鐵自噬介導鐵死亡機制和檢測方法的研究進展*

郭 婕， 王玉龍， 麥鳳怡， 楊文濤， 梁靖蓉， 舒俊翔， 李陳廣1，△

（1深圳大學醫(yī)學部生物醫(yī)學工程學院，醫(yī)學超聲關(guān)鍵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，廣東省生物醫(yī)學信息檢測與超聲成像重點實驗室，廣東 深圳 518060；2深圳市第二人民醫(yī)院，廣東 深圳 518025；3華中科技大學協(xié)和深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518052）

1 鐵死亡發(fā)生機制

在多細胞生物組織穩(wěn)態(tài)的正常發(fā)育和維持過程中，以及消除受損、感染或衰老的細胞過程中依賴于程序性細胞死亡（programmed cell death， PCD）信號事件的嚴密調(diào)控。PCD主要包括細胞凋亡、壞死性凋亡、細胞焦亡、鐵死亡以及自噬等死亡方式［1］。而鐵死亡這一概念最早在2012年由Dr.Dixon提出，它是一種鐵依賴性的脂質(zhì)過氧化、活性氧自由基大量累積所致的細胞死亡方式，與氨基酸、脂質(zhì)和糖等生化分子的代謝生理過程緊密相關(guān)，且是心血管疾病、腫瘤和腎衰竭等疾病的病理基礎(chǔ)之一［2］。受到細胞內(nèi)多種代謝途徑的調(diào)控，其中包括氧化還原穩(wěn)態(tài)、鐵代謝、線粒體活性和氨基酸、脂質(zhì)、糖的代謝等［3］。

現(xiàn)階段鐵死亡的主要機制有兩個，一是system Xc-/GPX4途徑，即胱氨酸（cystine）經(jīng)嵌于細胞膜表面SLC7A11和SLC3A2二聚體（system xC-）進入細胞，然后被氧化成半胱氨酸（cysteine），經(jīng)谷氨酸-半胱氨酸連接酶和谷胱甘肽合成酶的催化作用下合成谷胱甘肽（glutathione）。谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4， GPX4）利用GSH能夠?qū)⒅|(zhì)過氧化的過氧鍵（L-OOH）轉(zhuǎn)變?yōu)榱u基（L-OH），失去其過氧化物的活性；此過程起到抑制細胞鐵死亡的作用（圖1）。另一重要途徑為鐵代謝途徑（iron metabolic），即Fe3+經(jīng)轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin， TF）及轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrin receptor protein 1， TFR1）攝取，被金屬還原酶（six-transmembrane epithelial antigen of the prostate 3， STEAP3）。還原為Fe2+，后經(jīng)DMT1、鐵代謝調(diào)節(jié)因子蛋白（ZIP8/14）轉(zhuǎn)運進入胞質(zhì)不穩(wěn)定鐵池（labile iron pool， LIP）。在過量Fe2+存在的情況下，可通過芬頓反應(yīng)增加活性氧生成，促進過氧化脂質(zhì)形成，從而誘發(fā)細胞鐵死亡。鐵在脂質(zhì)過氧化的過程中介導活性氧的產(chǎn)生和酶活性的改變，因此，鐵代謝的許多方面，如鐵的攝取、儲存和利用等，都受到嚴格的調(diào)控，鐵代謝和鐵死亡密切相關(guān)。在正常生理狀態(tài)下，細胞內(nèi)未被利用的Fe2+被鐵蛋白的重鏈亞基（ferritin heavy chain， FTH）氧化為Fe3+，F(xiàn)e3+既可以儲存在鐵蛋白中，也可以通過細胞膜上的鐵轉(zhuǎn)運輸出蛋白1（ferroportin 1， FPN1）運輸出至細胞外［4］。研究發(fā)現(xiàn)， NCOA4與FTH1相互結(jié)合并介導FTH1發(fā)生自噬性降解，從而釋放Fe2+，這一過程被稱為鐵自噬（ferritinophagy）。鐵自噬促進Fe2+的釋放引起細胞內(nèi)游離鐵的濃度升高，最終促進鐵死亡的發(fā)生［5］（圖1）。鐵自噬與多種癌癥、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病和肝臟等疾病的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)，通過調(diào)控鐵自噬的發(fā)生將有望成為治療相關(guān)疾病的潛在治療策略和靶點［6-8］。

