驗室檢測才可以確診[9]。目前,牛冠狀病毒實驗室檢測TaqMan熒光定量PCR檢測方法相較病毒分離鑒定、HA/HI、ELISA、中和試驗、PCR檢測等方法來說,熒光定量PCR操作簡單,用時較短,其特異性更強,敏感性更高。

牛冠狀病毒N基因高度保守,本試驗以牛冠狀病毒AKS-01株N基因序列為模板,同時比對15條N基因序列,選擇其保守序列進行引物和探針的設計,并進行重組質粒的構建,以此來建立BcoVTaqMan熒光定量PCR檢測方法,經驗證,該方法對BcoV特異性良好,且與BRV、IBRV、BVDV、BPIV3均無交叉反應;較普通PCR檢測方法靈敏10倍,最低檢測限為5.75×101copies/μL;批內重復性和批間重復性試驗結果穩定,變異系數均小于2%。對收集的132份糞便樣品進行檢測,TaqMan熒光定量PCR檢測陽性率為20.45% ,常規PCR檢測陽性率為16.67%,兩者符合率為96.21%。說明云南省部分地區牛冠狀病毒感染率較高。目前尚無針對牛冠狀病毒的特效抗病毒藥物,因此想要降低該病毒的感染率,首先必須做好預防工作,BCoV對氯仿、乙醚和肥皂等脂溶劑以及某些消毒劑如福爾馬林、苯酚等均較為敏感,定期對牛舍進行消毒、通風,及時更換墊料,保持牛舍干燥,以控制該病毒的傳播[10-11]。