弓形蟲多表位PLGA納米疫苗的研究

張飛躍,伍孟琛,吳海燕,馬光旭,吳 飛,杜愛芳,楊 怡

(浙江大學動物科學學院,浙江省動物預防醫學重點實驗室,浙江杭州 310058)

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種專性胞內寄生蟲,其感染包括速殖子、緩殖子和子孢子3個時期[1],嚴重感染者可引起死亡[2]。疫苗對先天性感染的阻斷及獲得性感染的預防具有重要意義[3]。目前只有減毒活S48菌株疫苗被批準用于預防綿羊流產,但其預防效果有限且存在返毒的可能[4]。隨著免疫學的發展,用保守性高和免疫原性強的弓形蟲抗原表位來研制多表位疫苗,已成為開發新型疫苗的有效手段[5]。多表位疫苗具有穩定性強,無致癌潛力,是減毒活疫苗的安全替代品;可通過生物信息學工具模擬,實現疫苗制備的高效性[6-7]。但多表位疫苗通常免疫原性較低,因此在引發保護性免疫方面效果較差[8]。納米材料為開發新型疫苗開辟了新的途徑,相比于傳統的弗氏佐劑、鋁鹽佐劑等,PLGA納米材料作為輸送系統具有巨大的潛力[9]。抗原包封在PLGA顆粒內可免受酶降解,延長其體循環時間并增加向免疫細胞呈遞的可能性[10]。PLGA顆粒可降低抗原和佐劑的使用量,從而降低毒副作用。用PLGA納米顆粒遞送疫苗可有效解決多表位肽免疫原性低的問題,為開發新型疫苗提供新的方向。本研究將TgSAG1、TgGRA7和TgMIC3中的優勢抗原表位通過柔性連接肽串聯構建一種新型多表位肽,用大腸埃希氏菌表達系統制備并鑒定多表位重組蛋白,搭載MEP-PLGA納米遞送體系,提高多表位重組蛋白的遞送效率,為弓形蟲多表位納米疫苗的研制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體、菌株和主要試劑 克隆載體pET-28a(+)Vector,上海捷瑞生物工程有限公司產品;大腸埃希氏菌BL 21(DE3)感受態菌株,日本Takara公司產品;Ni-NTA親和層析柱,北京韋氏博慧科技有限公司產品;HRP標記的山羊抗小鼠IgG抗體和考馬斯亮藍染液,杭州弗德生物科技有限公司產品;雙組份TMB顯色液,北京索萊寶科技有限公司產品;IPTG和抗His標簽鼠源單克隆抗體,美國Sigma公司產品;PLGA,山東岱罡生物有限公司產品;BCA蛋白濃度測定試劑盒,上海碧云天生物技術有限公司產品;DNA marker,日本TaKaRa公司產品;蛋白純化柱外柱、5×SDS、牛血清蛋白,生工生物工程(上海)股份有限公司產品;司盤-80、二氯甲烷、聚乙烯醇,國藥集團化學試劑有限公司產品。

1.1.2 主要儀器 SCIENTZ-II D超聲波細胞粉碎機,寧波新芝科技公司產品;立式冷凍干燥機,美國LABCONCO公司產品;JEM-1230透射電子顯微鏡,日本JEOL公司產品;S3000N掃描式電子顯微鏡,日本日立公司產品;ZCEC納米粒度電位分析儀,英國Malvern公司產品。

1.2 方法

1.2.1 優勢抗原表位的預測 通過ToxoDB(https://toxodb.org/toxo/app/user/registration)檢索mic3(TGME49-319560)基因序列,用蛋白結構數據庫RCSB PDB網站(https://www.rcsb.org/)檢索蛋白結構;用BCPREDS(http://ailab.ist.psu.edu/bcpred/predict.html)分析TgMIC3蛋白的B細胞線性表位;IEBD(http://tools.iedb.org/mhci/)分析TgMIC3蛋白的CD8+T細胞表位,選擇MHCⅠ分子類型為H-2-Kd、H-2-Dd、H-2-Ld;IEBD服務器分析TgMIC3蛋白的CD4+T細胞表位,選擇MHCⅡ分子類型為H-2-I。