Figure 1.Ferroptosis signaling pathways［3］.圖1 鐵死亡信號通路

1.1 鐵死亡的關(guān)鍵指標 目前研究者主要根據(jù)鐵死亡在細胞形態(tài)、代謝和分子生物學方面的改變進行檢測。

1.1.1 形態(tài)學特征 透射電子顯微鏡是目前最為直觀的觀察手段，超微結(jié)構(gòu)顯示鐵死亡時，線粒體變小、線粒體嵴消失、線粒體膜密度增加及外膜破碎等變化，但細胞核形態(tài)正常［3］。

1.1.2 細胞內(nèi)亞鐵離子檢測 Fe2+的不穩(wěn)定性和高反應(yīng)活性，通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，可直接與細胞膜、質(zhì)膜中的多不飽和脂肪酸反應(yīng)，產(chǎn)生大量脂質(zhì)ROS，導致鐵死亡。鐵離子的變化是鐵死亡的關(guān)鍵，通過熒光探針FerroOrange、RhoNox-1和FRET iron probe 1可簡單快速高效地對活細胞內(nèi)的Fe2+進行熒光成像［9-11］。

1.1.3 谷胱甘肽含量的檢測 谷胱甘肽的耗竭是細胞執(zhí)行鐵死亡的重要原因之一［3］。谷胱甘肽包括還原型谷胱甘肽（reduced glutathione， GSH）和氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione disulfide， GSSG）兩種形式。它的檢測原理為GSH能夠與二硫代二硝基苯甲酸反應(yīng)，產(chǎn)生一種在波長為412 nm處有最大光吸收的黃色產(chǎn)物，通過比色法可對 GSH 的水平進行定量測定［12］。

1.1.4 ROS及脂質(zhì)過氧化 鐵依賴性脂質(zhì)ROS積累與所有途徑的鐵死亡相關(guān)。不受限制的脂質(zhì)過氧化是鐵死亡的標志。因此，鐵死亡表現(xiàn)為脂質(zhì)過氧化和ROS水平升高。目前主要使用2'，7'-二氯熒光素二乙酸酯（2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate， DCFH-DA）熒光探針檢測細胞內(nèi)ROS水平，DCFH-DA本身沒有熒光，可自由穿過細胞膜，被細胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH；細胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測DCF的熒光強度間接反應(yīng)細胞內(nèi)活性氧的水平［13］。另外使用C11-BODIPY581/591［14］（細 胞 內(nèi)）、Liperfluo［15］（細 胞內(nèi)）和MitoPeDPP［16］（線粒體內(nèi)）試劑的檢測，反映脂質(zhì)過氧化水平。LOOHs作為脂質(zhì)過氧化物的初級產(chǎn)物會被分解成一系列醛類化合物，檢測丙二醛（malondialdehyde， MDA）和4-羥基壬烯醛（4-hydroxynonenal， 4-HNE）的含量，能夠在一定程度上間接反映鐵死亡中脂質(zhì)氧化的程度［17］。

1.1.5 鐵死亡關(guān)鍵調(diào)控基因和蛋白水平的檢測當鐵死亡發(fā)生時，谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4， GPX4）、溶質(zhì)載體家族7成員11（solute carrier family 7 member 11， SLC7A11）和TFR等主要調(diào)控分子的基因表達和蛋白表達水平會發(fā)生相應(yīng)變化，利用熒光定量PCR和Western blot檢測關(guān)鍵蛋白的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的變化［7-8，17］，可為細胞鐵死亡檢測提供依據(jù)。

2 鐵自噬及過程

2014 年，Mancias［5］等通過自噬體分離和定量蛋白質(zhì)組學的結(jié)合已經(jīng)確定核受體輔激活因子NCOA4是負責自噬依賴性鐵蛋白降解的貨物受體，NCOA4的C末端結(jié)合了吞噬體中FTH1上的一個保守的表面精氨酸（R23），隨后FTH1在NCOA4的介導下被吞噬體“吞噬”，吞噬體逐漸擴展成一個完整的囊泡，稱之為“自噬體”，隨后吞噬FTH1和NCO4A的自噬體和溶酶體融合成一個自噬溶酶體，對FTH1進行降解，釋放鐵離子［18］。這一過程為鐵自噬（ferritinophagy）。鐵自噬是降解鐵蛋白釋放游離鐵的過程，當細胞內(nèi)的游離鐵不足以維持生命活動時，細胞通過啟動鐵自噬維持鐵穩(wěn)態(tài)。而鐵離子在胞內(nèi)積累過多超過體內(nèi)調(diào)節(jié)平衡時，過多的鐵離子則通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生大量的活性氧造成細胞損傷，最終引起鐵死亡（圖2）。

2.1 參與鐵自噬的關(guān)鍵分子

2.1.1 NCOA4 NCOA4是一種雄激素受體（androgen receptor， AR）輔激活因子。以配體依賴的方式與AR相互作用以增強其轉(zhuǎn)錄活性，同時也是定位在細胞核的選擇性運載受體［19］。近年來研究表明NCOA4是鐵自噬過程中的關(guān)鍵分子，NCOA4保守的C末 端 及 NCOA4α中 的L494、L498、I489、S492、W497區(qū)段選擇性識別FTH1的R23，并結(jié)合形成NCOA4-FTH1復(fù)合體，然后與自噬相關(guān)基因LC3結(jié)合并形成自噬體，最終降解鐵蛋白并釋放游離鐵［6］。E3泛素蛋白連接酶HERC2是細胞內(nèi)調(diào)節(jié)NCOA4水平的重要蛋白。當胞內(nèi)鐵離子水平較高時，NCOA4與HERC2結(jié)合增強，并在泛素蛋白酶體系統(tǒng)中降解，有利于鐵離子儲存于鐵蛋白中［6，20］。相反，在細胞鐵離子較低時，NCOA4與HERC2的結(jié)合強度明顯減弱，使得細胞內(nèi)NCOA4水平增高，大大增加了NCOA4與FTH1的結(jié)合，從而使鐵蛋白被降解，釋放出游離鐵，以補充細胞鐵水平。HERC2、FTH1兩者與NCOA4結(jié)合位點相同，這樣的競爭結(jié)合關(guān)系可以調(diào)控細胞內(nèi)鐵含量的平衡及鐵自噬的發(fā)生程度［5］。

2.2.2 FTH1 鐵蛋白是細胞內(nèi)鐵離子儲存的重要結(jié)構(gòu)，由24個鐵蛋白重鏈（FTH1）和輕鏈（ferritin light chain， FTL）亞基組成鐵蛋白復(fù)合體，能夠儲存多達4500個Fe3+［21］。在細胞內(nèi)，鐵離子主要與FTH1結(jié)合，因此FTH1在鐵超載與鐵穩(wěn)態(tài)中扮演至關(guān)重要的角色。2017年Gryzik［22］的研究結(jié)果表明，每個鐵蛋白復(fù)合物最多能夠結(jié)合24個NCOA4分子。NCOA4通過C端結(jié)構(gòu)域選擇性識別FTH1的亞基，并與之相結(jié)合；進一步研究發(fā)現(xiàn)，由于FTH1表面有16個高度保守的殘基，而FTL表面沒有，因此決定了NCOA4對FTH1的特異性識別和結(jié)合。FTH1可以結(jié)合及催化Fe2+，氧化為Fe3+［21］，從而降低芬頓反應(yīng)及ROS的產(chǎn)生。而細胞內(nèi)高濃度的鐵水平會抑制FTH1與NCOA4的結(jié)合，加速NCOA4的降解，同時導致鐵蛋白降解和抑制鐵死亡。當細胞對鐵的需求增加或處于低水平時，可增強FTH1與NCOA4結(jié)合，分解和釋放游離鐵以維持正常細胞穩(wěn)態(tài)［23］。