1.2.2 嵌合多表位肽的生物信息學預測 利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)預測多表位肽的理化性質,VaxiJen v2.0 (http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html)預測抗原性,AlgPred2(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/algpred2/)預測致敏性,PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred)預測二級結構,AlphaFold 2預測多表位肽的三級結構,ZDOCK服務器(http://zdock.umassmed.edu/)進行分子對接,PyMOL軟件進行可視化分析,PyRAMA服務器驗證二面角合理性,HawkDock服務器(http://cadd.zju.edu.cn/hawkdock/)預測結合自由能。

1.2.3 多表位重組蛋白的表達與純化 目的DNA片段由捷瑞生物公司合成,并將其連接在pET-28a(+)載體上;取重組質粒轉化到BL21(DE3)感受態大腸埃希氏菌中,于含卡那抗性的LB平板上過夜培養;挑取單個菌落于在LB液體培養基中,在37℃、220 r/min的環境下培養;待菌液OD450達到0.7左右時,加入IPTG至終濃度為0.8 mmol/L,在220 r/min、37℃環境下分別于0 h、2 h、4 h、6 h取出500 μL樣品;誘導菌液離心后棄去上清,將沉淀重懸于預制的PBS中,使用SCIENTZ-II D超聲波細胞粉碎機冰浴超聲破碎(180 W、40%功率、4 s超聲、2 s間隔),離心后分離出上清樣品和沉淀樣品,制樣后進行SDS-PAGE檢測;將擴大培養后的菌液,冰浴超聲破碎(180 W、40%功率、4 s超聲、2 s間隔),取上清液過Ni離子親和層析柱,用60、80、120、250、500 mmol/L咪唑的緩沖液洗脫;收集洗脫液,經SDS-PAGE檢測純化效果。

1.2.4 Western blot檢測多表位重組蛋白的純化效果 蛋白透析后經SDS-PAGE后轉膜,用5%脫脂奶粉封閉1.5 h;用鼠源His單抗作為一抗,過夜孵育,用TBST清洗5次,5 min/次;加入羊抗鼠IgG-HRP作為二抗,室溫孵育2 h,用TBST洗滌,滴加顯色液進行顯色并拍照。

1.2.5 雙乳液揮發法制備PLGA納米顆粒 稱取100 mg的PLGA溶于10 mL二氯甲烷作為油相,加入司盤-80至終濃度為10 mL/L,用注射器將500 μL目的蛋白液加入油相中,立即冰浴超聲破碎(180 W、20%功率、1 s超聲、1 s間隔)5 min,直至形成白色的初乳;將初乳加入到50 mL 2%聚乙烯醇中,再次于冰上超聲破碎(180 W、50%功率、1 s超聲、1 s間隔)20 min,得到復乳;將液體倒入到200 mL 5%聚乙烯醇中,磁力攪拌器過夜攪拌,揮干有機溶劑;成品于30 mL超純水中洗滌5次,再加入10 mL超純水并混勻,得到PLGA納米懸液。使用立式冷凍干燥機減壓干燥,即可得PLGA納米顆粒。

1.2.6 MEP-PLGA納米顆粒的表征 取數滴PLGA納米懸液在透射電鏡專用銅網孵育3 min,通過JEM-1230透射電子顯微鏡觀察顆粒形態;取適量PLGA納米顆粒噴金處理后通過S3000N掃描式電子顯微鏡觀察形態;取適量PLGA納米粒用水稀釋,使用ZCEC納米粒度電位分析儀測量乳液參數;精密稱取減壓干燥后MEP-PLGA納米顆粒質量,將MEP-PLGA納米顆粒溶于0.1 mol/L NaOH和10 g/L SDS溶液中,振蕩后離心,取上清液,用BCA法測定蛋白總量;按公式測定包封率(Encapsulation rate,EE),公式為EE=(M包/M藥)×100%,M包為納米粒中包裹的藥物質量(mg),M藥為投入的總藥質量(mg)。