2.2.3 自噬相關(guān)基因與鐵自噬 在特定條件下對大分子或細胞器的靶向結(jié)合并降解稱為選擇性自噬。鐵自噬作為選擇性自噬的一種，在鐵耗竭時，F(xiàn)TH1自噬性降解并釋放鐵離子，從而維持體內(nèi)的鐵穩(wěn)態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)鐵自噬的發(fā)生需要自噬相關(guān)基因（autophagy-related gene， ATG）的介導［24］。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（MAP1-LC3），是鐵自噬發(fā)生的重要參與蛋白。 在鐵自噬發(fā)生過程中，LC3與 NCOA4-FTH1復(fù)合物結(jié)合，最終將形成自噬體。敲除或敲低ATG5和ATG7，可抑制Erastin誘導的鐵死亡，表現(xiàn)為細胞內(nèi)游離鐵水平降低，F(xiàn)e2+介導的芬頓反應(yīng)減弱，ROS減少及GSH水平增加。另一方面，在自噬體膜的形成階段，ATG7可使ATG5和ATG12通過共價方式結(jié)合。在口腔鱗癌細胞中，抑制ATG7表達，可增強腫瘤細胞遷移，在機制上可能與鐵自噬受到抑制有關(guān)［25］。

3 鐵自噬的檢測

鐵自噬最終也是導致細胞發(fā)生鐵死亡，除了鐵死亡常規(guī)檢測方法外，則需針對鐵自噬過程中如FTH1與NCOA4的結(jié)合、自噬溶酶體的形成以及最后鐵離子釋放等方面進行實驗檢測，以證明鐵自噬參與介導鐵死亡的發(fā)生（表1）。

表1 鐵死亡和鐵自噬檢測方法比較Table 1.Comparative detection methods for ferroptosis and ferritinophagy

3.1 FTH1及NCOA4基因及蛋白水平的檢測 在鐵自噬過程中，NCOA4能夠結(jié)合FTH1并將其轉(zhuǎn)運到自噬體內(nèi)，通過自噬途徑降解FTH1釋放游離的鐵離子。因此，NCOA4和FTH1的基因及蛋白水平的變化可以作為確定鐵自噬發(fā)生的重要指標之一。常用的檢測方法包括實時熒光定量PCR技術(shù)檢測mRNA的表達水平，Western blot、免疫熒光和免疫組化檢測細胞或組織的蛋白表達水平。Western blot作為較為常規(guī)的方法，具有高靈敏性、特異性、可重復(fù)性及可定量等優(yōu)點，但在具體實驗中需結(jié)合實驗設(shè)計，檢測不同時間及誘導劑的作用，對NCOA4及FTH1的蛋白質(zhì)表達變化。鐵自噬是一個通過自噬降解FTH1的過程，與此同時，NCOA4也會被泛素化降解。雖然蛋白水平下降，但 mRNA轉(zhuǎn)錄水平不一定有所變化，因此利用熒光定量PCR方法檢測NCOA4及FTH1的基因的轉(zhuǎn)錄水平變化，可以從基因表達水平上更好地了解鐵自噬的發(fā)生和調(diào)控的相關(guān)機制。