2 結果

2.1 優勢抗原表位的預測結果

通過BCPREDS服務器篩選到TgMIC3的B細胞表位,預測分數最高的序列為“SKTMCGPGGCGEFCSSNWIF”。IEDB軟件預測TgMIC3蛋白的T細胞MHCⅠ、MHCⅡ表位,預測分數最高的序列為“LPIQKSVQL”和“HDTTTYVARRRYPA”。

2.2 多表位肽的設計

將多肽SAG1(238-256)、MIC3(109-128)、GRA7(20-28)、MIC3(27-35)、AS15和MIC3(368-381)按照順序連接(表1),基因片段之間通過柔性連接肽“SAPGTP”連接各抗原表位(圖1)。

表1 表位序列與類型

圖1 多表位肽構建示意圖

2.3 多表位肽的生物信息學分析結果

用ProtParam服務器分析多表位肽理化特性,其分子質量為12.043 61 ku,理論等電點(Isoelectric point,PI)為8.83;在紫外280 nm光吸收下,當所有的Cys均配對成胱氨酸,消光系數為14 230 L/(mol·cm);當N端為半胱氨酸時,估計在哺乳動物網織紅細胞內半衰期為1.2 h,在酵母細胞中半衰期超過20 h,在大腸埃希氏菌內半衰期超過10 h;脂肪系數為50.60;親水性平均值為-0.424。用VaxiJenv 2.0分析多表位肽的抗原性,發現當以大腸埃希氏菌為表達系統時,多表位肽抗原性總體評分為0.468 0(抗原閾值為0.4)。用AlgPred 2.0服務器分析多表位肽的致敏性,預測多表位肽為非過敏原。用PSIPRED服務器預測二級結構,其局部空間結構為13個氨基酸構成α螺旋、18個氨基酸構成β折疊和85個氨基酸構成無規則卷曲。用AlphaFold 2軟件預測多表位肽的三級結構,PyMOL軟件進行可視化分析,發現嵌合的抗原表位均呈現在多肽表面(圖2)。用ZDOOCK服務器將多表位肽與H-2-Dd進行分子對接,PyMOL軟件進行可視化分析,發現多表位肽和H-2-Dd可以穩定結合(圖3A)。PyRAMA服務器繪制拉式圖,發現其氨基酸構象幾乎均在合理范圍內(圖3B);HawkDock服務器分析MEP-H-2-Dd復合物,得到結合自由能為-34.69 kcal/mol。

圖2 多表位肽的三級結構

A.MEP和H-2-Dd分子對接示意圖;B.General為多表位肽總體拉氏圖,GLY為甘氨酸拉氏圖,PRE-PRO為脯氨酸前殘基拉式圖,PRO為脯氨酸拉式圖

2.4 多表位重組蛋白的表達與純化結果

多表位重組蛋白成功在大腸埃希氏菌中誘導表達,且在加入IPTG誘導表達6 h時,菌液蛋白含量達到最高水平;超聲裂解后重組蛋白出現在上清樣品中,表明多表位重組蛋白為水溶性蛋白(圖4);咪唑洗脫液濃度為250 mmol/L時,在分子質量為20 ku處出現單一條帶,表明通過Ni離子親和柱可獲得高純度多表位重組蛋白(圖5)。

M.蛋白分子質量標準;1～4.誘導后0,2,4,6 h蛋白表達水平;5.超裂后上清;6.超裂后沉淀

2.5 Western blot檢測多表位重組蛋白的純化效果

Western blot結果表明,帶有His標簽的多表位重組蛋白可以被相應的單克隆抗體特異性識別(圖6)。

2.6 MEP-PLGA納米顆粒的表征

取3批MEP-PLGA納米顆粒凍干粉,測得其平均包封率為54.42%;通過掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察納米顆粒呈圓球狀,表面光滑,大小均一,未出現大面積團聚(圖7A、圖7B);通過DLS得到多分散系數(Polymer dispersity index,PDI)平均值為0.203,低于閾值0.3,表明其粒徑大小分布均勻(圖7C)。構建的MEP-PLGA體系穩定,顆粒不易發生聚集,能有效包封多表位肽。