鐵死亡的不同誘導劑（表2）可明顯誘導NCOA4和FTH1的蛋白質(zhì)表達水平下降。如Mancias［5］等利用Deferoxamine處理，通過減少細胞內(nèi)的鐵離子，誘導NCOA4和FTH1蛋白質(zhì)的水平降低。但是NCOA4的缺失抑制了鐵蛋白吞噬作用，增加了鐵蛋白水平，使細胞對Erastin更有抵抗力，但意外地對RSL3更敏感。研究發(fā)現(xiàn)Erastin可促進過表達NCOA4的HeLa細胞中鐵蛋白的結(jié)合作用，增加了游離鐵、脂質(zhì)過氧化和對鐵自噬的敏感性，降低NCOA4和FTH1的表達。相反，RSL3沒有調(diào)節(jié)鐵蛋白吞噬作用，而NCOA4的過量表達反而延遲了RSL3誘導的細胞死亡，這表明RSL3的作用機制與鐵蛋白降解過程是無關(guān)的［26］。因此，在執(zhí)行鐵蛋白吞噬過程中，鐵蛋白-鐵的釋放似乎取決于誘導劑的種類、其目標分子和細胞死亡激活的下游途徑。

表2 鐵死亡的誘導劑Table 2.Summary of the representative inducers of ferroptosis

3.2 FTH1與NCOA4相互結(jié)合 由于鐵自噬的第一步是FTH1和NCOA4的相互結(jié)合（圖2）。檢驗蛋白之間相互作用的常用方法有免疫共沉淀（co-immunoprecipitation， Co-IP）、鄰近連接酶分析（proximity ligation assay， PLA）和pull-down等技術(shù)。如Liu等運用免疫共沉淀技術(shù)，驗證了NCOA4和FTH1相互結(jié)合作用［8］。PLA也是一種較新的檢測細胞或組織中蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)，是通過DNA寡核苷酸探針進行檢測，能放大相互作用信號，具有高度靈敏性。但Duolink-PLA不能用于活細胞，因為抗體和探針需要滲透才能找到靶蛋白。而且一些PLA試劑如酶或DNA寡核苷酸可能破壞細胞的活性。鐵自噬中FTH1和NCOA4的結(jié)合在起始階段，因而處理的反應(yīng)時間很影響實驗的結(jié)果，不一定可以捕獲最好的結(jié)合時間。另一方面，pull-down技術(shù)能夠確定兩種或多種蛋白之間相互作用的檢測方法，首先要利用基因重組技術(shù)構(gòu)建含有親和標簽與誘餌蛋白基因的載體，然后通過表達純化得到帶親和標簽的誘餌蛋白，該誘餌蛋白可固定在某種基質(zhì)上以吸附細胞裂解液中的能與誘餌蛋白互作的蛋白，洗脫后即可得到目的蛋白，對目的蛋白進行檢測可實現(xiàn)誘餌蛋白與目的蛋白相互作用的分析。常見的誘餌蛋白有親和標簽包括谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）標簽、多組氨酸（6×His）標簽進和生物素biotin標簽等。如Li［27］等使用biotin-NCOA4的 pull-down實驗發(fā)現(xiàn) PTBP1參與鐵自噬的過程。

值得注意的是，F(xiàn)TH1和NCOA4結(jié)合后，進行自噬性降解，其蛋白水平逐漸下降。因此在檢驗這兩個蛋白相互作用時，應(yīng)在鐵自噬發(fā)生的早期檢測，否則將會因為蛋白質(zhì)的降解而影響了實驗的結(jié)果。如Li等［7］發(fā)現(xiàn)LPS處理細胞6小時后FTH1的蛋白表達水平開始下降。因此應(yīng)在更早期（6小時前），應(yīng)用co-ip實驗技術(shù)驗證NCOA4和FTH1互作作用。

3.3 溶酶體與FTH1-NCOA4復(fù)合物形成自噬溶酶體 鐵自噬過程中，NCOA4和FTH1結(jié)合后會與溶酶體融合形成自噬溶酶體中，并發(fā)生自噬性降解（圖2），通常使用免疫熒光共定位進行分析。1973年Trump等人通過電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)，溶酶體和自噬小泡中有大量的鐵蛋白顆粒，從而證實了FTH1的降解與溶酶體和自噬小體密不可分［28］。Fang等［29］通過使用溶酶體和FTH1的特異性抗體或熒光標記，驗證FTH1進入溶酶體這一過程。值得注意的是，Joseph［5］等在鐵自噬早期通過免疫熒光共定位分析發(fā)現(xiàn)，NCOA4的降解阻斷了FTH1進入溶酶體，也進一步說明NCOA4結(jié)合FTH1，對其與溶酶體融合的重要性。因此，也可通過敲低/除細胞內(nèi)的NCOA4或FTH1，以反向驗證鐵自噬的發(fā)生。但當溶酶體發(fā)生溶解后，溶酶體膜破碎后，溶酶體標志物溶酶體相關(guān)膜 蛋白2（lysosomal-associated membrane protein 2，LAMP2）或者溶酶體的熒光探針Lyso-Tracker則較難結(jié)合到溶酶體膜上或者隨著被降解消失；因此，驗證溶酶體與FTH-NCOA4復(fù)合物形成自噬溶酶體的過程，需精確控制反應(yīng)時間點?；蛘邔TH1用熒光蛋白GFP標記，同時使用溶酶體的熒光探針Lyso-Tracker，通過時差熒光顯微鏡，采用時間間隔（如15 s）不斷拍攝，捕獲熒光圖像進行融合，即可動態(tài)觀察FTH1-NCOA4進入溶酶體這一過程。

3.4 自噬相關(guān)蛋白檢測 檢測自噬相關(guān)蛋白的動態(tài)變化，有助于確認鐵自噬途徑是否被激活以及激活程度。Mancias完整提取自噬小體并采用質(zhì)譜法鑒定出NCOA4為最富集的蛋白質(zhì)，通過與NCOA4共定位確定了其他自噬標記物如LC3在鐵自噬中的重要作用［5］。研究表明除了LC3，自噬相關(guān)基因Atg5、Atg 7和p62在鐵自噬中都扮演重要角色。

LC3被認為是細胞自噬信號通路最為關(guān)鍵的標志性蛋白。利用Western blot檢測LC3-II/ I的比值的變化以評價自噬形成的水平。或者利用mCherry-EGFP-LC3雙熒光指示系統(tǒng)，Lenti-mCherry-EGFPLC3-II慢病毒感染細胞后，在非自噬的條件下，熒光顯微鏡下mCherry-EGFP-LC3-II以彌散的黃色熒光（mCherry和EGFP的綜合效果）形式存在于細胞質(zhì)中；而發(fā)生自噬時，熒光顯微鏡下mCherry-EGFPLC3-II則聚集在自噬體膜上，以黃色斑點的形式表現(xiàn)出來（LC3-II dot or punctae）；當自噬體與溶酶體融合后，溶酶體內(nèi)的酸性環(huán)境會導致EGFP熒光淬滅而最終以紅色斑點的形式表現(xiàn)出來。因此，可以通過LC3雙熒光指示系統(tǒng)監(jiān)測自噬流的發(fā)生。另外，GFP-LC3單熒光系統(tǒng)也可以與NCOA4或FTH1免疫熒光共定位，從而直接證明鐵自噬的發(fā)生。

除了LC3外，其他自噬基因如ATG5、ATG7和p62的表達量變化也可以用于監(jiān)測自噬流。因此，通過qPCR和Western blot檢測相關(guān)自噬基因的表達量也可評價自噬水平。