A.透射電鏡顯微鏡觀察;B.掃描電子顯微鏡觀察;C.DLS粒徑分布圖

3 討論

已鑒定出不同時期弓形蟲生活史中多種穩定表達的蛋白。其中TgSAG1穩定表達于速殖子期,對宿主細胞的黏附和侵襲過程很重要[11]。其優勢抗原表位序列為TgSAG1(238-256)。TgGRA7在速殖子和緩殖子階段均有表達,能刺激宿主產生細胞免疫和體液免疫,是良好的疫苗候選抗原[12],TgGRA7(20-28)作為CD8+T細胞表位可提高小鼠機體TNF-γ含量,并降低感染小鼠腦包囊的數量。TgMIC3表達于弓形蟲的各個階段,免疫后能刺激宿主產生持久的免疫保護,是MIC家族中最常用的疫苗候選抗原[13]。AS15肽是弓形蟲CD4+T細胞表位,可發揮重要的免疫調節作用,免疫后保護動物免受弓形蟲感染。

本研究將弓形蟲不同時期抗原優勢表位組合在一起形成嵌合多表位肽,有望對機體形成多層次、多特異性免疫保護[14]。為保證多表位設計的有效性,用生物信息學方法評估多表位肽疫苗潛力。多表位肽一級結構顯示,構建的多表位肽為親水性蛋白,具有抗原性,無過敏性,說明構建的多表位肽具備安全性和有效性。多表位肽二級結構表明,β折疊和無規則卷曲占多表位肽的總氨基酸比重較多。由于β折疊和無規則卷曲多突出在蛋白的表面,且具有較強的表面可及性,說明多表位肽的抗原表位很可能呈現在蛋白表面,有利于被抗原遞呈細胞識別[15]。對多表位肽的三維結構分析,抗原表位均呈現在蛋白表面,與二級結構的預測結果一致。因此,多表位肽的結構特性預測結果符合預期。分子對接模擬結果顯示,多表位肽可與MHC分子H-2-Dd穩定結合。MEP-H-2-Dd復合物拉氏圖表明,有超過90%氨基酸殘基構象位于合理區間,該模型構象符合立體化學的規則[16]。HawkDock模擬得到結合自由能為-34.69 kcal/mol,說明多表位肽與MHC分子結合后處于低能量的穩定狀態[17]。

PLGA納米顆粒制備工藝的重要評價指標包括形狀、粒徑和多分散系數[18]。納米粒形狀可通過改變納米粒和細胞膜接觸后形成的角度,影響抗原遞呈細胞(antigen presenting cells,APCs)的攝取效率[18]。相比于棒狀或橄欖球狀納米顆粒,圓球狀更容易被APCs攝取。粒徑的大小可改變免疫反應類型和免疫反應強弱。20～100 nm的納米粒可直接通過淋巴管或細胞間隙進入淋巴結,產生強烈的免疫反應[19];200～600 nm的納米粒可誘導機體分泌高水平的IFN-γ,免疫反應類型偏向Th1型免疫反應;2 000～8 000 nm的納米粒可誘導機體分泌高水平的IL-4,免疫反應類型偏向Th2型免疫反應。多分散系數的大小可以反映納米粒外觀尺寸的均勻性,數值越小表明顆粒的粒徑越均勻[20]。本研究采用雙乳液揮發法制備MEP-PLGA納米顆粒,結果發現,制備初乳的超聲功率和時間對納米粒的性質有重要影響。超聲功率過低或超聲時間不足,難以形成納米級顆粒;超聲功率過高或超聲時間過長,形成的納米粒多分散系數偏高。因此,通過合理設置超聲參數,本研究制備的納米粒顆粒飽滿、粒徑適宜且大小均一,為遞送多表位肽奠定了堅實基礎。

本研究充分用AlphaFold 2、HawkDock等前沿生物信息學工具,分析多表位肽的疫苗潛力,并構建MEP-PLGA納米遞送體系。后續可通過小鼠模型接種MEP-PLGA納米顆粒,評估疫苗的免疫保護效果。本研究設計的多表位肽具備弓形蟲疫苗的潛力,為后續弓形蟲多表位納米疫苗的研發奠定了基礎。