3.5 胞內(nèi)鐵離子（Fe2+和 Fe3+）檢測 FTH1發(fā)生自噬性降解后釋放出Fe2+，因此檢測鐵離子的變化是鐵自噬的關(guān)鍵指標。目前檢測鐵離子最常用的實驗手段之一是熒光探針法，熒光探針能夠與游離鐵進行結(jié)合形成配合物，并且在特定波長下發(fā)出熒光信號，從而檢測細胞中鐵含量。例如FerroOrange是一種特異性檢測不穩(wěn)定的Fe2+的熒光探針。一旦與Fe2+反應(yīng)后，不可逆的生成一種橙色熒光產(chǎn)物（Absmax=542 nm，F(xiàn)Lmax=572 nm）。Fe3+或其它除鐵離子以外的二價金屬離子都不會使其熒光增強。FerroOrange也不會與鐵蛋白和其它物質(zhì)中的螯合鐵反應(yīng)。FerroOrange具強細胞膜滲透性和低細胞毒性，非常適用于活細胞成像。Gao等［30］利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)機制設(shè)計出一款對細胞內(nèi)Fe3+可視化的熒光探針RhoNox-1和FRET iron probe 1。除了熒光探針外，如原 子吸 收光譜 法（atomic absorption spectroscopy，AAS）及電感耦合等離子法（inductively coupled plasma mass spectrometry， ICP-MS）也能夠檢測鐵離子。AAS是一種分析鐵離子含量的常用方法，利用特定波長的光輻射原子，使其處于激發(fā)態(tài)，然后測量其吸收的光強度。由于每種元素的原子具有特定的能級結(jié)構(gòu)和光譜特性，因此可以通過測量光強度來確定樣品中鐵元素的濃度。ICP-MS技術(shù)是將樣品原子化，并使其離子化后，采用質(zhì)譜進行檢測，是目前應(yīng)用于量化細胞內(nèi)或生物體內(nèi)總鐵含量最為準確的技術(shù)之一，高精度和高靈敏是該方法的優(yōu)點，但這種方法也存在一些檢測局限性，如樣品需要進行復(fù)雜的前處理、設(shè)備和操作成本相對較高，需要專業(yè)的技術(shù)人員來操作和維護設(shè)備。目前這一技術(shù)也被應(yīng)用在鐵死亡的相關(guān)研究中，該技術(shù)具有靈敏度高、準確性高、適用性廣及穩(wěn)定性好的特點，但在檢測鐵自噬中鐵離子變化時，二價鐵和三價鐵可能會發(fā)生相互轉(zhuǎn)化，這可能會影響它們在原子吸收光譜中的吸收峰的位置和峰高度，可以通過分離鐵蛋白的方式來檢測游離鐵離子的含量。

3.6 鐵自噬相關(guān)基因檢測 發(fā)生鐵自噬時會涉及相關(guān)基因表達的變化，這些基因的產(chǎn)物參與調(diào)控鐵自噬的發(fā)生，因此檢測這些基因的表達變化也是確定細胞是否發(fā)生鐵自噬的方法之一?？梢酝ㄟ^熒光定量PCR檢測鐵自噬相關(guān)基因的表達變化，同時可以進一步利用Western blot檢測驗證這些基因?qū)?yīng)的蛋白表達水平。利用GeneCards數(shù)據(jù)庫圖（https：//www.genecards.org/），通過輸入“ferritinophagy”關(guān)鍵字，數(shù)據(jù)庫自動從125個數(shù)據(jù)庫獲取數(shù)據(jù)，整合出20個鐵自噬相關(guān)基因（表3）。同時我們通過實驗室優(yōu)化和整理，獲得了這20個基因所對應(yīng)的引物序列信息（表4），并使用GENEMANIA （http：//genemania.org/）在線分析工具，展示了這20個基因之間的相互作用網(wǎng)路關(guān)系圖（圖3）。

表3 鐵自噬相關(guān)基因的名稱和ID列表Table 3.List of ferritinophagy-related genes with gene symbol and ID

表4 鐵自噬相關(guān)基因的正向引物和反向引物列表Table 4.List of ferritinophagy-related genes with forward and reverse primers sequences

Figure 3.Gene-gene interaction analysis for the ferritinophagy using the GENEMANIA database.圖3 通過GENEMANIA數(shù)據(jù)庫對鐵自噬相關(guān)基因間的相互作用分析

4 結(jié)語

鐵死亡作為一種新的死亡方式，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而自噬作為一種大分子或細胞器的降解過程，在病理情況下也會導致細胞的死亡［31］。雖然越來越多研究證實鐵死亡的發(fā)生伴隨著自噬的激活，但鐵死亡的發(fā)生并不是總依賴于自噬，可獨立于自噬的激活而存在。鐵死亡與自噬的關(guān)系目前仍未明確，其內(nèi)在聯(lián)系更為復(fù)雜，需要研究者們更多的研究與探索。

鐵自噬調(diào)控機制和相關(guān)分子的研究正在迅速發(fā)展，涉及到許多復(fù)雜的調(diào)節(jié)過程。本綜述針對目前關(guān)于鐵自噬及其不同發(fā)生階段的檢測方法進行了歸納與總結(jié)。在實驗中檢測NCOA4和FTH1的結(jié)合，以及結(jié)合后發(fā)生的自噬性降解是驗證鐵自噬的關(guān)鍵。目前NCOA4是已知唯一鐵自噬受體，介導FTH1進入溶酶體，融合成自噬溶酶體。Goodwin等［32］報道了一種與NCOA4不同的鐵蛋白降解途徑，該途徑需要FIP200、ATG9A/VPS34和TAX1BP1的參與。因此后續(xù)可利用蛋白質(zhì)免疫沉淀的方法來探究是否有存在除NCOA4以外的其他蛋白質(zhì)能夠與FTH1結(jié)合。使用特異性抗FTH1或NCOA4抗體將FTH1或NCOA4蛋白沉淀下來，再通過質(zhì)譜檢測分析與FTH1或NCOA4共沉淀的其它蛋白質(zhì)，這可以促進鐵自噬相關(guān)分子機制的深入研究。針對鐵自噬的研究方法和策略仍需不斷優(yōu)化和改進。例如鐵蛋白進入溶酶體的動態(tài)過程，很難用抗體檢測到動態(tài)變化。因此需要將Lenti-EGFP-FTH1以及LentimCherry-NCOA4融合蛋白的慢病毒，感染細胞或組織后進行鐵自噬檢測，同時使用溶酶體的熒光探針Lyso-Tracker Deep Red以更好地動態(tài)觀察NCOA4和FTH1結(jié)合后進入溶酶體的過程。

目前針對鐵自噬的研究方法主要是基于細胞水平研究，迄今為止，鐵自噬在體內(nèi)尚無辦法可以實現(xiàn)測量。Howard［33］等研發(fā)了一種自噬檢測納米顆粒，能夠?qū)ψ允蛇M行成像并在體內(nèi)非侵入性地測量其通量。這些納米顆粒具有近紅外熒光色素Cy5.5的功能。通過靜脈注射，可以使用磁共振或近紅外熒光成像技術(shù)測量體內(nèi)自噬體的通量。打破了自噬檢測僅限于細胞水平的局限性，實現(xiàn)體內(nèi)檢測自噬程度，將有助于更好地了解自噬在各種疾病狀態(tài)中的作用。因此需要研發(fā)新的技術(shù)和方法，以深入地了解鐵自噬在疾病治療中的潛在作用。

本綜述主要介紹了鐵自噬研究過程中較為常見的檢測方法；在實際應(yīng)用中，應(yīng)針對不同的實驗設(shè)計選擇合適的實驗方法，需結(jié)合不同的檢測手段來分析鐵自噬的過程，將有助于更準確地分析鐵自噬的發(fā)生并深入探討其機制。隨著科學研究的不斷進步與發(fā)展，我們期待未來能有更多實驗技術(shù)和新型實驗設(shè)備對鐵自噬研究有更新的突破，為后續(xù)開展鐵自噬在各類疾病在的發(fā)生發(fā)展提供便捷有利的技術(shù)支持。